CN104630231A - 斑节对虾细胞周期蛋白t基因及其编码的蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种斑节对虾细胞周期蛋白T基因及其编码的蛋白，旨在提供一种为研究斑节对虾细胞周期蛋白T在卵巢发育中的作用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的性腺发育参差不齐的情况从分子层面提供理论基础基因及其蛋白，其技术要点是：该斑节对虾细胞周期蛋白T基因序列，如SEQ ID NO:1所示；其蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；属于生物基因技术领域。
Description
技术领域
本发明公开了斑节对虾细胞周期蛋白T及其编码的蛋白的氨基序列，属于生物基因技术领域。
背景技术
细胞周期调控是一个精确调控的过程。在细胞***过程中真核生物的细胞周期可以概括为两个大的阶段：细胞***间期(即G1时期、S时期和G2时期)和细胞***期(即M时期)，在细胞***时期，需要许多周期蛋白参与调控以保证其精确性。
细胞周期蛋白T(Cyclin T)是细胞转录的重要调控因子，和细胞周期蛋白依赖性激酶9(cyclin dependent kinase 9，CDK9)等组成正性转录延长因子b(positive transcription elongationfactor b，P-TEFb)参与细胞转录延伸反应的正性调控。Cyclin T和CDK9组成的P-TEFb协同CDK8、cyclin C、cyclin K、RNA聚合酶II(POLR2A)、负性调控因子(DSIF、NELF)等共同调控细胞转录，保证细胞功能的正常发挥。目前已知的cyclin家族成员以A-J进行编号，共有约15种，其中cyclin T作为转录的重要调控因子，在艾滋病、心肌肥大、肿瘤等疾病中有较深入的研究。Cyclins不仅是CDKs的激活亚基，而且是复合体(cyclins/CDKs)与其他基团或者调节因子直接作用时的识别效应器。1995年，人们首先从果蝇中分离纯化出P-TEFb，通过实验进一步确认了其成分主要是cyclin T和CDK9等。近几年的研究表明，cyclinT是胚胎正常发育、细胞生长与分化以及艾滋病病毒(HIV-1)转录复制等过程必不可少的关键因子之一，其功能和作用机理是目前研究的热点。随着细胞周期蛋白研究的不断广泛和深入，cyclin T在一些物种中相继被克隆出来，如人(Homo sapiens，AAC39638.1)、小鼠(Musmusculus，AAD17205.1)、果蝇(Drosophila melanogaster，AAC73052.1)、斑马鱼(Danio rerio，XP_005167592.1)和印度跳蚁(Harpegnathos saltator，EFN77646.1)等，但该基因在对虾中尚未研究。
斑节对虾是世界三大对虾养殖品种之一，人工育种过程中广泛采用的剪除单侧眼柄催熟卵巢的技术会导致亲虾的高死亡率和产卵质量低等问题。人们对于卵巢成熟促进因子(MaturePromoting Factor，MPF，cyclin B/CDC2)的研究揭示细胞周期蛋白在对虾卵巢发育中具有重要的潜在研究价值。
发明内容
本发明的是以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的PCR扩增引物，并通过RACE技术克隆到斑节对虾细胞周期蛋白T基因的全表达序列；此外通过斑节对虾细胞周期蛋白T基因设计荧光定量PCR引物，对周期蛋白T在斑节对虾卵巢各个发育时相的分布情况及在不同组织中的分布情况进行研究分析，为研究斑节对虾细胞周期蛋白T在卵巢发育中的作用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的性腺发育参差不齐的情况从分子层面提供理论基础。
本发明提供的斑节对虾细胞周期蛋白T基因，该基因序列如SEQ ID NO:1所示。
该基因的制备方法依次包括下述步骤：
1、总RNA的提取
取健康斑节对虾，解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、肠、***、胃等组织，并分别将组织于1mL Trizol(Invitrogen，日本)中匀浆，按Trizol试剂盒使用手册提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-80℃保存。
2、cDNA第一链的合成
取上述斑节对虾总RNA 2μL与反转录引物(5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16<3)1μL(10pmol/L)混合在反转录酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一链，反应条件：42℃60min，70℃15min。
3、斑节对虾细胞周期蛋白T的PCR扩增、克隆
根据已获得EST序列设计基因特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(rapidamplification of cDNA ends，RACE)和半巢式PCR(semi-nest PCR)技术扩增斑节对虾cyclinT基因的3′和5′未知序列。在3′RACE中，一扩使用正向引物T3SP1(5′-CAAAAGGACCTGTTTGGAGGCACAT-3′)和接头通用引物AP(GGCCACGCGACTAGTAC)；二扩使用正向引物T3SP2(5′-GACCGCCTTCGTCCTGAAAAGGAATC-3′)和接头通用引物AP。在5′RACE中，以T5SP1(5′-CAGGGTCTGTAGCAAAATGTTCTCA-3′)和oligo-dG(5′-GGGGGGGGGGGGGGG-3′)为引物进行一扩，用T5SP2(5′-CGGTGAAAACGGGTGAACGGATGAT-3′)和oligo-dG进行二次PCR。对结果正确的PCR产物进行测序。
所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提交上海英骏生物技术有限公司进行测序。
4、对斑节对虾细胞周期蛋白T基因的测定
所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为斑节对虾细胞周期蛋白T基因同源序列。
上述的斑节对虾细胞周期蛋白T基因编码的蛋白，所述的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示
该氨基酸序列以SEQ ID NO:1基因序列的15bp处的起始密码子ATG编码至3147bp处的终止密码子TAG，编码1044个氨基酸序列。
上述的斑节对虾细胞周期蛋白T在斑节对虾不同组织和发育各时期分布、表达。
提取健康的斑节对虾不同组织(包括肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、肠、***、胃)以及不同发育时期的卵巢的总RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa)操作手册进行反转录为cDNA模板。将不同组织样品cDNA稀释20倍作为模板，采用SYBR GreenⅠ染料法，在Roche荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析。依照TaKaRaPrimeScriptTM RTPCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行PCR反应。反应体系为10μL，包含5μL的2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix，3μL稀释的模板，各0.2μL正、反引物(10μmol/L)及1.6μL的双蒸水。每个时间点设置3个重复。反应参数为95℃预变性10s；然后95℃变性15s，60℃退火延伸20s，共45个循环。使用引物reT-F(5′-TTTAGATGCCGCAGTGTTAGAA-3′)和reT-R(5′-TTTGGCTCAGGAGGTTTACG-3′)扩增目标基因，rEF-F(5′-AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT-3′)和rEF-R(5′-CGTGGTGCATCTCCACAGACT-3′)扩增EF-1α基因作为内参，实验数据采用相对ΔCT法(2-ΔΔCT法)分析Pmcyclin T基因在斑节对虾各组织中的相对表达量。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：
1、本发明提供的基因不仅为研究斑节对虾细胞周期蛋白T在卵巢发育中的作用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的性腺发育参差不齐的情况从分子层面提供理论基础。
2、根本发明提供的基因序列设计dsRNA，然后进行对虾的活体注射，可有效促进对虾卵巢发育，细胞周期进程
3、本发明提供的重组蛋白可以在体外合成，可以作为催熟剂注射对虾，促进卵巢发育，细胞周期进程。
附图说明
图1是利用实时荧光定量PCR检测Pmcyclin T在斑节肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、肠、***、胃中的相对表达量。
图2利用实时荧光定量PCR检测mcyclin T卵巢发育各时期表达在Ⅰ期(卵原细胞期)、Ⅱ期(核染色质期)、Ⅲ期(周边核仁期)、Ⅳ期(卵黄囊期)、V期(成熟期)的相对表达量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围之内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。
本发明提供的斑节对虾细胞周期蛋白T基因，该基因序列如SEQ ID NO:1所示。
其制备方法如下：
1.总RNA的提取
试验所用的雌雄斑节对虾(鲜重200g左右)均取自于海南三亚，室内水族箱内暂养三天，水温控制在24～25℃之间。取所需组织约50mg用剪刀剪碎加入1ml的Trizol(美国invitrogen公司)进行匀浆，并按以下步骤提取总RNA。
总RNA提取步骤：
(1)加200μL预冷氯仿，涡旋振荡1min混匀，静置5min，12000g，4℃，15min。
(2)取三分之一上清溶液，加入等体积的预冷的异丙醇，颠倒混匀，冰上放置10min，12000g，4℃，10min。
(3)倒掉上清，加1mL 75％乙醇重悬沉淀，7500g，4℃离心5min。
(4)重复步骤3一次，并用枪头吸出上清，干燥5～10min
(5)加40μLddH2O溶解沉淀
(6)RNA的电泳检测：将电泳槽、梳齿等置于3％H2O2过夜浸泡，配置1.5％的琼脂糖凝胶(用0.5×TBE溶液配制)，取5μL总RNA加1μL上样缓冲液，进行30min电泳检测，对提取的RNA质量进行测定。
2.cDNA第一链的合成
cDNA的反转录实验按照相关试剂盒(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa))操作方法进行。
轻微混匀，70℃温育10min后冰浴2min，离心数秒后放回冰上
混和均匀并短暂离心；PCR仪42℃反应90min后，70℃，15min取出放置冰上，-20℃保存备用。
3.对斑节对虾细胞周期蛋白T基因cDNA全序列的克隆
以上述合成的第一链cDNA作为模板，用设计的RACE引物进行PCR扩增，在3’RACE中，利用Semi-nested(半巢式)PCR方法进行扩增反应，首先分别由T3SP 1与AP(接头引物：Adaptor primer)进行PCR对扩反应，所得产物进行100倍稀释后，取1μL作为模板，利用T3SP2和Adaptor primer进行PCR二次扩增。
(1)一扩PCR反应体系配方：10×Ex Taq Buffer 2.5μL；dNTP Mixture(2.5mM)2μL；T3SP1(10μM)1μL；Adaptor primer(10μM)1μL；Ex Taq(5U/μL)0.25μL；MgCL21.5μL；cDNA 1μL；ddH2O 15.75μL；Total 25μL。
一扩PCR实验的反应程序如下所示：
(2)二扩PCR反应体系配方：10×Ex Taq Buffer 2.5μL；dNTP Mixture(2.5mM)2μL；T3SP2(10μM)1μL；Adaptor primer(10μM)1μL；MgCL21.5μL；Ex Taq(5U/μL)0.25μL；稀释100倍的一扩PCR产物1μL；ddH2O 15.75μL；Total 25μL。
二扩PCR实验的反应程序如下所示：
所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提交上海英骏生物技术有限公司进行测序。
4.对斑节对虾细胞周期蛋白T基因的测定
所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为斑节对虾细胞周期蛋白T基因的同源序列。
5、斑节对虾细胞周期蛋白T的分布和表达
提取健康的斑节对虾不同组织(包括肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、肠、***、胃)以及不同发育时期的卵巢的总RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa)操作手册进行反转录为cDNA模板。将不同组织样品cDNA稀释20倍作为模板，采用SYBR GreenⅠ染料法，在Roche荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析。依照TaKaRaPrimeScriptTM RTPCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行PCR反应。反应体系为10μL，包含5μL的2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix，3μL稀释的模板，各0.2μL正、反引物(10μmol/L)及1.6μL的双蒸水。每个时间点设置3个重复。反应参数为95℃预变性10s；然后95℃变性15s，60℃退火延伸20s，共45个循环。使用引物reT-F(5′-TTTAGATGCCGCAGTGTTAGAA-3′)和reT-R(5′-TTTGGCTCAGGAGGTTTACG-3′)扩增目标基因，rEF-F(5′-AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT-3′)和rEF-R(5′-CGTGGTGCATCTCCACAGACT-3′)扩增EF-1α基因作为内参，实验数据采用相对ΔCT法(2-ΔΔCT法)分析Pmcyclin T基因在斑节对虾各组织中的相对表达量。
分别对斑节对虾的7种组织的样品和卵巢发育五期的样品进行RT-PCR实验，对RT-PCR反应结束后所得的溶解曲线进行分析发现，该曲线全部为单一峰，没有杂峰存在，说明此次实验成功，即实验没有被污染，没有非目标产物存在。利用相对CT法对实验进行分析发现，在样本虾种，周期蛋白T的mRNA在所测的卵巢、肝胰腺、胸神经、心、肠、血和脑中的表达各不相同，参阅图1；在卵巢内的表达量最高，在肝胰腺、脑、心、肠、***、胃中的表达量次之。通过单因子方差方法分析显示，不同组织中PmcyclinT的mRNA的表达差异明显，参阅图2。
运用统计学软件SPSS19.0进行相对独立的单因素方差分析，结果以平均值±标准差(x±S.E.)表示，P<0.05认为差异显著。
上述的斑节对虾细胞周期蛋白T基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示
该氨基酸序列以SEQ ID NO:1基因序列的15bp处的起始密码子ATG编码至3147bp处的终止密码子TAG，编码1044个氨基酸序列。具体编码氨基酸的基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
Claims (3)
1.斑节对虾细胞周期蛋白T基因，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的斑节对虾细胞周期蛋白T基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1或2所述的斑节对虾细胞周期蛋白T在斑节对虾不同组织和发育各时期分布与表达。
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