一种人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种人羧酸酯酶CES2(Carboxylesterase2)的高特异性荧光探针及其应用。
背景技术
羧酸酯酶(Carboxylesterase,CES)是机体内重要的一相水解代谢酶,催化多种内源性和外源性化合物发生酯键断裂,释放出极性的醇和羧酸分子片段,后者进而被体内CYP450或UGTs等其他代谢酶继续催化代谢,使药物分子更有效地被排出体外。多种结构中含有酯键的药物分子,如盐酸伊立替康(irinotecan,CPT-11)、奥司他韦(达菲)、氯吡格雷等均被羧酸酯酶催化进行活化或代谢消除。
人体内介导药物代谢的羧酸酯酶主要分布在2个家族:CES1和CES2,其中CES1又可继续被分为CES1b和CES1c两种亚型。CES1和CES2具有不同的组织分布特异性及底物选择性,人的肝脏中主要分布表达CES1,同时表达一定量的CES2,而小肠中则基本以CES2亚型为主,只有极少量的CES1分布。近年来发现多种肿瘤细胞中CES2的表达水平上调,可借助此特征设计经CES2特异性水解的抗肿瘤前体药物实现靶向选择性杀伤肿瘤细胞的目的。此外,多数口服前药需先经过肠道才能被吸收进入血液循环,因此肠道中CES2酶对酯类药物的代谢被认为是其首过代谢的重要组成部分,CES2酶活的差异对于前体药物的生物利用度具有十分重要的影响。此外,有些经静脉给药的前体药物,如盐酸伊立替康,会经过胆汁***被分 泌到肠道中,继而被肠道中的CES2催化水解释放出毒性代谢产物SN-38,后者被认为是导致伊立替康迟发型腹泻副作用的主要原因。因而,建立基于探针的高通量技术手段,对于筛选CES2的高效抑制剂并将其应用于减缓伊立替康导致的迟发型腹泻,以及对CES2功能的定量检测都十分重要。
本发明提供了一类3-羟基黄酮酯类衍生物及其作为CES2酶荧光探针底物的应用,其经羧酸酯酶CES2水解后可生成荧光发射波谱不同于原型的水解产物。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人羧酸酯酶CES2(Carboxylesterase2,CES2)的特异性荧光探针底物及其应用,该底物原型和水解产物的荧光发射波长具有明显差异,且产物更易检测。利用该探针反应可对多种生物体系中CES2的分布和功能进行定量评价。
本发明提供了一种人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针底物,该底物的酯键可被CES2特异性水解为相应水解产物并显示与底物不同的发射波谱;
该底物是以3-羟基黄酮类化合物为原料,通过酯化反应获得相应3-羟基酯类衍生物,其结构通式如式(1)所示,其中,R为苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对己基丙基、对硝基苯基、对氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基、(4-苯基)苯基、4-乙氧基苯基取代基中的一种。
如当R为4-乙基苯基时,该底物为3-羟基黄酮酯类衍生物。
本发明还提供了所述人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针底物的应用,该底物作为CES2的特异性底物,可利用其水解反应活性,通过定量检测单位时间内水解产物的生成量来测定不同酶源中CES2的活性;具体测定方法为:
——体系中以3-羟基黄酮酯类衍生物作为特异性探针底物;底物浓度选择1/10~10Km;单点测定时底物浓度优选Km。
——在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液中,反应温度为20℃至60℃之间,优选37℃为最优反应时间;孵育体系pH介于5.5~10.5之间,优选pH7.4为最优反应pH值;
——反应时间为5~120分钟,在确保以上底物相应的水解产物达到定量限且底物转化率不超过20%时终止反应;
——测定单位时间内水解产物生成量作为羧酸酯酶CES2活性的评价指标。
本发明提供的人羧酸酯酶2的高特异性荧光探针底物的应用,所述酶源为重组表达的CES2单酶、人或动物组织制备液、或各类组织细胞生物样品。
本发明提供的人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针底物的应用,所述 底物消除率或水解产物的生成率应介于0.1%~20%之间。
本发明提供的人羧酸酯酶CES2的高特异性荧光探针底物的应用,探针底物及其水解产物均具有荧光属性,可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测;荧光检测条件为:激发波长308nm,在380~560nm进行荧光发射谱的检测。此外,该特异性探针底物及相应CES2活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰,可用于各种生物体系中CES2酶活的定量测定。
该特异性探针反应可用于重组羧酸酯酶、人及动物组织制备液及各类组织细胞中CES2酶活的定量测定,还可用于快速筛选CES2酶的抑制剂及抑制能力的定量评价。
采用重组羧酸酯酶CES2单酶,肝微粒体孵育体系进行考察,通过相关性分析,特异性抑制实验,重组单酶代谢反应,以及酶反应动力学等多方面的证据,证明3-羟基黄酮酯类衍生物可特异性的经羧酸酯酶CES2代谢(如图5-图8所示),生成相应的水解产物。
作为高特异性的羧酸酯酶CES2的荧光探针底物,该化合物可以用来检测羧酸酯酶CES2的活性,尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的羧酸酯酶CES2重组酶的酶活测定,以及多种哺乳动物组织器官来源的组织微粒体、S-9等制备物中CES2的活性标定。
选用本发明所述羧酸酯酶CES2的特异性探针底物检测羧酸酯酶CES2酶体外活性具有以下突出优势:
(1)高特异性:3-羟基黄酮酯类衍生物可被羧酸酯酶CES2高特异性地代谢成一个代谢产物,即3位酯键断裂的水解产物。
(2)廉价易得:3-羟基黄酮酯类衍生物及其水解产物均可经化学合成获得,合成工艺简单易行。
(3)高灵敏度:具有3-羟基母核结构的化合物均具有良好的荧光发射光谱特性(380~560nm),该底物及其水解代谢产物具有不同的荧光发射光谱特征,能较好的进行区分检测,同时可经比率法通过绘制标准曲线进行定量测定。
附图说明
图1.3-羟基黄酮酯类衍生物的结构通式;
图2.3-羟基黄酮酯类衍生物的合成路线图;
图3.3-羟基黄酮4-乙基苯甲酰酯的1H-NMR谱图;
图4.3-羟基黄酮4-氯苯甲酰酯的1H-NMR谱图;
图5.3-羟基黄酮4-甲基苯甲酰酯的1H-NMR谱图;
图6.3-羟基黄酮4-丙基苯甲酰酯的1H-NMR谱图;
图7.3-羟基黄酮4-硝基苯甲酰酯的1H-NMR谱图;
图8.3-羟基黄酮4-乙基苯甲酰酯的人重组单酶筛选试验结果;
图9.3-羟基黄酮4-氯苯甲酰酯的人重组单酶筛选试验结果;
图10.3-羟基黄酮4-甲基苯甲酰酯的人重组单酶筛选试验结果;
图11.3-羟基黄酮4-丙基苯甲酰酯的人重组单酶筛选试验结果;
图12.3-羟基黄酮4-硝基苯甲酰酯的人重组单酶筛选试验结果;
图13.3-羟基黄酮4-乙基苯甲酰酯被CES2催化水解的代谢通路;
图14.3-羟基黄酮4-乙基苯甲酰酯随CES2蛋白浓度增大的荧光谱图;
图15.3-羟基黄酮4-乙基苯甲酰酯水解产物生成量与孵育时间的线性 拟合;
图16.体外定量测定重组单酶中CES2和人小肠微粒体中CES2酶活
图17.定量测定人肺腺癌A549细胞中CES2的活性
图18.中药提取液对CES2抑制活性筛选。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明,但并不因此而限制本发明。
实施例13-羟基黄酮4-乙基苯甲酰酯的化学合成
(1)向10mL含有0.5mmol的3-羟基黄酮和0.625mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中,缓慢滴加0.6mmol的对乙基苯甲酰氯(溶于5mL的四氢呋喃中),控制温度在0℃;
(2)冰浴搅拌1h后,溶液至室温,搅拌过夜;
(3)反应液经过减压除去溶剂,残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化,采用乙酸乙酯-正己烷(1:3v/v)进行洗脱,得155mg白色固体粉末状纯品。δ(1H-NMR,400MHz,CDCl3):8.29(1H,dd),8.15-8.09(2H,m),7.98-7.90(2H,m),7.73(1H,ddd),7.59(1H,dd),7.50-7.42(4H,m),7.32(2H,d),2.74(2H,q),1.35-1.22(3H,m).(合成路线图见图2)(氢谱图见图3)。
实施例23-羟基黄酮4-氯苯甲酰酯的化学合成
(1)向10mL含有0.5mmol的3-羟基黄酮和0.625mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中,缓慢滴加0.6mmol的对氯苯甲酰氯(溶于5mL的四氢呋喃中),控制温度在0℃;
(2)冰浴搅拌1h后,溶液至室温,搅拌过夜;
(3)反应液经过减压除去溶剂,残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化,采用乙酸乙酯-正己烷(1:3v/v)进行洗脱,得152mg白色固体粉末状纯品。δ(1H-NMR,400MHz,CDCl3):8.29(1H,dd),8.13(2H,m),7.92-.89(2H,m),7.77-7.72(1H,ddd),7.60(1H,dd),7.49-7.46(6H,m).(合成路线图见图2)(氢谱图见图4)。
实施例33-羟基黄酮4-甲基苯甲酰酯的化学合成
(1)向10mL含有0.5mmol的3-羟基黄酮和0.625mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中,缓慢滴加0.6mmol的对甲基苯甲酰氯(溶于5mL的四氢呋喃中),控制温度在0℃;
(2)冰浴搅拌1h后,溶液至室温,搅拌过夜;
(3)反应液经过减压除去溶剂,残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化,采用乙酸乙酯-正己烷(1:3v/v)进行洗脱,得151mg白色固体粉末状纯品。δ(1H-NMR,400MHz,CDCl3):8.30(1H,dd),8.10-8.12(2H,m),7.96-7.94(2H,m),7.75(1H,ddd),7.61(1H,dd),7.50-7.44(4H,m),7.31(2H,d),2.46(2H,s).(合成路线图见图2)(氢谱图见图5)。
实施例43-羟基黄酮4-丙基苯甲酰酯的化学合成
(1)向10mL含有0.5mmol的3-羟基黄酮和0.625mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中,缓慢滴加0.6mmol的对丙基苯甲酰氯(溶于5mL的四氢呋喃中),控制温度在0℃;
(2)冰浴搅拌1h后,溶液至室温,搅拌过夜;
(3)反应液经过减压除去溶剂,残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化,采用乙酸乙酯-正己烷(1:3v/v)进行洗脱,得158mg白色固体粉末状纯 品。δ(1H-NMR,400MHz,CDCl3):8.29(1H,dd),8.12-8.10(2H,m),7.95-7.93(2H,m),7.72(1H,ddd),7.59(1H,dd),7.48-7.43(4H,m),7.30(2H,d),1.70-1.68(2H,m),0.98-0.95(3H,t).(合成路线图见图2)(氢谱图见图6)。
实施例53-羟基黄酮4-硝基苯甲酰酯的化学合成
(1)向10mL含有0.5mmol的3-羟基黄酮和0.625mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中,缓慢滴加0.6mmol的对硝基苯甲酰氯(溶于5mL的四氢呋喃中),控制温度在0℃;
(2)冰浴搅拌1h后,溶液至室温,搅拌过夜;
(3)反应液经过减压除去溶剂,残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化,采用乙酸乙酯-正己烷(1:3v/v)进行洗脱,得165mg白色固体粉末状纯品。δ(1H-NMR,400MHz,CDCl3):8.39-9.33(4H,m),8.29(1H,dd),7.89-7.79(2H,m),7.77-7.75(1H,ddd),7.62(1H,dd),7.53-7.46(4H,m).(合成路线图见图2)(氢谱图见图7)。
实施例6重组表达的人单酶中的选择性
(1)预先准备99μl代谢反应体系,包括pH7.4的PBS缓冲液(10mM)、重组表达的人CES2(5μg/ml)/血清白蛋白(500μg/ml)/血浆(1%)/丁酰胆碱酯酶(25U/L)/磷酸缓冲液,于37℃条件下震荡预孵10分钟;
(2)向反应体系中加入1μl终浓度为25μM的3-羟基黄酮-对乙基苯甲酰酯/对氯苯甲酰酯/对甲基苯甲酰酯/对丙基苯甲酰酯/对硝基苯甲酰酯起始反应;
(3)40分钟后,加入100μl冰乙腈,剧烈震荡后,终止反应;
(4)进行荧光检测(Ex=308nm,Em=392,528nm);计算各体系中荧 光强度(见图8-图12)(以3-羟基黄酮4-乙基苯甲酰酯被CES2催化水解的代谢通路为例,见图13;其余合成的酯代谢通路与3-羟基黄酮4-乙基苯甲酰酯代谢通路一致);
实施例7重组单酶中CES2催化线性反应的蛋白浓度
(1)预先准备99μl CES2代谢反应体系,包括pH7.4的PBS缓冲液(10mM)、重组人CES2(0-100ug/ml),于37℃条件下震荡预孵10分钟;
(2)向反应体系中加入1μl终浓度为25μM的3-羟基黄酮-对乙基苯甲酰酯起始反应;
(3)40分钟后,加入100μl冰乙腈,剧烈震荡后,终止反应;
(4)进行荧光检测(Ex=308nm,Em=392,528nm);计算重组人CES2酶的线性蛋白浓度(见图14)。
实施例8重组单酶CES2中的线性孵育时间
(1)预先准备99μl CES2代谢反应体系,包括pH7.4的PBS缓冲液(10mM)、重组人CES2(8ug/ml),于37℃条件下震荡预孵10分钟;
(2)向反应体系中加入1μl终浓度为25μM的3-羟基黄酮-对乙基苯甲酰酯起始反应;
(3)每隔0.5分钟进行一次荧光扫描检测(Ex=308nm,Em=392,528nm);计算重组人CES2酶的线性反应时间(见图15)。
实施例9体外定量测定重组单酶中CES2的酶活
(1)预先准备99μl CES2代谢反应体系,包括pH7.4的PBS缓冲液(10mM)、重组人CES2(2ug/ml),于37℃条件下震荡预孵10分钟;
(2)向反应体系中加入1μl终浓度为25μM的3-羟基黄酮-对乙基苯 甲酰酯起始反应;
(3)40分钟后,加入100μl冰乙腈,剧烈震荡后,终止反应;
(4)进行荧光检测(Ex=308nm,Em=392,528nm);计算重组人CES2酶的最大催化速率为407±31nmol/min/mg。(见图16)
实施例10体外定量测定人肠微粒体中CES2的酶活
(1)预先准备99μl人小肠微粒体代谢反应体系,包括pH7.4的Tris-HCl缓冲液(50mM)、人小肠微粒体(20ug/ml),于37℃条件下震荡预孵10分钟;
(2)向反应体系中加入1μl终浓度为25μM的3-羟基黄酮-对乙基苯甲酰酯起始反应;
(3)40分钟后,加入100μl冰乙腈,剧烈震荡后,终止反应;
(4)进行荧光检测(Ex=308nm,Em=392,528nm);计算人小肠中对该探针化合物的最大催化速率为342±23nmol/min/mg。(见图16)
实施例11定量测定人肺腺癌A549细胞中CES2的活性
(1)人肺腺癌A549细胞系培养于盖玻片上,采用的培养基是DMEM培养基(含10%小牛血清)以及100ug/ml的双抗,培养环境为37℃的5%二氧化碳培养箱中。
(2)使用之前,贴壁细胞采用不含血清的DMEM培养基冲洗3次,加入终浓度为10uM的3-羟基黄酮-对乙基苯甲酰酯,于37℃温孵40分钟。
(3)之后,采用PBS缓冲液冲洗3次。在激光共聚焦显微镜下观察细胞,通过荧光分布位置与强度来显示细胞中CES2的分布及其相对含量多少。(见图17)
实施例12体外快速筛选CES2的抑制剂
(1)CES2重组表达单酶(5μg/mL)196μl,于37℃条件下震荡预孵10分钟;
(2)向反应体系中加入2μl中药95%乙醇提取液,继续孵育10分钟;
(3)加入2μl的终浓度为10μM的3-羟基黄酮-对乙基苯甲酰酯起始反应;
(3)40分钟后,加入200μl冰乙腈,剧烈震荡后,终止反应;
(4)进行荧光检测(Ex=308nm,Em=392,528nm);计算荧光强度,根据中药提取液组528nm下的荧光强度与392nm下荧光强度比值与DMSO组的荧光强度比值计算CES2的抑制强度。(见图18) 。