CN104651515B - 一种构建茶树dna指纹图谱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种构建茶树DNA指纹图谱的方法，属于茶叶分子生物技术领域。该方法采用ISSR分子标记技术和二维码技术构建茶树DNA指纹图谱，将指纹图谱信息通过二维码技术处理，转化成二维码图形。通过该方法构建茶树DNA指纹图谱以二维码图形的形式体现，具有信息容量大、直观、简洁、应用性广的特点。在构建茶树DNA指纹图谱过程中进行通过二维码技术处理，将大量的指纹图谱信息，转化成二维码图形。构建的DNA指纹图谱既能正确反应该茶树样本的DNA指纹图谱信息，又能在茶叶的市场流通、栽培管理等领域进一步推广利用，并且应用于可追溯体系建设和管理。
Description
技术领域
本发明涉及一种构建茶树DNA指纹图谱的方法，属于茶叶分子生物技术领域。
背景技术
茶树（Camellia sinensis（L.）O.Kuntze）属山茶科山茶属茶亚属茶种植物，起源于我国西南地区，经长期的引种、传播，我国茶树生长区域从N 18°30′-35°13′，E94°-122°，南至热带边缘，北至暖温带。我国是茶树的主要原产地，至今已有3000多年的人工栽培历史，经过几千年的人工或自然育种，形成了非常丰富的茶树种质资源。目前，在国家茶树种质资源圃已保存近4000份茶树种质，各省、区地方茶树种质资源圃也保存大量茶树种质。此外，在我国广阔的茶山林海中还有很多未被收集保存的茶树新种质，其中不乏一些优异珍稀茶树新种质，这些资源中有许多优异种质未能被合理有效的利用。因此，将这些种质资源按照亲缘关系、种质品种特性、指纹图谱差异等进行有效分类和鉴定，对茶树种质资源的研究、品种的创新尤为重要。目前，分子生物技术的快速发展，DNA分子标记技术日渐成熟，已广泛用于于多种农作物。
DNA分子标记以决定生物遗传特性的基因组DNA为研究对象，一定程度代表生物的遗传特性，且种质的性状变化与其息息相关。DNA分子标记技术具有、准确、稳定性强、多态性高、好等优势，能满足品种快速准确鉴定和标准指纹图谱构建的要求。目前，DNA分子标记技术已广泛用于生物体的遗传多样性分析、DNA指纹图谱构建、亲缘关系鉴定、品种鉴定、新品种选育等方面。而DNA指纹图谱技术能反映核苷酸序列的差异，检测出个体间的差异，鉴定特定的基因型，能够迅速、准确地鉴别不同的种质，应用较广泛。
DNA指纹图谱是指DNA样品用特定分子标记技术处理显示出具有特定DNA片段的总称。DNA指纹图谱技术最早用于在刑侦或亲子鉴定上确定人的身份，而后随着生物技术的进步与发展，DNA指纹图谱技术在很多植物上得到广泛的应用。目前，常用于构建DNA 指纹图谱的分子标记有SSR、AFLP、SRAP、SCoT、RAPD、SNP以及ISSR。不同分子标记构建的DNA指纹图谱各有其特点。其中，以ISSR、SSR、SRAP应用最广泛，RAPD作为早期分子标记，也有一定的应用。SNP、SCoT标记作为第三代分子标记，目前应用不广泛，技术不够成熟，且与其他2种标记相比，技术难度较高，以该技术为主构建DNA指纹图谱的应用较少。而SRAP分子标记，实验时间较长，实验操作较为繁琐，且所用试剂毒副作用较大，对实验人员影响较大。ISSR是当前能够用于大批量种质资源的遗传多样性分析和DNA指纹图谱构建最理想的一种分子标记。应用ISSR分子标记构建DNA指纹图谱，在不同植物上都能取得很好的效果。具有引物用量少、特征标记多、有效信息量大的优点。
目前， DNA指纹图谱的在茶树上的研究不多，以ISSR分子标记技术和二维码技术构建茶树DNA指纹图谱的研究未见报道。
发明内容
本发明在于提供一种构建茶树DNA指纹图谱的方法，通过该方法构建茶树DNA指纹图谱以二维码图形的形式体现，具有信息容量大、直观、简洁、应用性广的特点。
本发明采用ISSR分子标记技术和二维码技术构建茶树DNA指纹图谱，将指纹图谱信息通过二维码技术处理，转化成二维码图形。
具体实施如下：
采用改良CTAB法提取供试茶树品种的总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和纯度，并将DNA样本稀释至100 ng/uL，利用优化后的ISSR反应体系和筛选的引物对茶树DNA样本进行PCR扩增。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离ISSR分子标记，拍摄电泳图片。根据ISSR图谱条带的有无，对PCR扩增产物进行统计分析，将电泳图谱转换成“0-1”形式的原始字符串。利用二维码技术处理原始字符串，通过在一个矩形空间通过黑、白像素在矩阵中的不同分布进行编码，将原始字符串转化成为二维码图形。
所述对PCR扩增产物进行统计分析，是根据ISSR图谱条带的有无，利用人工方法统计读带，将电泳图上稳定出现的条带，无论强弱均赋值为“1”，同一位置无条带赋值为“0”，输入读带数据，建立原始字符串。
优化后的ISSR反应体系为：在20μL体系中，Ex-Buffer用1×Ex-Buffer，1U/µL Ex-Taq酶，0.2mM/µL dNTPs，0.5mM/µL ISSR引物，2ng/µL DNA模板。筛选的引物如SEQ IDNO.1-12所示。
构建的茶树DNA指纹图谱可通过图象输入设备或光电扫描设备自动识读以实现信息自动处理，通过扫描二维码图形便可知该茶树品种的指纹信息，从而鉴别不同的茶树品种。
本发明的优点在于：
在构建茶树DNA指纹图谱过程中进行通过二维码技术处理，将大量的指纹图谱信息，转化成二维码图形。构建的DNA指纹图谱既能正确反应该茶树样本的DNA指纹图谱信息，又能在茶叶的市场流通、栽培管理等领域进一步推广利用，并且应用于可追溯体系建设和管理。
附图说明
图1为以表一所示12条引物对黄金桂进行ISSR-PCR扩增，对其扩增产物进行统计分析，形成原始指纹信息字符串，并以其原始指纹信息字符串构建的DNA指纹图谱。
图2为以引物UBC834对48份不同武夷山地方茶树种质进行ISSR-PCR扩增所得的琼脂糖凝胶电泳图谱。
具体实施方式
实施例1
1、茶树总DNA提取
利用改良后的CTAB法提取供试茶树总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，通过微量核酸测定仪检测供试DNA样本在260 nm、280 nm的吸光值，260/280比值，260/230比值，以及样品浓度值，选择纯度好、浓度高的DNA样本稀释至100 ng/uL。
2、ISSR反应体系优化及引物筛选
采用单因子分析的方法，分别在特定的反应体系和扩展程序下以初始的反应体系为基础，做不同参数梯度的比较分析，对PCR反应的DNA模板使用量、反应引物浓度、Ex-Tag酶用量、dNTP浓度、Ex-Buffer浓度、引物退火温度以及反应引物等各参数逐一进行筛选调整，优化建立ISSR反应体系。优化后的ISSR-PCR反应体系为：在20μL体系中，Ex-Buffer用1×Ex-Buffer，1U/µL Ex-Taq酶，0.2mM/µL dNTPs，0.5mM/µL ISSR引物，2ng/µL DNA模板能较好的进行ISSR-PCR扩增。利用上述体系筛选出条带清晰，多态性好的引物，引物序列信息及退火温度（Tm）如表1所示。优化后的ISSR反应体系和筛选的引物可同时扩增山茶科山茶属茶种植物。
表1 筛选出的12条引物
注： R = (A , G) ,Y = (C , T)
3、ISSR-PCR扩增
利用优化后的ISSR反应体系和筛选的12条引物分别对48份不同武夷山地方茶树DNA样本进行PCR扩增。PCR扩增程序为94℃ 300s，94℃ 60s，Tm（退火温度） 30s，72℃120s，39个循环，72℃ 600s，4℃保存备用。
4、扩增结果电泳分析
将步骤3中得到的扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，分离ISSR分子标记的扩增片段，并拍摄电泳图片，附图2为引物UBC834的扩增结果。
5、PCR扩增产物的统计分析
根据ISSR图谱条带的有无，电泳图谱中的每一条带( DNA片段)均作为一个分子标记，代表了该物种基因与引物互补的一对结合位点。利用人工方法统计读带，将电泳图上稳定出现的带无论强弱均赋值为“1”，同一位置无带赋值为“0”，将表1中12条引物的扩增结果读带数据输入Excel表格，建立原始指纹信息字符串。字符串是一列包含12条引物指纹信息的“0-1”二进制数字字符串。如黄金桂的原始指纹信息字符串：10110100000100000100011110101001100001110101100000110000010101011100000000000000001110100101001111111111001100101010110100000011111111100010000000011101110010000000110。
6、构建茶树DNA指纹图谱
利用二维码技术处理原始指纹信息字符串，通过在一个矩形空间通过黑、白像素在矩阵中的不同分布进行编码。在矩阵元素位置上，出现方点、圆点或其他形状点表示二进制“1”，不出现点表示二进制的“0”，点的排列组合确定了矩阵式二维码所包含的指纹图谱信息。将原始指纹信息字符串转化成为二维码图形即该茶树的DNA指纹图谱，构建的茶树DNA指纹图谱可通过图象输入设备或光电扫描设备自动识读以实现信息自动处理，通过二维码图形的比对可鉴别不同的茶树品种。
<110> 福建农林大学
<120> 一种构建茶树DNA指纹图谱的方法
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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acttccccac aggttaacac a 21
Claims (3)
1.一种构建茶树DNA指纹图谱的方法，其特征在于：采用ISSR分子标记技术和二维码技术构建茶树DNA指纹图谱，将指纹图谱信息通过二维码技术处理，转化成二维码图形，所述方法具体实施如下：
采用改良CTAB法提取供试茶树品种的总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和纯度，并将DNA样本稀释至100 ng/μL，利用优化后的ISSR反应体系和筛选的引物对茶树DNA样本进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离ISSR 分子标记，拍摄电泳图片；根据ISSR 图谱条带的有无，对PCR 扩增产物进行统计分析，将电泳图谱转换成“0-1”形式的原始字符串，利用二维码技术处理原始字符串，将原始字符串转化成为二维码图形；
所述的筛选的引物如SEQ ID NO.1-12 所示。
2.根据权利要求1所述的构建茶树DNA指纹图谱的方法，其特征在于：所述对PCR 扩增产物进行统计分析，是根据ISSR 图谱条带的有无，利用人工方法统计读带，将电泳图上稳定出现的条带，无论强弱均赋值为“1”，同一位置无条带赋值为“0”， 输入读带数据，建立原始字符串。
3.根据权利要求1所述的构建茶树DNA 指纹图谱的方法，其特征在于：优化后的ISSR反应体系为：在20 μL体系中，Ex-Buffer 用1×Ex-Buffer，1U/μL Ex-Taq 酶，0.2 mM/μLdNTPs，0.5 mM/μL ISSR 引物，2ng/μL DNA 模板。
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