CN104644545A - 一种治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗内耳疾病的制剂，尤其涉及一种治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂；本发明的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，包括制剂主体，所述制剂主体包括凝胶态的载体、以及分散或吸附在载体内的药物，所述药物为治疗内耳疾病的激素类药物，所述载体为丝素蛋白凝胶。本发明的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，药物释放时间较长、使用后对听力无影响、安全无害。

Description

一种治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂

技术领域

本发明涉及一种治疗内耳疾病的制剂，尤其涉及一种治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂。

背景技术

近几年来，通过鼓室(IT)将激素类药物向内耳给药以治疗突发性耳聋(SSNHL)的方案已经越来越多的得到应用，涵盖从一线治疗到难治突发性耳聋(RSSNHL)的急救等多个临床领域。相比于全身给药方式，IT注射法不仅能使外淋巴液含有更高浓度的药物，而且增强了耳蜗的血流量和离子梯度，这些都有助于更好的恢复听力。然而，临床方面水溶性激素药物的IT给药受到了很大的限制，原因是部分药物可能会被鼓室的粘膜吸收，或者通过咽鼓管从鼓室流走，因而不能充分地与圆窗膜(RWM)接触，进而通过圆窗膜进入内耳。圆窗膜是从鼓室通往内耳的主要屏障，其吸收药物的多少直接决定了内耳内的药物浓度。直接注射的药物可能会被鼓室内的粘膜吸收，或者通过咽鼓管从鼓室流走，只有极少量能被圆窗膜吸收。由于药物扩散到内耳被限制，所以单独的鼓室注射并不能给予内耳充足的药物。临床中可以反复或者持续给药以维持内耳中药物浓度，即在鼓室植入一根连泵的导管，从而利用全植入式微导管连接微泵的连续给药。相比于反复注射，泵给药是可以达到持续递送药物的效果。但是，可植入微型泵在临床上并没有得到广泛的认可，原因是***和移除过程会给机体组织带来损伤。

最近受到广泛关注的可降解生物材料控制药物持续释放，可以作为除了多次注射以及植入型微型泵的另一种方案。国内外的公司和研究单位正在积极研究多种合成或者天然的材料，以建立一种可临床应用的内耳药物缓释控释***。其基本构想是通过可降解材料包埋治疗分子，置于圆窗膜四周，材料可以粘附在圆窗膜上，并持续释放包埋的治疗分子至内耳。

丝素蛋白是一种从家蚕丝分离出来的天然蛋白聚合物，具有组织修复以及药物递送载体所需要的一切特性，包括生物可降解性、生物相容性、稳定药物包埋、材料形式多样性以及加工简单、无需有机溶剂等。研究已经证实了注射用丝素蛋白凝胶的临床应用可行性。丝素蛋白是已被FDA批准的生物材料，所以丝素凝胶应用于临床是安全的。这些特性使丝素蛋白凝胶可以作为药物载体递送药物至内耳，通过IT延长药物在鼓室的停留时间，减少因流入咽鼓管造成的药物流失，然而，如何将药物与丝素蛋白凝胶形成稳定的控释缓释制剂，尚是一个难题。

有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，使其更具有产业上的利用价值。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种药物释放时间较长、对听力无影响、安全无害的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂。

本发明的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，包括制剂主体，所述制剂主体包括凝胶态的载体、以及分散或吸附在载体内的药物，所述药物为治疗内耳疾病的激素类药物，所述载体为丝素蛋白凝胶。

具体的，所述丝素蛋白凝胶以丝素蛋白溶液通过诱导成胶方式制成。

具体的，所述诱导成胶方式包括PH值改变法、超声振荡法、电泳法、HRP(辣根过氧化酶)-H₂O₂(过氧化氢)共混法、以及低分子量PEG(聚乙二醇)共混法。

优选的，所述诱导成胶方式为低分子量PEG(聚乙二醇)共混法。

具体的，所述制剂主体由所述药物以水溶液的形式、或者以不溶微球形式与丝素蛋白溶液混合后通过诱导成胶方式制成。

具体的，所述制剂主体中丝素蛋白的浓度为1-30％。

优选的，所述制剂主体中丝素蛋白的浓度为7.5-15％。

具体的，所述疾病包括梅尼耳氏症、突发性耳聋(SSNHL)、美尼尔氏综合征、感觉神经性听力损失、以及自身免疫性内耳病(AEID)，所述激素类药物包括***、倍他米松、氢化波尼松、甲基强的松龙、去氧皮质酮、11-去氧皮质酮、18-H-11-去氧皮质酮、倍氯米松、曲安奈德以及其化学合成衍生物中的其中一种或多种。

本发明还提供一种上述治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)混合：将治疗内耳疾病的激素类药物以水溶液的形式、或者以不溶微球形式与丝素蛋白溶液混合均匀，得到药物悬液；

2)成胶：将药物悬液以诱导成胶的方式，制成制剂主体。

进一步的，所述诱导成胶方式包括PH值改变法、超声振荡法、电泳法、HRP(辣根过氧化酶)-H₂O₂(过氧化氢)共混法、以及低分子量PEG(聚乙二醇)共混法。

进一步的，所述混合步骤中激素类药物以不溶微球形式与丝素蛋白溶液混合均匀之前还进行涂层处理，所述涂层处理包括以下步骤：

a)将激素类药物微球悬浮于低浓度丝素蛋白溶液中，混合均匀，并超声处理一段时间以分散聚集成团的微球；

b)将步骤a)得到的溶液，经过振荡、离心、去上清、水洗和干燥后，得到包被有丝素蛋白涂层的激素类药物微球。

若需得到包被有多层丝素蛋白涂层的激素类药物微球，重复步骤a-b即可。

本发明所述的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，其使用方法包括两种，一种为原位成胶，一种为预成胶，原位成胶和预成胶的成胶方式一样，仅在具体使用方式上存在不同，两者的区别点在于，预成胶在体外成胶后注射或植入内耳，而原位成胶是将药物悬液注射入圆窗龛的整个空间，继而形成合适形态的半固态凝胶，最大限度的接触圆窗膜的表面；预成胶不需要病人保持一定的姿势，因而更方便，但缺点是高浓度下较难通过细针头注射。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明药物作为控释缓释制剂，能够治疗内耳疾病。可注射丝素蛋白凝胶作为药物载体，丝素蛋白-PEG溶液成胶时间高度可控(Wang X,Partlow B,Liu J,et al.Injectable silk-polyethylene glycolhydrogels.Acta Biomater.2015；15(12):51-61)；原位成胶的制备方案能达到零级释放的标准；药物释放时间至少能达到10天；并且对听力无影响。同时作为药物载体，丝素蛋白-PEG凝胶安全无毒、降解缓慢。说明可注射丝素-PEG凝胶是一种有效安全的药物载体，可用于激素类缓释药物治疗内耳疾病。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明实施例六中丝素-PEG-mDEX凝胶的扫描电子显微镜结果图；

图2是本发明实施例七中丝素-PEG-mDEX凝胶的体外释放试验结果图；

图3是本发明实施例八中不同时间点下外淋巴液中DEX的浓度结果图；

图4是本发明实施例八中假手术组和圆窗膜注射丝素-PEG-mDEX凝胶组对听阈的影响对比图；

图5是本发明实施例八中豚鼠鼓室和内耳样品的组织切片图；

图6是本发明实施例八中罗丹明-鬼笔环肽染色基膜荧光染色结果图；

图7是本发明实施例八中丝素-PEG-mDEX凝胶体内生物降解图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一

本发明的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，包括制剂主体，制剂主体包括凝胶态的载体、以及分散或吸附在载体内的药物，药物为治疗内耳疾病的激素类药物，载体为丝素蛋白凝胶。其中，丝素蛋白凝胶以丝素蛋白溶液通过诱导成胶方式制成；诱导成胶方式包括PH值改变法、超声振荡法、电泳法、HRP(辣根过氧化酶)-H₂O₂(过氧化氢)共混法、以及低分子量PEG(聚乙二醇)共混法。

激素类药物分为水溶性药物和水难溶性药物，因而，制剂主体由药物以水溶液的形式、或者以不溶微球形式与丝素蛋白溶液混合后通过诱导成胶方式制成。考虑到药物需要长效释放，优化的药物形式为水难溶性药物，更优化选择微球态水难溶性药物，水难溶性药物可以通过喷雾干燥等手段制成微球形式。考虑到长效释放的功效，药物剂型可以做进一步的预处理，即将治疗药物的微球表层涂抹丝素蛋白，能更有效的促进药物在凝胶降解过程中的缓释功效。水难溶性药物以微球形式悬浮在合适的溶剂中，而后与丝素蛋白溶液混合后诱导成胶，合适的溶剂包括但不局限于水、有机溶剂、增溶剂、增粘剂、以及促渗剂。

根据不同药物的用量不同，药物溶液中，药物浓度的范围为0.5％-15％(w/v)，其中，低载量的浓度为0.5-2％；中载量：2-5％；高载量浓度为5-15？％。而制剂主体中丝素蛋白的浓度为1-30％；制剂主体中丝素蛋白的浓度为7.5-15％。

本发明的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，可以应用的内耳疾病包括梅尼耳氏症、突发性耳聋(SSNHL)、美尼尔氏综合征、感觉神经性听力损失、以及自身免疫性内耳病(AEID)等多种内耳疾病；相对应的，使用的激素类药物包括***、倍他米松、氢化波尼松、甲基强的松龙、去氧皮质酮、11-去氧皮质酮、18-H-11-去氧皮质酮、倍氯米松、以及曲安奈德以及其化学合成衍生物中的其中一种或多种。

本发明所述的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，其药物作用部位为内耳，药物制剂呈凝胶态，覆盖在耳蜗内的圆窗膜上及周围，可以通过耳蜗内圆窗龛注入药物制剂和/或通过鼓室注射；其使用方法包括两种，一种为原位成胶，一种为预成胶，两者的区别点在于，预成胶在体外成胶后注射或植入内耳，而原位成胶是将药物悬液注射入圆窗龛的整个空间，继而形成合适形态的半固态凝胶，最大限度的接触圆窗膜的表面。药物剂型为原位成胶时，在溶液态时包括但不局限于普通注射器和微小针头注入鼓室给药、微量注射器给药。

本发明所述的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，若采用低分子量PEG(聚乙二醇)共混法并使用原位成胶，其药物作用机理为：注射后，丝素蛋白-PEG(聚乙二醇)混合液注满圆窗龛的整个空间，继而形成合适形态的半固态凝胶，最大限度的接触圆窗膜的表面；随着凝胶长期粘附在圆窗膜上，药物持续释放并进入内耳达到治疗疾病的效果。随着药物的释放，凝胶在体内被蛋白酶降解，降解产物为多肽及氨基酸。降解时间通过实验得知，第10天开始降解，21天时药用部位只有少量残余凝胶存在，同时发现药物的控缓时间至少能达到10天。

实施例二

本发明提供一种治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)混合：将治疗内耳疾病的激素类药物以水溶液的形式、或者以不溶微球形式与丝素蛋白溶液混合均匀，得到药物悬液；

2)成胶：将药物悬液以诱导成胶的方式，制成制剂主体。

其中，诱导成胶方式包括PH值改变法、超声振荡法、电泳法、HRP(辣根过氧化酶)-H₂O₂(过氧化氢)共混法、以及低分子量PEG(聚乙二醇)共混法。

不同诱导成胶方式的操作步骤如下，对比结果如表1所示：

a)PH值改变制备丝素蛋白凝胶

用20mL的小烧杯取10mL 5％(w/v)的丝素蛋白溶液，用NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液调节溶液PH为5.2，于室温下过夜，缓慢成胶。

b)超声振荡制备丝素蛋白凝胶

用10mL的试管取5mL5％(w/v)的丝素蛋白溶液，用JYD-900智能型超声波细胞粉碎机在500w功率下下进行超声波振荡30-60sec(秒)，然后将小烧杯置于室温25℃形成凝胶。

c)电泳法制备丝素蛋白凝胶。

电极浸入8％(w/v)丝素蛋白水溶液，25伏直流电下通电3min(分钟)。由于丝素蛋白溶液含水量高，通电过程中会发生水解，产生氧气和氢气，所以随着通电进行，两电极出现气泡。同时阳极位置出现成胶现象。

d)HRP(辣根过氧化酶)-H2O2(过氧化氢)成胶

HRP冻干粉末加入到去离子水中形成浓度为1000U/ml溶液，后取适量HRP溶液加入3％(w/v)丝素蛋白溶液中，调制溶液中HRP终浓度为10U/ml。然后向每毫升丝素蛋白溶液中加入10μl过氧化氢溶液，达到165nM的过氧化氢终浓度，混合后制备成胶。

e)低分子量PEG(聚乙二醇)成胶

15％(w/v)丝素蛋白溶液混合同体积的80％(w/w)PEG400(聚乙二醇400)溶液，在37℃下孵化成胶。

表1不同的丝素蛋白凝胶制备方法比较

通过X-衍射检查各种方法成胶后的主要结构得知，其主要结构均为Silk Ⅱ。Silk Ⅱ晶体结构含量是决定丝素蛋白生物材料的机械强度、降解速率及药物缓释控释性能的最重要因素，因此据此可知以上不同方法制备的丝素蛋白凝胶在材料性能上无差异化。由于低分子量PEG(聚乙二醇)成胶法临床应用更为方便，可控，安全无毒，故下述实施例中诱导成胶的方法均采用丝素蛋白-PEG凝胶法，其它方法不再赘述。另外，应当指出的是，当采用低分子量PEG(聚乙二醇)共混法制备凝胶时，也可以将上述的激素类药物与聚乙二醇混合，或同时与丝素蛋白和聚乙二醇混合。

实施例三

本发明提供一种治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂的制备方法，应用于不同激素类药物制剂的制备：

a)丝素蛋白-PEG-mDEX(micronized dexamethasone，***微球)制备

一定量的mDEX微球悬浮于0.5ml的15％(w/v)丝素蛋白水溶液，随后悬浮液与同体积的0.5ml 80％(w/w)PEG400(聚乙二醇400)溶液混后成胶。

b)丝素蛋白-PEG-DA(醋酸***)凝胶制备

无菌的DA(醋酸***)溶液与高浓度的丝素蛋白水溶液混合均匀达到一定的药物载量，丝蛋白终浓度为15％(w/v)，再与同体积的80％(w/w)PEG400(聚乙二醇400)溶液混后成胶。

c)丝素蛋白-PEG-MPS(***磷酸钠)凝胶制备

无菌的DSP(***磷酸钠)溶液与高浓度的丝素蛋白水溶液混合均匀达到一定的药物载量，丝蛋白终浓度为15％(w/v)，再与同体积的80％(w/w)PEG400(聚乙二醇400)溶液混后成胶。

由于不同药物的药效不同、用量不同，本发明难以对其进行一一举例详细说明，因而，在后续实施例中，仅以丝素蛋白-PEG-mDEX的制备为例进行详细说明。

实施例四

本发明提供一种治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂的制备方法，用于丝素蛋白-PEG-mDEX制备：

a)mDEX-丝素蛋白涂层制备：大约20mg的mDEX悬浮于1ml的0.1％(w/v)丝素蛋白溶液。悬浮液室温下缓慢振荡2min。然后微球悬浮液超声大约1min，以分散聚集成团的微球。再次振荡2min后溶液离心2min(14000r.p.m),以去除上层丝素蛋白溶液。微球以1ml水洗2次，振荡1min，离心。洗后的微球以氮气干燥制得。以上涂层步骤可以重复多次，直到得到理想的涂层厚度及相应的药物释放速率。

b)丝素蛋白-PEG-mDEX凝胶制备：制得的丝素蛋白涂层的mDEX悬浮于0.5ml的高浓度丝素蛋白水溶液，丝蛋白终浓度为15％(w/v)，随后悬浮液与同体积的0.5ml80％(w/w)PEG400(聚乙二醇400)溶液混后成胶。

应当说明的是：上述步骤b)可以单独使用以制备无丝素蛋白涂层的丝素蛋白-PEG-mDEX凝胶，也可与步骤a)相结合，制备有丝素蛋白涂层的丝素蛋白-PEG-mDEX凝胶。

实施例五

本发明提供一种治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂的制备方法，用于丝素蛋白-PEG-mDEX制备，其方法与实施例四中的一致，其区别点在于：

丝素蛋白的浓度调整为1-30％，然而丝蛋白终浓度为1％时，由于凝胶浓度较低，载药性较差，药物的释放速度较快，当丝蛋白终浓度为30％时，由于凝胶浓度较高，载药性较高，对药物的吸附作用更为显著，药物的释放速度较慢，因此，优选为制剂主体中丝素蛋白的浓度为7.5-15％。

实施例六

本发明提供一种治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，采用实施例四中的制备方法制备，随后采用SEM(扫描电子显微镜检查法)对丝素-PEG-mDEX凝胶进行形态学检查。试验方法为：

丝素蛋白-PEG凝胶(7.5％w/v)包埋mDEX(0％、1.5％载量)按实施例四方法制备，将200μL制备好的溶液滴入24孔板，放置在37℃环境下孵化直至溶液成胶。孔板浸入1000ml纯净水的玻璃烧杯中，缓慢搅拌超过24小时，期间置换4次纯净水，被洗过的凝胶在-80℃下冷冻过夜并冻干48小时。样品通过SEM观察。

如图1所示，通过SEM观察形态学，PEG在水洗后已经从凝胶中去除，导致剩下的凝胶呈多孔海绵状。如图1A-1C所示，分别为20、5和1μm放大倍数下未包埋mDEX的丝素-PEG凝胶的扫描电子显微镜结果图，未包埋mDEX的丝素-PEG凝胶具有多孔结构，内有大约100μm的相互联通的孔隙。如图1D-1F所示，分别为20、5和1μm放大倍数下包埋mDEX的丝素-PEG凝胶的扫描电子显微镜结果图，而包埋了mDEX的丝素-PEG凝胶则呈现出相似的多孔叠层结构，微粒状的mDEX(1-5μm)则嵌入在丝素蛋白的基质内。如图1G-1I所示，分别为20、5和1μm放大倍数下未包埋的mDEX水不溶微球的扫描电子显微镜结果图，独自测量的mDEX微粒与嵌入在丝素蛋白凝胶中的微粒大小是一样的，这表明丝素蛋白凝胶形成的过程对mDEX微粒的大小和分散性没有影响。

实施例七

本发明提供实施例四中所述的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，在体外的控释、缓释效果的试验分析结果，丝素蛋白-PEG-mDEX凝胶制备方法与实施例四中提供的方法一致，区别点在于药物的载药量不同，同时mDEX药物微球没有经过丝素蛋白涂层。体外释放试验如下所示：

丝素蛋白-PEG-mDEX凝胶，根据其载药量mDEX的不同分为低剂量(0.5％)和高剂量(2.5％)，对于成胶方式的不同，分为原位成胶组和预成胶组。其中，对于原位成胶组，5μl的丝素蛋白-PEG-mDEX溶液通过25G针头注射至2-ml的微量离心管，然后37℃孵育，在30分钟内成胶。对于预成胶组，注射器内含有的丝素蛋白-PEG-mDEX溶液先在37℃的环境下在30分钟内孵育成胶，然后向2-ml微量离心管内注射5ml的凝胶(不带针头)。实验开始时，每个管中均加入1ml PBS，PH＝7.4的缓冲液，所有的离心管在37℃下振荡。第1、6、24小时、2、3、4、5、6、7天，抽取0.95ml的释放介质到一空白管，然后4℃下储存，用于LC/MS/MS检测。恒温下再在原离心管中补充0.95ml的PBS,PH 7.4的缓冲液。

结果如图2所示，其中图2A为不同时间下，4种丝素蛋白-PEG-mDEX凝胶在释放介质(PBS,pH 7.4)中DEX浓度(μg/ml)的对比检测结果图，图2B为不同时间下，4种丝素蛋白-PEG-mDEX凝胶在144h内DEX的累积释放量对比图。如图2A所示，载药量为0.5％的丝素蛋白-PEG-mDEX凝胶在起始阶段显示出快速释放的过程，原位成胶和预成胶的模式下2h时都迅速达到最大的浓度值(大约4μg/ml)，6h后则迅速降低至基线值。当凝胶载药量为2.5％时，DEX高浓度水平的持续释放时间更久，其中原位成胶模式下，DEX的浓度在96h里在5-10μg/ml内变化，在144h则跌落至1.6μg/ml，预成胶模式下，72h内DEX的浓度在5-10μg/ml变化，96h时跌落至2.2μg/ml。在mDEX的载药量为0.5％时，原位成胶模式和与预成胶模式2h的累积释放量分别为38％和25％(图2B)。mDEX载药量为2.5％时，原位成胶和预成胶几乎都达到了零级释放，在144h后，其释放率分别接近44％和30％(图2B)

实施例八

本发明提供实施例四中所述的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，在体内的控释、缓释效果的试验分析结果。丝素蛋白-PEG-mDEX凝胶制备方法与实施例四中提供的方法一致，区别点在于载药量和丝素蛋白浓度不同，体内药代动力学试验方法如下：

a)耳科手术：

方法：

丝素-PEG-mDEX凝胶中，丝素蛋白浓度为7.5％(w/v)，mDEX载量为0.5％和2.5％(w/v)，用于体内试验研究。对照组中0.5％和2.5％mDEX溶液的制备是以mDEX悬浮于10mM PBS，PH7.4制备。整个过程在无菌操作台进行的无菌操作。豚鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉(35mg/kg)。整个手术过程中需要将动物放置在电热垫上(38℃)以保持体温，皮下注射1％利多卡因局麻，通过耳后手术暴露听泡，在听泡上钻出直径为3mm的一个小洞，以清晰看到圆窗龛。用结核菌素注射器(27G针头)向圆窗膜上滴注10μl的mDEX悬浮液(对照组)或者丝素-PEG-mDEX混合悬浮液，注入后豚鼠固定此姿势约30min，以等待溶液成胶，洞口用缝合线缝合并打上补齿水泥密封。

b)取样和DEX浓度检测

方法：豚鼠分为2组(50只)：丝素-PEG-mDEX凝胶组(取样时间：1h、1、4、7、10、14天)和mDEX对照组(取样时间：1、3、6、12h)。每次取样点为5只豚鼠(3只凝胶组和2只对照组)取样分析。脑脊液(CSF)的抽取，在头顶后方正中线切口，剥离肌肉层，露出小脑延髓池，微量调节注射器抽取CSF20μl。血样的提取为心脏穿刺抽取，血样转移至加入肝素的离心管并离心5min(3500rpm/s)。随后将上清的血清(约100μl每只)移至空管中。外淋巴液取样时为避免脑脊液污染，采用离体提取。试验动物全麻后从颞骨分离耳蜗。在耳蜗顶圈开一小洞，用微量调节注射器泵抽取外淋巴(5-7μl)。所有样品检测前放置-80℃环境下保存。

结果：

在向豚鼠的圆窗膜注射丝素-PEG-mDEX凝胶和mDEX溶液(对照组)后，对豚鼠的外淋巴液、CSF(脑脊液)和血浆样品中DEX的浓度定时取样检测。如图3所示，为载药量为0.5％和2.5％的丝素-PEG-mDEX凝胶、以及mDEX溶液，在不同时间点下外淋巴液中释放的DEX浓度的对比图，图3A为0-200h的结果图，图3B为0-30h区域的局部放大的对比图。由图可知，对照组中，外淋巴DEX浓度1h就达到峰值(13.47±6.02μg/ml)，在6h时则降至2.984±1.33μg/ml，12h就跌落到检测线以下。DEX载量为0.5％的丝素-PEG-mDEX凝胶组中，外淋巴中DEX浓度1h为8.06±4.56μg/ml，12h为2.70±0.97μg/ml，说明该组的DEX释放时间比对照组要长。当DEX载量升至2.5％时，在丝素-PEG-mDEX组中，DEX在内耳的时间和浓度显著增加，外淋巴的DEX检测浓度1h为25.71±11.50μg/ml，4d为6.46±2.89μg/ml，10d达到了0.26±0.15μg/ml。局部给药后，DEX在全身的浓度很低，丝素-PEG-mDEX(2.5％)组中耳注射后1h，在CSF和血浆中分别检测到DEX的浓度为0.23±0.10和0.032±0.014μg/ml。相比较在外淋巴液中的浓度，降低了大约110倍和800倍。2h后则无法检测到DEX。低载量(0.5％)的丝素-PEG-mDEX组在1h也都无法在CSF和血浆中检测到DEX。这些结果表明丝素-PEG凝胶在耳蜗中缓释释放DEX多达10天以上。

c)听脑干反应评估(ABR)

方法：

为评价丝素-PEG-mDEX凝胶的安全性以及在听觉外科手术过程中应用产生的影响，在4个时间点通过ABR测试来评估听力功能：手术前、术后1天、术后4天、以及术后14天。12只豚鼠分为2组：手术对照组(未加药物，n＝6)和丝素-PEG-mDEX凝胶组(n＝6)。利用TDT-Ⅱ记录***(Alachua,FL,USA)在特定的频率下(4K、8K、16K、24K)分析ABR。腹腔注射1％戊巴比妥(35mg/kg)麻醉试验动物。试验动物放置在电热毯上(38℃)，处于隔音室中测试。皮下植入3个针电极以便测量脑干活动：一只移植在耳后方(参考电极)，一只移植在脑壳顶点(工作电极)，一只在后腿的对侧(接地电极)。诱发电位通过带通滤波器滤过在100-300Hz，平均512次。在每个给定的频率，猝发音强度开始在90dB SPL，并逐步5dB减弱，直到达到阈值。ABR的阈值定位在能够搜集到的最低强度的可再现波段III。

结果：

实验中阈值随猝发音强度变化而变化的情况如图4A所示。手术对照组中，听力功能在所有的时间点(术前，1、4、14天)和任何频率下都没有被影响(图4B)。在丝素-PEG-mDEX高剂量(2.5％)凝胶组中(Figure 4C)，4kHz和8kHz频率段听力没有变化，没有出现阈值提升的情形。在16K和24K频率段，相比于术前阈值水平，凝胶注射后听力有一过性的小幅度下降，1天内阈值上升了5-15dB SPL(39.2±6.6vs 30.8±5.8at 16k Hz；45.0±7.1vs 34.2±6.6at 24k Hz,p<0.01)。这种听阈提升的现象在第4天开始减弱(37.5±5.2vs 30.8±5.8at 16k Hz；41.7±7.5vs 34.2±6.6at 24k Hz,p<0.01)，第14天完全消失(34.2±5.8vs 30.8±5.8at 16k Hz；35.8±5.8vs 34.2±6.6at 24k Hz,p>0.05)，说明凝胶注射对听力功能的影响是暂时的，随着凝胶的降解和药物的释放而逐渐消失。

d)组织学评估

方法：

试验动物致死后，快速分离耳蜗并灌注含有4％多聚甲醛的PBS，然后浸泡在固定剂4℃过夜。为了取得全部的柯蒂氏器，基膜和柯蒂氏器在显微镜下仔细的解剖分开。罗丹明-鬼笔环肽(Rhodamine phalloidin,1:100)染耳毛细胞，以辨认耳蜗毛细胞。每只耳蜗分别在Leica TCS SPE显微镜下检查。每只耳蜗3次随机选取200μm的截面计数。活性毛发细胞百分率以活性毛发细胞数除以总毛发细胞数所得(活性细胞数加上内毛细胞)。耳蜗切片的制备是将耳蜗及中耳浸入0.1M的EDTA 14天以脱钙，并沿耳蜗纵轴部位切片，切片厚度为7μm，H&E染色，光学显微镜观察。

结果：

手术后第10天开始对中耳和内耳进行组织学评价。分析的重点在于可能在鼓室、圆窗龛、圆窗膜、鼓阶出现的炎症。同时评估丝素-PEG-mDEX凝胶对柯蒂氏器和螺旋神经节产生的影响。从结果看，在所有的组别中都没有出现明显的严重炎症反应(积液、水肿、纤维化等)。圆窗膜临近的鼓阶会出现少量的炎症细胞和血细胞，但是从实验组(丝素-PEG-mDEX凝胶，图5B)和对照组(耳未处理，图5A)的炎症细胞数比较，其数值也不具有显著差异。相比较于对照组(mDEX溶液组，图5C)，凝胶给药组(图5D)在尺寸、形态学和神经节细胞数上没有产生任何的改变。

通过显微镜观察耳蜗的整体表面组织学，来研究注射丝素-PEG-mDEX凝胶后内、外毛发细胞产生损失的可能性。表2中的定量计数分析表明，治疗组以及空白组都被发现损失了一些外毛细胞，但并没有呈现出显著性差异(p<0.01)。如图6所示，所有组别的内毛细胞则没发生任何的变化(A:对照组；B:治疗组)。

表2注射丝素蛋白-PEG-mDEX凝胶后第10天内毛活细胞和外毛活细胞的百分比(n＝3)

e)丝素-PEG-mDEX凝胶在体内的降解

方法：

凝胶注入1h、4、7、10、14、21天后处死动物，获取听泡。打开听泡暴露出耳蜗，通过显微镜观察残留在圆窗龛上的丝素-PEG-mDEX凝胶。

结果：

在分离听泡后，我们通过定时显微镜观察来监测丝素-PEG-mDEX凝胶的生物降解性能。如图7所示，分别代表注射凝胶后1小时、4天、7天、10天、14天和21天丝素-PEG-mDEX凝胶降解的情况，红色箭头指示的是圆窗龛位置及残留的凝胶。可以发现，注射凝胶后1h在圆窗龛能观察到白色的稳定凝胶态，第10天看到凝胶的体积发生变化，凝胶开始降解，直到第14天凝胶体积一直减少，第21天时在圆窗龛内基本看不到凝胶残留了。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，其特征在于：包括制剂主体，所述制剂主体包括凝胶态的载体、以及分散或吸附在载体内的药物，所述药物为治疗内耳疾病的激素类药物，所述载体为丝素蛋白凝胶。

2.根据权利要求1所述的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，其特征在于：所述丝素蛋白凝胶以丝素蛋白溶液通过诱导成胶方式制成。

3.根据权利要求2所述的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，其特征在于：所述诱导成胶方式包括PH值改变法、超声振荡法、电泳法、辣根过氧化酶-过氧化氢共混法、以及低分子量聚乙二醇共混法。

4.根据权利要求3所述的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，其特征在于：所述诱导成胶方式为低分子量聚乙二醇共混法。

5.根据权利要求2所述的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，其特征在于：所述制剂主体由所述药物以水溶液的形式、或者以不溶微球形式与丝素蛋白溶液混合后通过诱导成胶方式制成。

6.根据权利要求1所述的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，其特征在于：所述制剂主体中丝素蛋白的浓度为1-30％。

7.根据权利要求6所述的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，其特征在于：所述制剂主体中丝素蛋白的浓度为7.5-15％。

8.根据权利要求1所述的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂，其特征在于：所述激素类药物包括***、倍他米松、氢化波尼松、甲基强的松龙、去氧皮质酮、11-去氧皮质酮、18-H-11-去氧皮质酮、倍氯米松、曲安奈德以及其化学合成衍生物中的其中一种或多种。

9.一种根据权利要求1-6任一项所述的治疗内耳疾病的控释缓释丝素蛋白凝胶制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)混合：将治疗内耳疾病的激素类药物以水溶液的形式、或者以不溶微球形式与丝素蛋白溶液混合均匀，得到药物悬液；

2)成胶：将药物悬液以诱导成胶的方式，制成制剂主体。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述混合步骤中激素类药物以不溶微球形式与丝素蛋白溶液混合均匀之前还进行涂层处理，所述涂层处理包括以下步骤：

a)将激素类药物微球悬浮于低浓度丝素蛋白溶液中，混合均匀，并超声处理一段时间以分散聚集成团的微球；

b)将步骤a)得到的溶液，经过振荡、离心、去上清、水洗和干燥后，得到包被有丝素蛋白涂层的激素类药物微球。