CN104655594A - 一种基于纳米材料光热效应的细胞检测方法及其装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于纳米材料光热效应的细胞检测方法及其装置，检测步骤如下：(1)将待检测细胞溶液离心，弃上清，PBS复溶后再离心；重复操作，弃上清，用10μL PBS缓冲液将离心沉淀溶解；(2)将处理好的细胞样品滴加到渗滤试纸条上加样区内，PBST溶液冲洗三次；(3)再向渗滤试纸条的加样区内加入5-20μL石墨烯-金-抗体复合物，PBST溶液冲洗三次并晾干；(4)用激发波长为808nm的激光照射检测装置的加样区10～90s，记录照射前后的温度，计算温度差，以细胞数为横坐标，温度差为纵坐标绘制标准曲线；对某一样品，可通过测定样品的温度差，代入标准曲线，计算细胞数。本发明的检测装置及方法具有检测方法简单、检测时间短、检测灵敏度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于纳米材料光热效应的细胞检测方法及其装置。
背景技术
目前用于细胞检测的方法有多种，例如免疫细胞化学法、PCR技术、电化学法及微流控装置等。尽管这些方法灵敏度较高，并广泛应用于实验室检测及医院临床诊断，但多数方法需要先进的仪器设备及复杂的操作过程、耗时耗力，不适用于快速检测。因此，简单、快速的检测方法仍需进一步研究。
试纸条检测方法是一种方便、快捷的检测方法，包括免疫层析及免疫渗滤两种操作模式。该方法虽然简单、快速，但其灵敏度相比其它方法仍然偏低。近年来，研究者从诸多方面致力于提高试纸条检测的灵敏度。吴伟等利用胶体金层析技术检测人类胚胎干细胞，通过裸眼观测可以检测到10000个干细胞，而采用读卡器可以将检出限降低至7000个干细胞，该方法特异性高并且可在20min内完成。刘国栋等人利用免疫胶体金层析及适配体技术检测肿瘤细胞，结果显示，裸眼直接观测的检出限为4000个细胞，使用便携式电子读卡器可以将检出限降低至800个细胞。但其检测灵敏度仍需进一步提高。
乳腺癌是目前最常见的女性恶性肿瘤疾病，也是世界上引起高死亡率的癌症之一。快速识别检测乳腺癌肿瘤细胞有助于乳腺癌的诊断。但目前由于受限于细胞的检测方法，往往因诊断不及时而错过了乳腺癌最佳的治疗时间。因此，提供一种使用方法简单，能够用于乳腺癌肿瘤细胞检测的试纸条具有较高应用价值。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于纳米材料光热效应的细胞检测方法及其装置。
本发明的另一目的是提供该检测装置在乳腺癌肿瘤细胞检测中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于纳米材料光热效应的细胞检测的装置，由石墨烯-金-抗体复合物、渗滤试纸条和检测设备组成；
所述石墨烯-金-抗体复合物由石墨烯-金纳米材料和抗体按(0.5～2)mL：(0.1～1)μg的比例混合，室温振摇反应4～8h，4℃过夜保存，4℃10000r离心30min，弃上清，用储存液将沉淀复溶，即得石墨烯-金-抗体复合物；其中，石墨烯-金纳米材料和抗体加入量的比例关系是纳米复合物的形成的关键影响因素，低于上述比例范围，则会造成制备的纳米材料上的抗体量太少，高于上述比例范围，则会产生聚沉，按(0.5～2)mL石墨烯-金纳米材料：(0.1～1)μg抗体进行混合，则能形成良好的纳米复合物，上述比例范围的选择是通过无数次的实验，不断的分析摸索才得到的，并非能通过有限次的实验就能得到。
所述石墨烯-金纳米材料的制备方法为：将HAuCl4水溶液加热至沸腾，保持煮沸1min后，剧烈搅拌下迅速加入柠檬酸钠，持续搅拌，至溶液变为红褐色时，加入氧化石墨烯，至溶液变为红色，待颜色保持不变后继续煮沸并搅拌10～15min，停止加热，冷却，加入聚乙二醇。离心，除去多余的石墨烯及聚乙二醇，沉淀物用双蒸水复溶，使溶液体积与离心前体积相同，即得石墨烯-金纳米材料。
其中，所述HAuCl4水溶液为将1mL质量分数为0.1％的HAuCl4水溶液，用双蒸水稀释定容至100mL；所述柠檬酸三钠为质量分数为1％的柠檬酸三钠溶液，加入量为3.5mL；氧化石墨烯溶液的加入量为7mg。
所述储存液是由0.7628g/L的硼酸钠(Na2B4O7)、1.0g/L的叠氮钠(NaN3)、1.0g/L的牛血清白蛋白(BSA)组成；
复溶用储存液的加入量为原石墨烯-金纳米材料和抗体混合液体积的1/10。
所述渗滤试纸条的制备方法为：将抗体用包被液稀释，抗体与包被液的加入量的比为1μg：4-6μL，将用包被液稀释后的抗体滴加到硝酸纤维素膜的加样区内，包被，然后加入封闭液，于37℃干燥箱中封闭30min，PBST溶液冲洗三次并晾干，即得渗滤试纸条；
所述包被液为含有1～10％(v/v，单位mL/mL)甲醇的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)；
所述封闭液为含0.1～0.5％(v/v，单位mL/mL)吐温20与1～5％(m/v，单位g/mL)BSA的0.01mol/L的PBS缓冲液；
所述PBST溶液为含有0.1～1％(v/v，单位mL/mL)吐温20的0.01mol/L磷酸盐溶液；
其中，包被液、封闭液的组成能够影响检测的灵敏度，本发明研究证明，采用含有1～10％(v/v)甲醇的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)作为包被液，采用含0.1～0.5％(v/v)吐温20与1～5％(m/v)BSA的0.01mol/L的PBS缓冲液作为封闭液，能够有效的降低背景，提高检测的灵敏度。采用含有0.1～1％(v/v，单位mL/mL)吐温20的0.01mol/L磷酸盐溶液(即PBST溶液)进行冲洗，其效果较好，能有效的降低背景。
优选的，所述包被液为含有6％(v/v)甲醇的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)；
优选的，所述封闭液为含0.2％(v/v)吐温20与2％(m/v)BSA的0.01mol/L的PBS缓冲液；
优选的，所述冲洗液为含有0.4％(v/v)吐温20的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBST缓冲液)；
所述包被的条件为：37℃干燥箱中包被2h或室温过夜包被；
所述检测设备包括激光笔和温度测定装置；其中，所述激光笔为近红外激光笔，所述温度测定装置为红外测温枪。
采用该装置进行细胞检测的方法，步骤如下：
(1)细胞预处理：将待检测细胞溶液置入EP管内，1500r/min离心5min，弃上清，0.01mol/L的PBS复溶后再离心；重复三次上述操作，弃上清，用10μL 0.01mol/L的PBS缓冲液将离心沉淀溶解后待用；
(2)将步骤(1)处理好的细胞样品滴加到渗滤试纸条上加样区内，PBST溶液冲洗三次；
(3)再向渗滤试纸条的加样区内加入石墨烯-金-抗体复合物，PBST溶液冲洗三次并晾干；
(4)用激发波长为808nm的激光照射检测装置的加样区10～90s，在此范围内可产生较高的温度变化，有利于提高灵敏度，超过此范围容易损坏试纸条，记录照射前后的温度，计算温度差，以细胞数为横坐标，温度差为纵坐标绘制标准曲线；对某一样品，可通过测定样品的温度差，代入标准曲线，计算细胞数。
步骤(2)中样品的加入量和步骤(3)中石墨烯-金-抗体复合物加入量的比为10μL：5-20μL；石墨烯-金-抗体复合物的加入量会影响检测的结果，高于此范围，细胞结合的石墨烯-金-抗体复合物会超过饱和值，造成不必要的浪费，低于此范围，结合到细胞上的石墨烯-金-抗体复合物数量减少，会降低灵敏度。
本发明的基于纳米材料光热效应的细胞检测的装置可用于不同种类细胞的检测，用于不同细胞检测时，制备石墨烯-金-抗体复合物加入的抗体不同，所加入的抗体应与被检测细胞特异性结合。
本发明的检测原理是基于待检测细胞与加样区包被的能够与待检测细胞特异性结合的抗体结合后，由于包被的抗体与石墨烯-金纳米材料标记所用的抗体来自不同的动物免疫，因此与待检测细胞的结合位点不同。加入石墨烯-金-抗体复合物后，复合物上的抗体也会与待检测细胞结合，从而形成抗体-细胞-抗体的夹心结构。被捕获的待检测细胞数目越多，结合在加样区的石墨烯-金-抗体复合物就越多，鉴于石墨烯-金纳米材料的光热效应，加样区在808nm的激光照射下升温也就越高。以细胞数为横坐标，温度差为纵坐标绘制标准曲线，针对特定样品，通过测定样品的温度差，代入标准曲线，从而计算得到待检物中的细胞数。
本发明的有益效果：
(1)本发明的基于纳米材料光热效应的检测装置及其检测方法能够适用于多种细胞的检测，适用范围广；
(2)本发明的检测方法简单，无需复杂的操作步骤，检测时间短，通过激光照射和温度测定，能够实现快速检测；
(3)本发明的检测灵敏度较高，本发明系首次将石墨烯的光热效应引入试纸条检测方法中，使检测灵敏度得以提高，并通过将石墨烯与纳米金复合以降低检测背景，进一步提高了细胞检测的灵敏度，采用本发明的检测方法其检出限为600个细胞，与现有技术中同类型的检测方法的检测限(800个细胞)相比，检测限的标准提高了25％。
附图说明
图1为本发明的MCF-7细胞检测装置的制备及检测流程示意图；
图2本发明实施例2绘制的标准曲线。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：基于纳米材料光热效应的MCF-7细胞检测装置的制备
1.石墨烯-金纳米材料的制备
取1mL质量分数为0.1％的HAuCl4水溶液，用双蒸水稀释定容至100mL后，转移到250mL圆底烧瓶中，加热直至溶液沸腾。保持煮沸1min后，剧烈搅拌下迅速加入3.5mL质量分数为1％的柠檬酸三钠，持续搅拌，至溶液变为红褐色时，加入7mg氧化石墨烯溶液直至溶液变为红色，待颜色保持不变后继续煮沸并搅拌15min，停止加热，使溶液自然冷却。取一定量的上述溶液置于10mL EP管中，加入2％(m/v，单位g/mL)聚乙二醇，211KHz超声1h，8000r离心10min除去多余的石墨烯及聚乙二醇，沉淀物用双蒸水复溶，使溶液体积与离心前体积相同，即得石墨烯-金纳米材料。
2.石墨烯-金-抗体复合物的制备：取1mL石墨烯-金纳米材料，1mL 0.6μg/mL抗EpCAM抗体，混合，室温振摇反应6h，4℃过夜保存。4℃10000r离心30min，弃上清，储存液复溶沉淀，即得石墨烯-金-抗体复合物。
3.渗滤试纸条的制备：
(1)包被
将1μg抗EpCAM抗体用包被液稀释，滴加到硝酸纤维素膜加样区内，37℃干燥箱中包被2h；包被液为含有6％(v/v，单位mL/mL)甲醇的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)。
(2)封闭
加入15μL封闭液并于37℃干燥箱中封闭30min。PBST溶液洗涤三次并晾干；封闭液为含0.2％(v/v，单位mL/mL)吐温20与2％(m/v，单位g/mL)BSA的0.01mol/L的PBS缓冲液。PBST溶液为含有0.4％(v/v，单位mL/mL)吐温20的0.01mol/L磷酸盐溶液。
实施例2：
MCF-7细胞检测的方法，步骤为：
1.细胞预处理：取适量的待检测细胞溶液置入1.5mL的EP管内，1500r离心5min，弃上清，0.01mol/L的PBS复溶后再离心。重复三次上述操作，弃上清，用10μL 0.01mol/L的PBS缓冲液将离心沉淀溶解后待用；
2.加样：将处理好的MCF-7细胞溶液滴加到实施例1制备的渗滤试纸条上加样区内，渗入后，PBST溶液洗涤三次；
3.加入10μL实施例1制备的石墨烯-金-抗EpCAM抗体复合物，渗入后，PBST溶液冲洗三次并晾干；
4.光热测定：808nm激光照射加样区60s，红外测温枪记录前后温度并计算温度差；
5.标准曲线的绘制：取经过计数的含有不同细胞数(0，600，800，1000，1200，1400，1600个细胞)的细胞培养液，经过上述细胞预处理、加样、加入石墨烯-金-抗EpCAM抗体复合物步骤后，用808nm激光照射硝酸纤维素膜上的加样区60s，红外测温枪记录加样区照射前后的温度，计算照射前后温度差并扣除空白对照组的温度差，即得各细胞数所对应的温度差。以细胞数为横坐标，温度差为纵坐标绘制标准曲线，结果见图2，并拟合线性回归方程，结果为y＝4.7×10-4x-0.025。
6.取已知细胞数的MCF-7细胞溶液进行检测，根据样品在808nm激光照射前后的温度差，对照标准曲线，计算出待测MCF-7细胞溶液中的细胞数，回收率为86.2％。
实施例3：基于纳米材料光热效应的人小细胞肺癌细胞检测装置的制备
制备方法同实施例1，不同之处在于，石墨烯-金-抗体复合物的制备过程中加入的抗体为2F1抗体。
采用该装置进行人小细胞肺癌细胞检测的方法同实施例2，取已知细胞数的人小细胞肺癌细胞溶液进行检测，计算出待测人小细胞肺癌细胞溶液中的细胞数，回收率为85.7％。
Claims (10)
1.一种基于纳米材料光热效应的细胞检测方法，其特征在于，步骤如下：
(1)细胞预处理：将待检测细胞溶液离心，弃上清，0.01mol/L的PBS复溶后再离心；重复三次上述操作，弃上清，用10μL 0.01mol/L的PBS缓冲液将离心沉淀溶解后待用；
(2)将步骤(1)处理好的细胞样品滴加到渗滤试纸条上加样区内，PBST溶液冲洗三次；
(3)再向渗滤试纸条的加样区内加入5-20μL石墨烯-金-抗体复合物，PBST溶液冲洗三次并晾干；
(4)用激发波长为808nm的激光照射检测装置的加样区10～90s，记录照射前后的温度，计算温度差，以细胞数为横坐标，温度差为纵坐标绘制标准曲线；对某一样品，可通过测定样品的温度差，代入标准曲线，计算细胞数。
2.如权利要求1所述的一种基于纳米材料光热效应的细胞检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述石墨烯-金-抗体复合物的制备方法为：石墨烯-金纳米材料和抗体按(0.5～2)mL：(0.1～1)μg的比例混合，室温振摇反应4～8h，过夜保存，离心，弃上清，用储存液将沉淀复溶，即得石墨烯-金-抗体复合物。
3.如权利要求2所述的一种基于纳米材料光热效应的细胞检测方法，其特征在于，所述石墨烯-金纳米材料的制备方法为：将HAuCl4水溶液加热至沸腾，保持煮沸1min后，剧烈搅拌下迅速加入柠檬酸钠，持续搅拌，至溶液变为红褐色时，加入氧化石墨烯，至溶液变为红色，待颜色保持不变后继续煮沸并搅拌10～15min，停止加热，冷却，加入聚乙二醇，离心，除去多余的石墨烯及聚乙二醇，沉淀物用双蒸水复溶，即得石墨烯-金纳米材料。
4.如权利要求1所述的一种基于纳米材料光热效应的细胞检测方法，其特征在于，所述渗滤试纸条的制备方法为：将抗体用包被液稀释，抗体与包被液的加入量的比为1μg：4-6μL，将由包被液稀释后的抗体滴加到硝酸纤维素膜的加样区内，包被，然后加入封闭液，于37℃封闭30min，PBST溶液冲洗并晾干，即得渗滤试纸条。
5.如权利要求4所述的一种基于纳米材料光热效应的细胞检测方法，其特征在于，所述包被液为含有1～10％甲醇的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液；包被的条件为：37℃干燥箱中包被2h或室温包被过夜。
6.如权利要求4所述的一种基于纳米材料光热效应的细胞检测方法，其特征在于，所述封闭液为含0.1～0.5％吐温20与1～5％BSA的0.01mol/L的PBS缓冲液。
7.一种基于纳米材料光热效应的细胞检测装置，其特征在于，由石墨烯-金-抗体复合物、渗滤试纸条和检测设备组成；
所述石墨烯-金-抗体复合物由石墨烯-金纳米材料和抗体按(0.5～2)mL：(0.1～1)μg的比例混合，室温振摇反应4～8h，过夜保存，离心，弃上清，用储存液将沉淀复溶，即得石墨烯-金-抗体复合物；所述储存液是由0.7628g/L的硼酸钠、1.0g/L的叠氮钠、1.0g/L的牛血清白蛋白组成，复溶用储存液的加入量为原石墨烯-金纳米材料和抗体混合液体积的1/10；
所述渗滤试纸条的制备方法为：将抗体用包被液稀释，抗体与包被液的加入量的比为1μg：4-6μL，将由包被液稀释后的抗体滴加到硝酸纤维素膜的加样区内，包被，然后加入封闭液，于37℃封闭30min，PBST溶液冲洗并晾干，即得渗滤试纸条；
所述检测设备包括激光笔和红外测温枪。
8.根据权利要求7所述的细胞检测的装置，其特征在于，所述石墨烯-金纳米材料的制备方法为：将HAuCl4水溶液加热至沸腾，保持煮沸1min后，剧烈搅拌下迅速加入柠檬酸钠，持续搅拌，至溶液变为红褐色时，加入氧化石墨烯，至溶液变为红色，待颜色保持不变后继续煮沸并搅拌10～15min，停止加热，冷却，加入聚乙二醇，离心，除去多余的石墨烯及聚乙二醇，沉淀物用双蒸水复溶，即得石墨烯-金纳米材料。
9.根据权利要求7所述的细胞检测的装置，其特征在于，所述渗滤试纸条的制备方法中，所述包被液为含有1～10％甲醇的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液；包被的条件为：37℃干燥箱中包被2h或室温包被过夜；
所述封闭液为含0.1～0.5％吐温20与1～5％BSA的0.01mol/L的PBS缓冲液。
10.根据权利要求7所述的细胞检测的装置，其特征在于，所述PBST溶液为含有0.1～1％吐温20的0.01mol/L磷酸盐溶液。
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