CN104666324B - 一种禽流感病毒h7n9神经氨酸酶抑制剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于天然活性物质中的抗病毒药物技术领域，具体涉及一种黄芩苷具有抑制禽流感病毒H7N9神经氨酸酶活性的用途。本发明中的黄芩苷具有抑制禽流感病毒H7N9神经氨酸酶的活性。研究表明，黄芩苷具有明显的抑制野生型及耐奥司他韦的禽流感病毒H7N9神经氨酸酶的活性，具有抗禽流感病毒药物的用途。所述的病毒神经氨酸酶为在CHO‑K1细胞中重组表达的野生型及奥司他韦耐药的禽流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神经氨酸酶。研究结果表明，黄芩苷具有制备抗禽流感病毒H7N9药物的用途。

Description

一种禽流感病毒H7N9神经氨酸酶抑制剂的用途
技术领域：
本发明属于生物化学中的抗病毒药物技术领域，具体涉及一种黄芩苷具有抑制禽流感病毒H7N9神经氨酸酶的用途。
背景技术：
H7N9亚型禽流感病毒是甲型流感病毒中的一种，可以引起的一种禽类烈性传染病，属于正黏病毒科，RNA病毒。研究揭示H7N9病毒可能来自于欧亚大陆迁徙至东南亚地区的野鸟所携带的禽流感病毒与中国上海、浙江、江苏等地的鸭群和鸡群所携带的禽流感病毒发生的基因重组。流感病毒的神经氨酸酶(NA)，是一种有酶活性的表面糖蛋白，在所有A，B型流感病毒中均高度保守。
常用的流感病毒神经氨酸酶抑制剂(扎那米韦、奥司他韦等)能够同时抑制A型和B型流感病毒，在流感的预防和治疗中发挥了重要作用。但扎那米韦和奥司他韦在临床上的使用有一定的局限性，如扎那米韦的口服利用度低，体内分布容积小，肾脏清除快，只能作为局部用药。奥司他韦(商品名达菲)作为抗流感特效药，经受了禽流感和甲型H1N1流感的双重考验，但由于价格较高，难以在发展中国家推广，同时临床上大量耐药病毒株的出现也已被报道。
黄芩苷是黄芩中提取的多酚羟基黄酮类中药单体，是黄芩的主要活性成分之一。现代科学研究结果证明黄芩苷有抑菌、抗炎、抗氧化作用，还具有抗病毒、抗肿瘤等作用。黄芩苷的抗病毒谱较广，资源丰富，在黄芩中含量超过9％，易于提取分离，是一种具开发潜力的抗病毒药物资源。
发明内容
本发明中的黄芩苷具有抑制禽流感病毒H7N9神经氨酸酶的活性。研究表明，黄芩苷具有明显的抑制野生型及耐奥司他韦的禽流感病毒H7N9神经氨酸酶的活性，具有抗禽流感病毒药物的用途。所述的病毒神经氨酸酶为在CHO-K1细胞中重组表达的野生型及奥司他韦耐药的禽流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神经氨酸酶。
黄芩苷具有制备抗禽流感病毒H7N9药物的用途。
附图说明
图1是质粒pCDNA3.1(+)-N9的双酶切验证
图2是质粒pCDNA3.1(+)-N9表达的RT-PCR验证
图3是N9的活性验证
图4是质粒pCDNA3.1(+)-N9-R294K的双酶切验证
图5是质粒pCDNA3.1(+)-N9-R294K表达的RT-PCR验证
图6是N9-R294K的活性验证
图7是黄芩苷对N9活性的抑制作用
图8是黄芩苷对N9-R294K活性的抑制作用
具体实施方式
实施例1
流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神经氨酸酶的表达
从数据库GISAID(Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data)中获得流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神经氨酸酶的基因序列(序列号：EPI439509)，对其进行密码子优化，使其适合在CHO-K1细胞内高水平表达。该基因序列由人工合成，命名为N9，通过Hind III和Xho I酶切，酶切产物连接到用相同酶切的pcDNA 3.1(+)质粒中，连接产物转化到TOP10感受态细胞后，涂布Amp icillin抗性平板培养14～18h，挑取单个菌落，该菌落经过摇瓶培养扩增后后提取质粒酶切鉴定后，并对克隆的神经氨酸酶基因进行测序。重组质粒经双酶切鉴定后在CHO-K1细胞中表达，并建立稳定细胞株。
稳定细胞株的建立：使用lipofectamine 2000将重组质粒pCDNA3.1(+)-N9及空载体pcDNA3.1(+)分别转染到CHO-K1细胞中，48h后将细胞按1∶12传代并加入200μg/ml G418进行克隆筛选。每3天换液，维持相同浓度的G418，直至单个稳定细胞克隆形成，然后挑取单克隆。阳性克隆扩大培养冻存，并抽提重组细胞总RNA进行反转录，以反转率产物为模板，设计基因N9的上下游引物进行PCR，将得到的PCR产物进行凝胶电泳鉴定。
神经氨酸酶的表达：24孔板中每孔接种稳定细胞株1×105个细胞，培养48h后用抽提细胞总RNA，进行RT-PCR检测N9基因mRNA的表达。
神经氨酸酶活性的鉴定：24孔板中每孔接种1×105个稳定细胞，培养48h后收取细胞，每孔用100μl通用蛋白裂解抽提试剂裂解细胞。同时制备流感病毒A/FM/1/47(H1N1)，A/Beijing/32/92(H3N2)鸡胚培养的尿囊培养液。实验使用96孔黑板，每孔先加35μl MES缓冲液，加入30μl重组表达的流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神经氨酸酶液，再加入10μl的不同浓度的黄芩苷，置于37℃孵育5min，避光操作每孔加入25μl的神经氨酸酶特异性荧光底物MUNANA，置于37℃孵育20min，最后每孔加入100μl加入终止液150μl(14mmol/l的NaOH溶液，含83％的乙醇)，用荧光酶标仪于激发波长360nm发射波长440nm处测定荧光。计算黄芩苷对于神经氨酸酶活性的抑制率。实验同时设置不加药的空白对照组。神经氨酸酶酶活抑制率＝(空白对照组的荧光值-加药组的荧光值)/空白组的荧光值×100％，IC50定义为神经氨酸酶酶活下降50％时黄芩苷的浓度。以流感病毒A/FM/1/47(H1N1)及A/Beijing/32/92(H3N2)鸡胚培养的尿囊培养液为阳性对照。
结果见附图1，2，3，图1表明，提取重组质粒pCDNA3.1(+)-N9，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到了大小为4.1kb的质粒。用限制性内切酶Hind III和Xho I对质粒pCDNA3.1(+)-N9进行双酶切，得到了1395bp的基因片段，将其进行测序，测序结果与基因N9序列完全相符，说明重组质粒pCDNA3.1(+)-N9构建成功。图2表明，将重组细胞进行RT-PCR检测，得到大小为1395bp的基因片段，将其进行测序，测序结果与基因N9序列完全相符，说明目的基因N9的mRNA在CHO-K1细胞中进行了转录。图3表明，通过MUNANA荧光底物法测得N9及阳性对照H1N1，H3N1的荧光强度均值分别为33864，41220，59778，表明N9具有神经氨酸酶活性。
实施例2
突变流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神经氨酸酶的表达
在流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神经氨酸酶基因序列中的294位精氨酸突变为赖氨酸，将该基因命名为N9-R294K。构建重组表达质粒pCDNA3.1(+)-N9-R294K，并构建稳定细胞株，制备重组神经氨酸酶N9-R294K。方法同上。
结果见附图4，5，6，图4表明，提取重组质粒pCDNA3.1(+)-N9-R294K，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到了大小为4.1kb的质粒。用限制性内切酶Hind III和Xho I对质粒pCDNA3.1(+)-N9-R294K进行双酶切，得到了1395bp的基因片段，将其进行测序，测序结果与基因N9-R294K序列完全相符，说明重组质粒pCDNA3.1(+)-N9-R294K构建成功。图5表明，将重组细胞进行RT-PCR检测，得到大小为1395bp的基因片段，将其进行测序，测序结果与基因N9-R294K序列完全相符，说明目的基因N9-R294K的mRNA在CHO-K1细胞中进行了转录。图6表明，通过MUNANA荧光底物法测得N9-R294K及阳性对照H1N1，H3N2的荧光强度均值分别为15196，41220，59778，表明N9-R294K具有神经氨酸酶活性，其神经氨酸酶活性比N9有所降低。
实施例3
黄芩苷对N9神经氨酸酶活性的抑制作用
实验使用96孔黑板，黄芩苷用PBS溶解并倍比稀释至500、250、125、62.5μM。每孔先加35μl MES缓冲液，加入30μl重组表达的流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神经氨酸酶液，再加入10μl的不同浓度的黄芩苷，置于37℃孵育5min，避光操作每孔加入25μl的神经氨酸酶特异性荧光底物MUNANA，置于37℃孵育20min，最后每孔加入100μl的终止液150μl(14mmol/1的NaOH溶液，含83％的乙醇)，用荧光酶标仪于激发波长360nm发射波长440nm处测定荧光。计算黄芩苷对于神经氨酸酶活性的抑制率。实验同时设置不加药的空白对照组。神经氨酸酶酶活抑制率＝(空白对照组的荧光值-加药组的荧光值)/空白组的荧光值×100％，IC50定义为神经氨酸酶酶活下降50％时黄芩苷的浓度。以奥司他韦羧酸盐和扎那米韦作为阳性对照药。
实验结果见附图7，图7表明，黄芩苷对N9的神经氨酸酶活性均有明显的剂量依赖的抑制作用，随着黄芩苷浓度升高，神经氨酸酶活性下降越明显。黄芩苷对N9的IC50是211.8μM，证明了黄芩苷是一种流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神经氨酸酶的有效抑制剂。黄芩苷对N9及流感病毒H1N1及H3N2的神经氨酸酶的IC50值如表1所示。
表1 药物对各流感病毒神经氨酸酶活性抑制作用的IC50值
实施例4
黄芩苷对N9-R294K神经氨酸酶活性的抑制作用
采用MUNANA荧光底物法测定黄芩苷对突变H7N9神经氨酸酶的抑制作用。方法同上。
实验结果见附图8，图8表明，奥司他韦和扎那米韦对N9-R294K的IC50值＞200000nM，为其对N9的IC50值的62500倍以上。而扎那米韦对N9-R294K的IC50为117.2nM，为其对N9的IC50值的42倍。证明N9-R294K均对奥司他韦和扎那米韦耐药，并且对奥司他韦的耐药程度大于扎那米韦。而黄芩苷对N9-R294K的IC50值为218.8μM，与其对N9的IC50值无明显差异，由此可知黄芩苷能有效抑制N9-R294K的神经氨酸活性，证明了黄芩苷是一种对耐奥司他韦的流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神经氨酸酶的有效抑制剂。黄芩苷对N9-R294K及流感病毒H1N1的IC50值如表2所示.
表2 药物对各流感病毒神经氨酸酶活性抑制作用的IC50值

Claims (1)

1.黄芩苷在制备一种对奥司他韦耐药的禽流感病毒H7N9神经氨酸酶抑制剂药物中的用途。
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