CN104650236A - 一种异源交联物及其在风疹病毒检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种异源交联物,包括由小鼠anti-RV McAb和健康的未感染RV的人IgG所形成的四聚体形式的异源交联抗体,所述抗体可作为一种病人阳性血液中风疹病毒抗体的替代物,经稀释液稀释后,作为替代病人阳性血液的质控品用于免疫检测试剂盒中。所述异源交联物生产制备简单、成本低,同时具有非常好的安全性和稳定性,可有效降低检测误差。
Description
本申请是申请号为201310267573.6、申请日2013年6月28日的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种异源交联物,具体而言就是一种由两种异源的抗体通过交联反应而获得的含有四聚体形式的异源交联抗体的异源交联物,及其在病人阳性血液中风疹病毒抗体替代物上的应用,属于免疫学技术领域。
背景技术
如今,诸如病毒、细菌、真菌和寄生虫之类的病原体给人类带来的威胁越来越大。基于抗原和抗体之间特异性和高灵敏性反应的免疫分析方法,如胶体金免疫层析检测、乳胶免疫层析检测、放射免疫检测(RIA)、酶联免疫吸附检测(ELISA)、时间分辨荧光免疫检测(TRFIA)或化学发光免疫检测(CLIA),已经被广泛地用于临床免疫测试之中。这些免疫分析方法通常被用来定性或定量地检测人血液中的病原体抗原或抗体,从而快速和准确地确定感染是否发生和/或感染所处的阶段。
临床免疫检测试剂盒一般都包括阴性质控品和阳性质控品。这些质控品往往来自抗体效价较高的病人阳性血液的系列稀释品,或者直接使用不同抗体效价的病人阳性血液,包括血清、血浆或全血。但是利用病人阳性血液制备阳性质控品有很多缺点:1)很难获得同时具有高效价和高特异性的病人阳性血液;2)个体之间的抗体效价和特异性差异较大,难以标准化;3)成本比较高,4)有些病原体感染病例稀缺,在短时间内很难获得足够的阳性血液;5)病原体阳性血液具有潜在的传染性,即便经过灭活处理,但仍然难以保证彻底灭活,同时在收集和灭活病人阳性血液时,操作人员也有潜在被感染的风险。为此,人们经常使用替代病人阳性血液的质控品。
欧洲专利申请EP 0 330 902 A2揭示出在检测人血液特异性抗体时,使用一种或多种人单克隆抗体(如人抗风疹病毒单克隆抗体和人抗水痘带状疱疹病毒单克隆抗体)作为测试对照,但是每次构建的人单克隆抗体只包括一种抗体的恒定区,检测其他抗体类型需要重新构建,而且由于在伦理上不允许利用人体进行抗体制备,因而不得不利用噬菌体展示技术和转基因动物等方法来制造人单克隆抗体,这就使得抗体制备比较困难。美国专利US 6,015,662揭示出人鼠嵌合抗体可以用于人血液抗体检测的阳性对照,但是每次构建的人鼠嵌合单克隆抗体只包括一种抗体的恒定区,检测其他抗体类型需要重新构建,而且工艺非常复杂,这是因为除了利用杂交瘤技术获得小鼠单克隆抗体之外,还要进行抗体基因克隆以及人鼠嵌合基因的构建和表达。
目前除上述方法制备抗体外,还出现了利用交联剂制备抗体。已有很多种利用交联剂制备交联抗体的方法。如交联剂琥珀酰亚胺吡啶二巯基丙酯[N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate,SPDP]可被用来将两种不同的蛋白(包括抗体和酶)交联在一起而形成交联物(Carlsson J,Drevin H,and Axén R.Protein thiolation and reversible protein-protein conjugation.N-Succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate,a new heterobifunctional reagent.Biochem.J.,1978,173:723-737)。交联剂苯二马来酰亚胺(O-phenylenedi-maleimide,O-PDM)也被用来将两种抗体的片段交联在一起(Glennie M,McBride H,Worth A,et al..Preparation and performance of bispecific F(ab'gamma)2antibody containingthioether-linked Fab'gamma fragments.J.Immunol.,1987,139:2367-2375)。欧洲专利EP 0 062 227 A1揭示出利用交联剂戊二醛或高碘酸钠将两种不同物种来源的抗体偶联在一起。此外,美国专利US 4,507,234揭示了交联剂二硫代双硝基苯甲酸[5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoicacid),DTNB]可被用来制备交联抗体。美国专利US 4,929,543揭示了交联剂S-乙酰巯基丁二酸酐(S-acetylmercaptosuccinicanhydride,AMSA)和马来酰亚胺己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Maleimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimide ester,MHS)可被用来制备交联抗体。美国专利US 5,478,753揭示了交联剂4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(N-γ-maleimidobutyryloxysuccinimide ester,GMBS)可被用来制备交联抗体。
交联抗体也常被用于制备替代病人阳性血液的质控品。美国专利US4,929,543揭示了非人的抗体或其Fab或F(ab')2片段和人免疫球蛋白或其Fc片段的异源交联物,用于人血清抗体诊断。美国专利US 5,478,753揭示了非人的非IgM和人IgM的异源交联物,用于血清IgM诊断试剂盒,异源交联物中的非人的非IgM可特异性地识别和结合病原体抗原,人IgM可以和标记抗体结合。美国专利US 5,491,218揭示了非人的抗体或其片段和另一种抗体的异源交联物,如人IgM和抗单纯疱疹病毒抗体F(ab')2片段的异源交联物,异源交联物中非人的抗体特异性地结合一种特定的病原体,另一种抗体特异性地结合一种特定的抗体类型。中国专利ZL97109106.4揭示了非人的抗艾滋病病毒抗体或经处理后具有抗体活性的片段和人免疫球蛋白的异源交联物,可用作病人阳性血液中艾滋病病毒抗体的替代物。但是以上这些专利中并没有揭示制备出的异源交联物的具体组成,这就造成了异源交联物不同批次之间质量不稳定,容易产生检测误差,替代性较差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种由两种异源的抗体通过交联反应而获得的异源交联物,所述异源交联物包括由所述两种异源的抗体形成的四聚体形式的异源交联抗体。优选地,所述两种异源的抗体为非人的病原体抗体和健康的未感染病原体的人抗体;优选地,所述四聚体形式的异源交联抗体在所述异源交联物中所占的质量比不小于50%。
本发明的目的在于一种异源交联物在病人阳性血液中病原体抗体替代物上的应用,所述异源交联物是由两种异源的抗体通过交联反应而获得的,所述异源交联物包括由所述两种异源的抗体形成的四聚体形式的异源交联抗体。优选地,所述两种异源的抗体为非人的病原体抗体和健康的未感染病原体的人抗体;优选地,所述四聚体形式的异源交联抗体在所述异源交联物中所占的质量比不小于50%。
本发明的另一个目的在于提供一种替代病人阳性血液的质控品,所述质控品包括稀释液和一种由两种异源的抗体通过交联反应而获得的异源交联物,所述异源交联物包括由所述两种异源的抗体形成的四聚体形式的异源交联抗体,所述稀释液可选自小牛血清或胎牛血清,优选为小牛血清,在所述质控品中,所述异源交联物浓度为5~25μg/ml,优选20μg/ml。优选地,所述两种异源的抗体为非人的病原体抗体和健康的未感染病原体的人抗体;优选地,所述四聚体形式的异源交联抗体在所述异源交联物中所占的质量比不小于50%。
特别地,本发明提供一种替代病人TORCH病原体抗体阳性血液的质控品,其特征在于,所述质控品包括稀释液和一种由非人的TORCH病原体抗体和健康的未感染TORCH病原体的人抗体通过交联反应所获得的异源交联物,所述异源交联物包括由所述非人的TORCH病原体抗体和所述健康的未感染TORCH病原体的人抗体形成的四聚体形式的异源交联抗体,所述稀释液可选自小牛血清或胎牛血清,优选为小牛血清,在所述质控品中,所述异源交联物浓度为5~25μg/ml,优选20μg/ml。优选地,所述四聚体形式的异源交联抗体在所述异源交联物中所占的质量比不小于50%。
与现有技术相比,本发明所获得的有益效果为:
首先,本发明的异源交联物含有四聚体形式的异源交联抗体。所述异源交联物作为病人阳性血液中病原体抗体的替代物,在-20℃和4℃下保存一个月后的稳定性测试中,所述异源交联物都具有非常好的稳定性。
其次,本发明的异源交联物作为病人阳性血液中病原体抗体的替代物,能够很好地替代病人阳性血液中的病原体抗体。
再次,本发明的异源交联物来源于非人的病原体抗体和健康的未感染病原体的人抗体,经稀释液稀释后,可作为替代病人阳性血液的质控品,这种质控品与病人阳性血液的性能相当,又能避免病人阳性血液的潜在感染性,同时这种异源交联物具有生产制备简单和成本低的特点。
并且,本发明的质控品批间差较小,能够有效地降低检测误差。
具体实施方式
本发明利用诸如SPDP、GMBS和DTNB之类的交联剂将两种异源的抗体交联在一起,从而形成包括四聚体形式的异源交联抗体在内的异源交联物。本发明发现当所述异源交联物含有四聚体形式的异源交联抗体时,所述异源交联物可作为病人阳性血液中病原体抗体的替代物,经稀释液稀释后作为替代病人阳性血液的质控品,用于免疫检测,如胶体金免疫层析检测,乳胶免疫层析检测,放射免疫检测、酶联免疫检测、时间分辨荧光免疫检测或化学发光免疫检测,同时具有非常好的灵敏度、特异性和稳定性。所述四聚体形式的异源交联抗体在所述异源交联物中所占的质量比优选为不小于50%。
在每个所述四聚体形式的异源交联抗体分子中,所述两种异源的抗体分子数比为3:1或2:2或1:3。在结构式1中,所述两种异源的抗体分子数比为3:1。在结构式2(a)或2(b)中,所述两种异源的抗体分子数比为2:2。在结构式3中,所述两种异源的抗体分子数比为1:3。在这些结构式中,所述两种异源的抗体分别用Ab1和Ab2表示,L是利用交联剂对所述两种异源的抗体进行交联反应时形成的连接物。
结构式1:
结构式2(a):
结构式2(b):
结构式3:
在这些结构式中,Ab1优选为非人的病原体抗体,例如小鼠抗II型单纯疱疹病毒单克隆抗体、小鼠抗I型单纯疱疹病毒单克隆抗体、小鼠抗风疹病毒单克隆抗体、小鼠抗人巨细胞病毒单克隆抗体、小鼠抗弓形虫单克隆抗体、小鼠抗艾滋病病毒单克隆抗体,小鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体、小鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体、小鼠抗乙型肝炎病毒单克隆抗体、小鼠抗丙型肝炎病毒单克隆抗体、小鼠抗丁型肝炎病毒单克隆抗体、小鼠抗戊型肝炎病毒单克隆抗体、小鼠抗庚型肝炎病毒单克隆抗体或小鼠抗其他病原体单克隆抗体。Ab2优选为一种健康的未感染病原体的人抗体,例如人IgG、IgA、IgD、IgE、IgM抗体单体及其经处理后具有完整Fc片段的抗体片段或者其混合物。L可选自结构式4(a),4(b)或4(c),以及该领域内技术人员已知的其他常用的结构式。
结构式4(a):
结构式4(b):
结构式4(c):
其中,两种异源的抗体优选为一种非人的病原体抗体和一种健康的未感染病原体的人抗体。所述病原体可选自艾滋病病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒、人巨细胞病毒、人T淋巴细胞病毒、西尼罗河病毒;金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、肺炎链球菌;弓形虫、克氏锥虫、***、恶性疟原虫、间日疟原虫。所述非人的病原体抗体是指来自除人类在外的小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猪、绵羊、山羊、马、骡和骆驼等动物的单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体、利用所述病原体抗原免疫动物所获得的抗体及其经处理后具有抗原结合活性的片段或其混合物。
单克隆抗体是指仅由来自动物体内的一种类型的免疫细胞(如B淋巴细胞)制造出来的只与一种抗原表位结合的免疫球蛋白。以最常用的小鼠单克隆抗体为例,用一种病原体抗原免疫小鼠,经过多次免疫后,分离出小鼠脾脏B淋巴细胞,并与小鼠骨髓瘤细胞融合,通过对所产生的杂交瘤细胞进行多次亚克隆筛选就可获得分泌所需单克隆抗体的杂交瘤细胞(G,Milstein C.Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature,1975,256:495-497;Albitar Maher.Monoclonal Antibodies:Methods in Molecular Biology,Vol.378,2007)。接着在体外培养分泌所需单克隆抗体的杂交瘤细胞,收集培养液,或者将杂交瘤细胞注射到同系小鼠的腹腔中,收集腹水,最后利用辛酸-硫酸铵法、饱和硫酸铵盐析沉淀法或亲和层析柱法就可从培养液或腹水中分离出单克隆抗体(Nakazawa M,Mukumoto M,Miyatake K.Immunoelectron Microscopy:Methods in Molecular Biology,2010,657:63-74;E.哈洛,D.莱恩.《抗体技术实验指南》)。
多克隆抗体是指由来自动物体内的多种类型的免疫细胞(如B淋巴细胞)制造出来的可与多种抗原表位结合的免疫球蛋白。以兔多克隆抗体为例,用一种病原体抗原多次免疫兔子,然后收集血清,再利用辛酸-硫酸铵法、饱和硫酸铵盐析沉淀法或亲和层析柱法或离子交换层析法分离出多克隆抗体(Nakazawa M,Mukumoto M,Miyatake K.Immunoelectron Microscopy:Methods in MolecularBiology,2010,657:63-74;E.哈洛,D.莱恩.《抗体技术实验指南》)。
基因工程抗体是指通过基因工程技术改造现有优良的非人动物物种单克隆抗体基因,尽量减少抗体中动物物种来源成分,同时保留原有抗体特异性,从而创造出一种新型抗体,主要包括嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体和单域抗体(Chames,Patrick.Antibody Engineering:Methods in Molecular Biology,Vol.907,2nd ed.2012;Proetzel G,Ebersbach H.Antibody Methods and Protocols:Methods inMolecular Biology,Vol.901,2012;Saerens D,Muyldermans S.Methods inMolecular Biology,Single Domain Antibodies:Methods and Protocols,Vol.911,2012)。
利用病原体抗原免疫动物所获得的抗体是指利用病原体抗原免疫除人类在外的动物所获得的单克隆抗体或多克隆抗体。
对非人的病原体抗体而言,经处理后具有抗原结合活性的片段是指利用病原体抗原免疫除人类在外的动物所获得的单克隆抗体或多克隆抗体以及通过基因工程技术对所获得的单克隆抗体进行改造所获得的基因工程抗体,经过化学手段或酶消化处理所获得的仍然保持抗原结合性质的抗体片段,如单克隆抗体经木瓜蛋白酶消化后所产生的Fab片段,或者经胃蛋白酶消化后产生的F(ab')2,其中F(ab')2再经酶IdeS消化后还可获得Fab'片段。
一种健康的未感染病原体的人抗体是从健康的未感染病原体的人血液(包括血清、血浆或全血)中提取而出的,可选择性地包括IgG、IgA、IgD、IgE、IgM抗体单体及其经处理后具有完整Fc片段的抗体片段或者其混合物。从血液中提取抗体的方法可选自辛酸-硫酸铵法、饱和硫酸铵盐析沉淀法或亲和层析柱法或离子交换层析法分离出单克隆抗体(Nakazawa M,Mukumoto M,Miyatake K.Immunoelectron Microscopy:Methods in Molecular Biology,2010,657:63-74;E.哈洛,D.莱恩.《抗体技术实验指南》)。所述抗体单体是指用于交联反应的人抗体应是单聚体,如果不是单聚体,如人血清中的IgM抗体通常以五聚体形式存在,则应事先经过处理,让它们变成单聚体(Ditzel H,Erb K,et al..Preparation ofantigen-binding monomeric and half-monomeric fragments from human monoclonalIgM antibodies against colorectal cancer-associated antigens.Human Antibodies,1993,4(2):86-93)。
对健康的未感染病原体的人抗体而言,经处理后具有完整Fc片段的抗体片段是指IgG、IgA、IgD、IgE或IgM单体经木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化后所产生的完整Fc片段,或者经过化学手段或酶消化处理所获得的仍然具有完整Fc片段的其他抗体片段。
通过选择合适的非人的病原体抗体,本发明提供一种可替代病人艾滋病病毒、肝炎病毒或TORCH病原体抗体阳性血液的质控品,其中肝炎病毒可选自甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒,TORCH病原体选自I型单纯疱疹病毒(HSV-I)、II型单纯疱疹病毒(HSV-II)、风疹病毒(RV)、人巨细胞病毒(HCMV)和弓形虫(TOXO)。
特别地,本发明提供一种替代病人TORCH病原体抗体阳性血液的质控品,所述质控品包括稀释液和一种由非人的TORCH病原体抗体和健康的未感染TORCH病原体的人抗体通过交联反应所获得的异源交联物,所述异源交联物包括由所述非人的TORCH病原体抗体和所述健康的未感染TORCH病原体的人抗体形成的四聚体形式的异源交联抗体,所述稀释液可选自小牛血清或胎牛血清,优选为小牛血清,在所述质控品中,所述异源交联物浓度为5~25μg/ml,优选20μg/ml。优选地,所述四聚体形式的异源交联抗体在所述异源交联物中所占的质量比不小于50%。
特别地,本发明提供一种替代病人艾滋病病毒抗体阳性血液的质控品,所述质控品包括稀释液和一种由非人的艾滋病病毒抗体和健康的未感染艾滋病病毒的人抗体通过交联反应所获得的异源交联物,所述异源交联物包括由所述非人的艾滋病病毒抗体和所述健康的未感染艾滋病病毒的人抗体形成的四聚体形式的异源交联抗体,所述稀释液可选自小牛血清或胎牛血清,优选为小牛血清,在所述质控品中,所述异源交联物浓度为5~25μg/ml,优选20μg/ml。优选地,所述四聚体形式的异源交联抗体在所述异源交联物中所占的质量比不小于50%。
特别地,本发明提供一种替代病人肝炎病毒抗体阳性血液的质控品,所述质控品包括稀释液和一种由非人的肝炎病毒抗体和健康的未感染肝炎病毒的人抗体通过交联反应所获得的异源交联物,所述异源交联物包括由所述非人的肝炎病毒抗体和所述健康的未感染肝炎病毒的人抗体形成的四聚体形式的异源交联抗体,所述稀释液可选自小牛血清或胎牛血清,优选为小牛血清,在所述质控品中,所述异源交联物浓度为5~25μg/ml,优选20μg/ml。优选地,所述四聚体形式的异源交联抗体在所述异源交联物中所占的质量比不小于50%。
此外,根据本领域的技术人员所知,通过选择合适的非人的病原体抗体,本发明提供一种替代病人其他病原体抗体阳性血液的质控品。
当本发明的异源交联物用于免疫检测时,通常还需加入一种起稀释作用的稀释液,利用所述稀释液将所述异源交联物的浓度稀释至为5~25μg/ml,这样就制备出替代病人阳性血液的质控品,其中所述稀释液可选自小牛血清或胎牛血清,优选为小牛血清。
优选地,本发明所述异源交联物在-20℃下保存在一种冻存液中,所述冻存液包括稳定剂,甘油,防腐剂。其中所述稳定剂选自BSA或明胶,优选浓度为1%;所述甘油,优选为50%甘油;所述防腐剂选自叠氮钠或硫柳汞,优选浓度为0.01%。在所述冻存液中,所述异源交联物终浓度为2~5mg/ml,优选为4mg/ml。
当让两种异源的抗体发生交联反应时,可选择很多交联剂,如SPDP、O-PDM、DTNB、AMSA、MHS或GMBS,以及本领域技术人员所知的其他交联剂。本发明利用交联剂SPDP和还原剂二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT),制备出小鼠抗II型单纯疱疹病毒单克隆抗体(anti-HSV-II McAb)和健康的未感染HSV-II的人IgG的异源交联物、小鼠抗I型单纯疱疹病毒单克隆抗体(anti-HSV-IMcAb)和健康的未感染HSV-I的人IgG的异源交联物、小鼠抗风疹病毒单克隆抗体(anti-RV McAb)和健康的未感染RV的人IgG的异源交联物、小鼠抗人巨细胞病毒单克隆抗体(anti-HCMV McAb)和健康的未感染HCMV的人IgG的异源交联物以及小鼠抗弓形虫单克隆抗体(anti-TOXO McAb)和健康的未感染TOXO的人IgG的异源交联物。类似地,利用SPDP交联剂和DTT也可制备其他的非人的病原体抗体与健康的未感染病原体的人抗体之间的异源交联物。
实施例1
利用SPDP交联剂(购买自Thermo Scientific公司,产品编号21857)制备小鼠anti-HSV-II McAb和健康的未感染HSV-II的人IgG的异源交联物作为病人阳性血液中HSV-II抗体替代物,过程如下:
(1)将5mg小鼠anti-HSV-II McAb溶解于交联缓冲液(0.1M磷酸钾,0.1MNaCl,pH7.5)中,搅拌加入50μl SPDP交联剂(3.2mg/ml,溶解于无水乙醇中),室温下反应2个小时后,装入透析袋,用还原缓冲液(0.1M乙酸钠,0.1M NaCl,pH4.5)透析,换液四次;
(2)将5mg健康的未感染HSV-II的人IgG溶解于交联缓冲液中,搅拌加入50μl SPDP交联剂,室温下反应2个小时后,装入透析袋,用交联缓冲液透析,换液四次;
(3)在(1)中加入30μl DTT(1M,溶解于0.01M乙酸钠溶液,pH5.2),室温反应30分钟后,装入透析袋,用交联缓冲液透析,换液四次;
(4)将(2)、(3)中的处理物混合,在4℃下反应15个小时;
(5)往(4)中加入0.4mg碘乙酰胺封闭剂,反应30分钟以封闭未反应的活性基团,然后装入透析袋,用交联缓冲液透析,换液四次;
(6)将(5)中的产物装载到HiLoad 16/60Superdex 200PG凝胶过滤柱(购买自GE Healthcare)中,以交联缓冲液进行洗脱,并利用HD-3紫光分析仪实时检测洗脱产物在280nm波长时的吸光值,同时用XWT-S小型记录仪绘制层析图谱,按峰收集洗脱产物;
(7)获得含有四聚体形式的异源交联抗体的异源交联物,作为病人阳性血液中HSV-II抗体的替代物。其中每个四聚体形式的异源交联抗体分子是指利用SPDP和DTT将3个小鼠anti-HSV-II McAb分子与1个健康的未感染HSV-II的人IgG分子,或者2个小鼠anti-HSV-II McAb分子与2个健康的未感染HSV-II的人IgG分子,或者1个小鼠anti-HSV-II McAb分子与3个健康的未感染HSV-II的人IgG分子交联在一起所形成的。在所形成的每个四聚体形式的异源交联抗体分子中,对应于结构式1、2和3的Ab1是小鼠anti-HSV-II McAb,Ab2为健康的未感染HSV-II的人IgG,L为结构式4(a)所示,即
实施例2 小鼠anti-HSV-II McAb和健康的未感染HSV-II的人IgG的异源交联物替代性、质控品稳定性和冻存稳定性实验
将实施例1中制备出的小鼠anti-HSV-II McAb和健康的未感染HSV-II的人IgG的异源交联物作为病人阳性血液中HSV-II抗体的替代物,开展实验。
(一)制备质控品。依次配制出四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比在50%、70%、90%和100%时的异源交联物作为病人阳性血液中HSV-II抗体的替代物。当四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比为50%、70%或90%时,剩余50%、30%或10%的异源交联物包括由小鼠anti-HSV-II McAb和人IgG形成的二聚体形式的异源交联抗体和/或三聚体形式的异源交联抗体,但不包括未发生交联的小鼠anti-HSV-IIMcAb和健康的未感染HSV-II的人IgG。利用实施例1中的交联缓冲液进行稀释,使这些异源交联物的初始浓度均为0.5mg/ml,并利用小牛血清进行20倍稀释至25μg/ml,就制备出替代病人HSV-II抗体阳性血液的质控品。
(二)利用间接ELISA法进行检测,具体过程如下:
(1)包被:用包被缓冲液(将1.59g碳酸钠、2.93g碳酸氢钠溶解于1000ml双蒸水,同时将pH调至9.6,配置成包被缓冲液)稀释II型单纯疱疹病毒抗原,使得抗原浓度为1μg/ml;加入100μl稀释后的抗原溶液到酶标板各孔中,并用塑料薄膜盖住酶标板,在4℃过夜,次日,弃去孔内溶液;加入200μl洗涤溶液(将0.5ml Tween 20加入到1000ml包被缓冲液中)洗涤酶标板,重复3次;
(2)封闭:加入200μl封闭溶液(1g BSA溶解于100ml洗涤溶液中)到酶标板孔中,并用塑料薄膜盖住酶标板,在37℃孵育2小时后,弃去孔内溶液;加入200μl洗涤溶液洗涤酶标板,重复3次;
(3)加入质控品:依次往酶标板上不同的孔中加入(一)中制备出的质控品100μl以及病人阳性血液标准品100μl,其中每种质控品应重复加入一次,即加到两个相邻的孔中,每孔均为100μl,并用塑料薄膜盖住酶标板,在37℃孵育30分钟后,弃去孔内溶液,加入200μl洗涤溶液洗涤酶标板,重复5次;
(4)加入酶标二抗:加入酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG)工作液100μl到酶标板的各孔中,并用塑料薄膜盖住酶标板,在37℃孵育30分钟后,弃去孔内溶液,加入200μl洗涤溶液洗涤酶标板,重复5次;
(5)检测:加入显色液A(含柠檬酸35.8g/L,Na2HPO4·12H209.34g/L,30%H2O2660μl)和显色液B(含3,3,5,5-四甲基联苯胺0.2g/L,二甲基亚砜5ml/L,6NHCl 1ml/L)各50μl,并用塑料薄膜盖住酶标板,在37℃孵育10分钟后,加入终止溶液(2N H2SO4)50μl,用酶标仪读取450nm和630nm波长时的吸光度值(A450/A630),并进行校正,即A450值减去A630值(OD450-630)。实验结果如表1所示。
病人阳性血液标准品是指对收集的病人阳性血清经过多重筛选,把含有干扰性物质的血清剔除,从而避免出现假阳性,主要用于评价实验结果的有效性、稳定性和可比性。
若要使所制备出的质控品能够替代病人HSV-II抗体阳性血液,业内推荐标准:在相同条件下利用本实施例中的间接ELISA法测得病人阳性血液标准品和所制备出的质控品的OD450-630>0.8,最佳为2.0。由表1可知,当四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比分别为50%、70%、90%和100%时,所制备出的质控品OD450-630都远大于0.8,符合业内推荐标准,与病人阳性血液标准品相比,性能相当甚至更好,因此可替代病人阳性血液标准品。当四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比越高时,OD450-630越高,这种质控品的替代性越好,并且当所制备出的质控品OD450-630>2.0时,这就表明所制备出的质控品还应进一步稀释,从而减少所制备出的质控品在每次检测时的用量。另外,每种质控品是由所制备出的异源交联物利用小牛血清进行稀释而产生的,这就表明包含四聚体形式的异源交联抗体的异源交联物作为病人阳性血液中HSV-II抗体替代物,可以很好地替代病人阳性血液中的HSV-II抗体。
表1.小鼠anti-HSV-II McAb和人IgG的异源交联物替代性实验
选择四聚体形式的异源交联抗体在实施例1中所制备出的异源交联物中所占的质量比为90%的异源交联物作为病人阳性血液中HSV-II抗体替代物,所述异源交联物经小牛血清稀释20倍至25μg/ml而制备出质控品,从中选择三个不同批次的质控品作为病人阳性血液替代物开展实验,以评估不同批次质控品之间的差异,仍然选择间接ELISA方法开展实验,结果如表2所示。
表2.质控品批间差评估表
由表2中的数据计算批间CV=1.09%,远小于5%,可知不同批次的替代病人阳性血液的质控品之间的差异非常小,说明本发明的质控品具有非常好的批间稳定性和一致性,因此能够有效地降低因为批间差异引起的检测误差。
将四聚体形式的异源交联抗体在实施例1中所制备出的异源交联物中所占质量比为50%、70%、90%和100%时的异源交联物都利用实施例1中的交联缓冲液稀释至0.5mg/ml,取0.5ml稀释后的异源交联物溶液,放于1ml离心管中,分别在-20℃和4℃下保存一个月后,用交联缓冲液稀释100倍,仍然利用间接ELISA法检测这些异源交联物的稳定性。实验结果表明本发明所制备出的含有四聚体形式的异源交联抗体的异源交联物作为病人阳性血液中HSV-II抗体替代物,具有非常好的稳定性。
此外,以四聚体形式的异源交联抗体在实施例1中制备出的异源交联物中所占的质量比90%时为例进行冻存稳定性测试。将三个不同批次的所述异源交联物加入到适量冻存液中至终浓度均为5mg/ml,其中这种冻存液包括50%甘油、1%的BSA和0.01%的硫柳汞,然后分别取0.1ml加入所述异源交联物的冻存液,装入三个不同的0.5ml的离心管中,将这三个离心管放置在-20℃的冰箱中保存4个月,4个月后取出这三个离心管,待冻融后,将每个离心管中的溶液用交联缓冲液稀释至25μg/ml,仍然利用间接ELISA法检测,结果如表3所示:
表3.小鼠anti-HSV-II McAb和人IgG的异源交联物-20℃下冻存稳定性实验
由表3中的数据可知,与在同样的检测条件下获得的冻存前的数据(参见表2)相比,这三个不同批次的异源交联物的检测效价在冻存液中-20℃下保存4个月后均无显著降低,因此其作为病人阳性血液中HSV-II抗体替代物,具有非常好的冻存稳定性。
实施例3 小鼠anti-HSV-I McAb和健康的未感染HSV-I的人IgG的异源交联物替代性实验
利用SPDP交联剂制备小鼠anti-HSV-I McAb和健康的未感染HSV-I的人IgG的异源交联物作为病人阳性血液中HSV-I抗体替代物,除了用小鼠anti-HSV-IMcAb替换小鼠anti-HSV-II McAb之外,具体过程与实施例1中的一样。
利用实施例3制备出的小鼠anti-HSV-I McAb和健康的未感染HSV-I的人IgG的异源交联物作为病人阳性血液中HSV-I抗体的替代物开展实验。依次配制出四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比在50%、70%、90%和100%时的异源交联物。当四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比为50%、70%或90%时,剩余50%、30%或10%的异源交联物包括由小鼠anti-HSV-I McAb和健康的未感染HSV-I的人IgG形成的二聚体形式的异源交联抗体和/或三聚体形式的异源交联抗体,但不包括未发生交联的小鼠anti-HSV-I McAb和健康的未感染HSV-I的人IgG。利用实施例1中的交联缓冲液稀释,使这些异源交联物的初始浓度均为0.5mg/ml,并利用小牛血清进行100倍稀释至5μg/ml而制备出质控品,然后利用间接ELISA法检测进行检测(具体步骤参照实施例2)。实验结果如表4所示。
若要使所制备出的质控品能够替代病人HSV-I抗体阳性血液标准品,业内推荐标准:在相同条件下利用实施例2中的间接ELISA法测得病人阳性血液标准品和所制备出的质控品的OD450-630>1.5,最佳为2.0~2.5。由表4可知,当四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比分别为50%、70%、90%和100%时,所制备出的质控品OD450-630都远大于1.5,符合业内推荐标准,与病人阳性血液标准品相比,性能相当甚至更好,因此可替代病人阳性血液标准品。当四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比越高时,OD450-630越高,这种质控品的替代性越好,并且当所制备出的质控品OD450-630>2.5时,这就表明所制备出的质控品还应进一步稀释,从而减少所制备出的质控品在每次检测时的用量。另外,每种质控品是由所制备出的异源交联物利用小牛血清进行稀释而产生的,这就表明包含四聚体形式的异源交联抗体的异源交联物作为病人阳性血液中HSV-I抗体替代物,可以很好地替代病人阳性血液中的HSV-I抗体。
表4.小鼠anti-HSV-I McAb和人IgG的异源交联物替代性实验
将四聚体形式的异源交联抗体在实施例3中所制备出的异源交联物中所占质量比为50%、70%、90%和100%时的异源交联物都利用实施例1中的交联缓冲液稀释至0.5mg/ml,取0.5ml稀释后的异源交联物溶液,放于1ml离心管中,分别在-20℃和4℃下保存一个月后,用交联缓冲液稀释100倍,仍然利用间接ELISA法检测这些异源交联物的稳定性。实验结果表明本发明所制备出的含有四聚体形式的异源交联抗体的异源交联物作为病人阳性血液中HSV-I抗体替代物,具有非常好的稳定性。
实施例4 小鼠anti-RV McAb和健康的未感染RV的人IgG的异源交联物替代性实验
利用SPDP交联剂制备小鼠anti-RV McAb和健康的未感染RV的人IgG的异源交联物作为病人阳性血液中RV抗体替代物,除了用小鼠anti-RV McAb替换小鼠anti-HSV-II McAb之外,具体过程与实施例1中的一样。
利用实施例4制备出的小鼠anti-RV McAb和健康的未感染RV的人IgG的异源交联物作为病人阳性血液中RV抗体的替代物开展实验。依次配制出四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比在50%、70%、90%和100%时的异源交联物。当四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比为50%、70%或90%时,剩余50%、30%或10%的异源交联物包括由小鼠anti-RV McAb和健康的未感染RV的人IgG形成的二聚体形式的异源交联抗体和/或三聚体形式的异源交联抗体,但不包括未发生交联的小鼠anti-RV McAb和健康的未感染RV的人IgG。利用实施例1中的交联缓冲液进行稀释,使这些异源交联物的初始浓度均为0.5mg/ml,并利用小牛血清进行20倍稀释至25μg/ml而制备出质控品,然后利用间接ELISA法进行检测(具体步骤参照实施例2)。实验结果如表5所示。
若要使所制备出的质控品能够替代病人RV抗体阳性血液标准品,业内推荐标准:在相同条件下利用实施例2中的间接ELISA法测得病人阳性血液标准品和所制备出的质控品的OD450-630>2.0,最佳为2.75。由表5可知,当四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比分别为50%、70%、90%和100%时,所制备出的质控品OD450-630都远大于2.0,符合业内推荐标准,与病人阳性血液标准品相比,性能相当甚至更好,因此可替代病人阳性血液标准品。当四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比越高时,OD450-630越高,这种质控品的替代性越好,并且当所制备出的质控品OD450-630>2.75时,这就表明所制备出的质控品还应进一步稀释,从而减少所制备出的质控品在每次检测时的用量。另外,每种质控品是由所制备出的异源交联物利用小牛血清进行稀释而产生的,这就表明包含四聚体形式的异源交联抗体的异源交联物作为病人阳性血液中RV抗体替代物,可以很好地替代病人阳性血液中的RV抗体。
表5.小鼠anti-RV McAb和人IgG的异源交联物替代性实验
将四聚体形式的异源交联抗体在实施例4中所制备出的异源交联物中所占质量比为50%、70%、90%和100%时的异源交联物都利用实施例1中的交联缓冲液稀释至0.5mg/ml,取0.5ml稀释后的异源交联物溶液,放于1ml离心管中,分别在-20℃和4℃下保存一个月后,用交联缓冲液稀释100倍,仍然利用间接ELISA法检测这些异源交联物的稳定性。实验结果表明本发明所制备出的含有四聚体形式的异源交联抗体的异源交联物作为病人阳性血液中RV抗体替代物,具有非常好的稳定性。
实施例5 小鼠anti-HCMV McAb和健康的未感染HCMV的人IgG的异源交联物替代性实验
利用SPDP交联剂制备小鼠anti-HCMV McAb和健康的未感染HCMV的人IgG的异源交联物作为病人阳性血液中HCMV抗体替代物,除了用小鼠anti-HCMV McAb替换小鼠anti-HSV-II McAb之外,具体过程与实施例1中的一样。
利用制备出的小鼠anti-HCMV McAb和健康的未感染HCMV的人IgG的异源交联物作为病人阳性血液中HCMV抗体的替代物开展实验。依次配制出四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比在50%、70%、90%和100%时的异源交联物。当四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比为50%、70%或90%时,剩余50%、30%或10%的异源交联物包括由小鼠anti-HCMV McAb和健康的未感染HCMV的人IgG形成的二聚体形式的异源交联抗体和/或三聚体形式的异源交联抗体,但不包括未发生交联的小鼠anti-HCMV McAb和健康的未感染HCMV的人IgG。利用实施例1中的交联缓冲液进行稀释,使这些异源交联物的初始浓度均为0.5mg/ml,并利用小牛血清进行100倍稀释至5μg/ml而制备出质控品,然后利用间接ELISA法进行检测(具体步骤参照实施例2)。实验结果如表6所示。
若要使所制备出的质控品能够替代病人HCMV抗体阳性血液,业内推荐标准:在相同条件下利用实施例2中的间接ELISA法测得病人阳性血液标准品和所制备出的质控品的OD450-630>1.5,最佳为2.6。由表6可知,当四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比分别为50%、70%、90%和100%时,所制备出的质控品OD450-630都远大于1.5,符合业内推荐标准,与病人阳性血液标准品相比,性能相当甚至更好,因此可替代病人阳性血液标准品。当四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比越高时,OD450-630越高,这种质控品的替代性越好,并且当所制备出的质控品OD450-630>2.6时,这就表明所制备出的质控品还应进一步稀释,从而减少所制备出的质控品在每次检测时的用量。另外,每种质控品是由所制备出的异源交联物利用小牛血清进行稀释而产生的,这就表明包含四聚体形式的异源交联抗体的异源交联物作为病人阳性血液中HCMV抗体替代物,可以很好地替代病人阳性血液中的HCMV抗体。
表6.小鼠anti-HCMV McAb和人IgG的异源交联物替代性实验
将四聚体形式的异源交联抗体在实施例5中所制备出的异源交联物中所占质量比为50%、70%、90%和100%时的异源交联物都利用实施例1中的交联缓冲液稀释至0.5mg/ml,取0.5ml稀释后的异源交联物溶液,放于1ml离心管中,分别在-20℃和4℃下保存一个月后,用交联缓冲液稀释100倍,仍然利用间接ELISA法检测这些异源交联物的稳定性。实验结果表明本发明所制备出的含有四聚体形式的异源交联抗体的异源交联物作为病人阳性血液中HCMV抗体替代物,具有非常好的稳定性。
实施例6 小鼠anti-TOXO McAb和健康的未感染TOXO的人IgG的异源交联物替代性实验
利用SPDP交联剂制备小鼠anti-TOXO McAb和健康的未感染TOXO的人IgG的异源交联物作为病人阳性血液中TOXO抗体替代物,除了用小鼠anti-TOXO McAb替换小鼠anti-HSV-II McAb之外,具体过程与实施例1中的一样。
利用制备出的小鼠anti-TOXO McAb和健康的未感染TOXO的人IgG的异源交联物作为病人阳性血液中TOXO抗体的替代物开展实验。依次配制出四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比在50%、70%、90%和100%时的异源交联物。当四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比为50%、70%或90%时,剩余50%、30%或10%的异源交联物包括由小鼠anti-TOXO McAb和健康的未感染TOXO的人IgG形成的二聚体形式的异源交联抗体和/或三聚体形式的异源交联抗体,但不包括未发生交联的小鼠anti-TOXO McAb和健康的未感染TOXO的人IgG。利用实施例1中的交联缓冲液进行稀释,使这些异源交联物的初始浓度均为0.4mg/ml,并利用小牛血清进行20倍稀释至20μg/ml而制备出质控品,然后利用间接ELISA法进行检测(具体步骤参照实施例2)。实验结果如表7所示。
若要使所制备出的质控品能够替代病人TOXO抗体阳性血液,业内推荐标准:在相同条件下利用实施例2中的间接ELISA法测得病人阳性血液标准品和所制备出的质控品的OD450-630>1.5,最佳为2.4。由表7可知,当四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比分别为50%、70%、90%和100%时,所制备出的质控品OD450-630都远大于1.5,符合业内推荐标准,与病人阳性血液标准品相比,性能相当甚至更好,因此可替代病人阳性血液标准品。当四聚体形式的异源交联抗体在所制备出的异源交联物中所占的质量比越高时,OD450-630越高,这种质控品的替代性越好,并且当所制备出的质控品OD450-630>2.4时,这就表明所制备出的质控品还应进一步稀释,从而减少所制备出的质控品在每次检测时的用量。另外,每种质控品是由所制备出的异源交联物利用小牛血清进行稀释而产生的,这就表明包含四聚体形式的异源交联抗体在内的异源交联物作为病人阳性血液中TOXO抗体替代物,可以很好地替代病人阳性血液中的TOXO抗体。
表7.小鼠anti-TOXO McAb和人IgG的异源交联物替代性实验
将四聚体形式的异源交联抗体在实施例6中所制备出的异源交联物中所占质量比为50%、70%、90%和100%时的异源交联物都利用实施例1中的交联缓冲液稀释至0.5mg/ml,取0.5ml稀释后的异源交联物溶液,放于1ml离心管中,分别在-20℃和4℃下保存一个月后,用交联缓冲液稀释100倍,仍然利用间接ELISA法检测这些异源交联物的稳定性。实验结果表明本发明所制备出的含有四聚体形式的异源交联抗体的异源交联物作为病人阳性血液中TOXO抗体替代物,具有非常好的稳定性。
Claims (4)
1.一种由两种异源的抗体通过交联反应而获得的异源交联物,其特征在于,所述的异源交联物包括由小鼠anti-RV McAb和健康的未感染RV的人IgG所形成的四聚体形式的异源交联抗体。所述的异源交联物是由以下方法制备得到:
(1)将5mg小鼠anti-RV McAb溶解于交联缓冲液中,搅拌加入50μl SPDP交联剂,室温下反应2个小时后,装入透析袋,用还原缓冲液透析,换液四次;其中所述的交联缓冲液包括0.1M磷酸钾,0.1M NaCl,pH7.5;所述交联剂浓度为3.2mg/ml,交联剂溶解于无水乙醇中;所述的还原缓冲液包括0.1M乙酸钠,0.1MNaCl,pH4.5;
(2)将5mg健康的未感染RV的人IgG溶解于交联缓冲液中,搅拌加入50μlSPDP交联剂,室温下反应2个小时后,装入透析袋,用交联缓冲液透析,换液四次;
(3)在(1)中加入30μl DTT,室温反应30分钟后,装入透析袋,用交联缓冲液透析,换液四次;所述的DTT浓度为1M,是将DTT溶解于0.01M乙酸钠溶液至终浓度为1M,pH5.2;
(4)将(2)、(3)中的处理物混合,在4℃下反应15个小时;
(5)往(4)中加入0.4mg碘乙酰胺封闭剂,反应30分钟以封闭未反应的活性基团,然后装入透析袋,用交联缓冲液透析,换液四次;
(6)将(5)中的产物装载到HiLoad 16/60Superdex 200PG凝胶过滤柱中,以交联缓冲液进行洗脱,并利用HD-3紫光分析仪实时检测洗脱产物在280nm波长时的吸光值,同时用XWT-S小型记录仪绘制层析图谱,按峰收集洗脱产物;
(7)获得含有四聚体形式的异源交联抗体的异源交联物。
2.如权利要求1所述的异源交联物,其特征在于,所述异源交联物保存在一种冻存液中,并在-20℃下保存,所述冻存液包括稳定剂,甘油和防腐剂。
3.如权利要求2所述的异源交联物,其特征在于,所述稳定剂可选自BSA或明胶,所述防腐剂可选自叠氮钠或硫柳汞。
4.如权利要求1至3之一所述的异源交联物在制备免疫检测试剂盒中的应用。
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