CN104630205B - 一种增强DNA聚合酶Dbh持续合成DNA能力的方法 - Google Patents

一种增强DNA聚合酶Dbh持续合成DNA能力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增强DNA聚合酶Dbh持续合成DNA能力的方法，属于酶工程领域。本发明利用柔性linker在Y‑家族聚合酶Dbh的N末端连接Sso7d组合成Sdbh蛋白来增强Dbh对聚合底物的亲和力，提高Dbh持续性合成能力。发明首先对Y家族DNA聚合酶Dbh基因进行克隆并构建Sso7d‑dbh融合蛋白，然后通过E.coli BL21菌株表达Dbh和Sdbh，并对纯化的Dbh和Sdbh进行聚合酶活性、持续合成能力评价及稳态动力学分析一系列的对比实验，最终证实Sso7d能够提高Dbh的持续合成能力。

Description

一种增强DNA聚合酶Dbh持续合成DNA能力的方法
技术领域
本发明涉及一种增强DNA聚合酶Dbh持续合成DNA能力的方法，属于酶工程领域。
背景技术
Y-家族DNA聚合酶Dbh是一类跨损伤合成聚合酶(TLS)，它能够代替复制性DNA聚合酶跨越模板损伤处使得DNA合成继续，从而帮助细胞抵抗DNA损害。但为了防止出现更多突变，跨越损伤后Dbh会被立即切除，正常的复制性聚合酶会恢复对DNA合成的控制，这就说明Dbh与DNA的结合是短暂的。Dbh的结构是典型的右手结构，分为拇指(thumb)、手掌(palm)、手指(finger)、小手指(little-finger)四个结构域，相比其它DNA聚合酶，Dbh的手指域很小，导致与新生碱基对的大沟几乎没有接触，另外它的拇指域短而粗，使得Dbh与DNA及掺入核苷具有较少的作用，总的来说，Dbh对其DNA底物施加的约束很少。它的结构特点和功能要求决定了Dbh有着较低的持续合成能力。结构的特异性表明，提高聚合酶对DNA底物的亲和力是提高Y-家族聚合酶持续合成能力的有效途径。
复制性DNA聚合酶大多通过与被称为“DNA滑动夹”的环形蛋白质相互作用实现其较高的持续合成能力，这种环形蛋白质能环绕DNA将聚合酶催化单元连接到DNA上，根据这一认识，曾对Y-家族聚合酶进行过相应改造，将硫化叶菌DNA聚合酶IV(Dpo4)与真核细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)亚基1和2组成复合物，将Dbh与PCNA亚基1组成复合物。最终结果表明，Dpo4和Dbh都表现出持续合成能力的相应提高，然而，环绕DNA模板的环形滑动夹由个于存在空间位阻，在某种程度上阻止聚合酶与引物-模板接合点的结合，所以提高的持续合成能力也是极其有限的。
本发明通过融合Sso7d来提高Dbh的持续合成能力。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种增强DNA聚合酶Dbh持续合成DNA能力的方法，利用柔性linker在Y-家族聚合酶Dbh的N末端连接蛋白Sso7d来增强Dbh对聚合底物的亲和力，从而提高Dbh持续合成能力。该方法还可以用来提高Y家族其他DNA聚合酶的持续合成DNA的能力。
在本发明的一种实施方式中，编码所述DNA聚合酶Dbh的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述Sso7d蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述N末端连接了Sso7d的Dbh的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述柔性linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种持续合成DNA能力增强的DNA聚合酶Dbh，是在其N端通过柔性linker连接了蛋白Sso7d。
在本发明的一种实施方式中，编码所述DNA聚合酶Dbh的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述Sso7d蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述N末端连接了Sso7d的Dbh的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述柔性linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供一种获得所述持续合成DNA能力增强的DNA聚合酶Dbh的方法，主要包括以下步骤：合成编码DNA聚合酶Dbh的核苷酸序列，并在C末端附加6个组氨酸作为标签；合成编码Sso7d的核苷酸序列，以柔性linker将Sso7d连接到Dbh的N末端，以载体pSV2-DHFR携带编码连接了Sso7d的Dbh的基因，转化大肠杆菌进行表达，分离纯化得到连接了Sso7d的Dbh。
本发明成功表达、纯化了Sso7d融合的Y-家族DNA聚合酶Dbh，即Sdbh，以及天然的Dbh，聚合酶活性、持续合成能力评价和稳态动力学分析的结果表明，Sdbh对DNA底物的亲和力、DNA持续合成能力均增强了。本发明改造后的Dbh以及携带该酶的试剂盒将对基因工程的操作产生重要积极作用。
附图说明
图1Dbh和Sso7d及DNA复合物的带状图。
图2纯化各阶段Dbh和Sdbh等分试样的纯化；1：Marker，2：含有Sdbh的整个细胞提取物，3：含Sdbh可溶细胞提取物78℃加热12min后的上清，4：结合了Sdbh的Ni柱清洗缓冲液，5：Superdex 75凝胶过滤和Monos色谱后的Sdbh成分，6：Superdex 75凝胶过滤和Monos色谱后的Dbh成分，7：结合了Dbh的Ni柱清洗缓冲液，8：含Dbh可溶细胞提取物78℃加热12min后的上清，9：含有Dbh的整个细胞提取物。
图3Dbh和Sdbh持续合成能力。
具体实施方式
以下是Sdbh和Dbh蛋白表达纯化及相关聚合酶活性、持续合成能力评价和稳态动力学分析的具体实施例。
实施例1 Dbh和Sdbh基因的克隆
通过IDT公司合成Dbh基因序列(SEQ ID NO.1)，并在其C末端附加6个组氨酸作为标签，目标基因利用引物Fdbh和Rdbh进行PCR扩增，包含有T7启动子、核糖结合位点、T7终止子以及氨苄抗性的pSV2-DHFR载体作为目标基因的高拷贝克隆载体，利用T4DNA连接酶将Dbh基因克隆在质粒pSV2-DHFR的NdeI和BamHI位点的重组载体DHFR-dbh；重组后的DHFR-dbh基因被转化进入感受态细胞并进行DNA测序验证。
根据发布的Sso7d氨基酸序列合成其基因序列，根据Gibson Assembly方法利用柔性linker(SEQ ID NO.4)将Sso7d(SEQ ID NO.2)连接到Dbh的N末端，利用引物Fdpo-linker、Rdpo-dhfr、Fsso-dhfr、Rsso-linker进行PCR扩增从而将Dbh、linker、Sso7d三个片段的基因组合在一起，组合的基因片段被NdeI和BamHI限制酶处理使其线性化，提取完整的重组质粒DHFR-Sdbh并用DNA测序进行验证。
表1.引物序列
实施例2 Dbh和Sdbh蛋白的表达和纯化
构建好的质粒DHFR-dbh和DHFR-sdbh转化进入E.coli BL21菌株表达，利用组氨酸标签，通过镍-次氨基三乙酸渗透和Mono-S色谱法纯化Dbh和Sdbh至电泳均一性。纯化后的Dbh和Sdbh小样品-80℃保存在50mM Tris-HCl缓冲液中(pH 7.7at 22℃)，该缓冲液含有50mM NaCl，1mM二硫苏糖醇和50％甘油(v/v)。
由于Sso7d和Dbh之间空间位阻的限制，会阻止Sso7d与模板DNA的相互作用，我们使用结构导向方法设计了适当的linker。使用已有的Dbh和Sso7d三维结构，我们模拟了Sdbh与DNA的二元配合物。一个柔性linker SS(GGGGS)3GM被设计用来将Sso7d连接到Dbh序列上的手掌域(图1)。Sso7d远离Dbh的空间结构的活性部位，并推测会轻微改变Dbh的原始构象。柔性linker被推测具有柔性(由于小的，非极性氨基酸(Gly))以及与水良好的相互作用(由于Ser)。Sdbh和Dbh的表达纯化(图2)。
实施例3 聚合酶活性评价
12.5nM的退火好的引物/模板添加到反应缓冲液(10mMHEPES NaOH(pH7.4)，50mMNaCl，10mM MgCl2，200mMdNTPs，1mM DTT，100μg/ml BSA和0.1％的Triton X-100)。加入12.5nM的DNA聚合酶在37℃起始DNA合成。在不同时间点取1μL样品添加到99μL以1:200稀释的PicoGreen(分子探针)中，在TE缓冲液(10mMTris-Hcl pH为8.0和1mMEDTA)反应。合成的DNA的量使用H1混合多功能协同酶标仪进行定量(美国伯腾仪器)。通过比较它们与Dbh的初始速率确定DNA聚合酶的单位活性。
实施例4 聚合酶持续合成能力评价
恒定浓度(30nM)的退火好的荧光标记引物/模板添加到反应缓冲液(10mMHEPESNaOH(pH7.4)，50mMNaCl，10mMMgCl2，200mMdNTPs，1mM DTT，100μg/ml BSA和0.1％的TritonX-100)。添加不同浓度的DNA聚合酶(从5到1000nM，如图3)在37℃启动DNA的合成。孵育5min后，加入10μL右旋糖苷终止反应，反应产物在100℃变性5分钟，简短置冰。反应混合物在10％尿素TBE PAGE分离(Bio-Rad)再由Typhoon9400扫描仪可视化。
结果如图3所示：由Dbh和Sdbh合成的复制产物的长度分布表明Sso7d提高持续合成能力。在实验中，退火后的引物/模板浓度(P/T)固定在12.5nM，酶的变化范围从0到1μM；当酶量高于P/T量(P/T量80倍的酶)时，Dbh合成了长度上大约一千个核苷酸的复制产物(图3)；当酶与P/T的量相同时，复制产物长度为140nt；当酶量低于P/T量(酶量2.5倍的P/T量)时，只有一小部分的FAM标记的引物延伸10bp(注：延伸引物为36nt，但FAM标签改变其电泳迁移率，使得它在10％Urea-TBE-PAGE中迁移到80nt处)。在相同的实验条件下，添加过量摩尔的Sdbh(P/T量80倍的酶)并没有显著改变环形M13模板复制产物的长度分布，但是在200nt-300nt长度的复制产物比Dbh合成的多。
此外，当酶和DNA以相同的化学计量比存在时，对比Dbh，Sdbh持续合成的核苷酸数从140增加到300个，当DNA比酶过量时，持续合成的核苷酸数从90个增加达到160个。基于这些观察，可以确定每次的结合活动Sdbh可以延伸约160个核苷酸长度，而Dbh只延伸90个核苷酸长度。Sso7d作为一个持续合成因子，在Dbh中能帮助LF域和拇指域包围DNA从而提高Dbh对引物末端的亲和力。
实施例5 稳态动力学分析
稳态动力学分析使用修改的聚合酶活性测定方法进行测定。在缓冲液(10mMHEPESNaOH(pH7.4)，50mM NaCl，10mM MgCl2，200mM dNTPs，1mM DTT，100μg/ml BSA和0.1％的Triton X-100)中含有12.5nM的酶和为12.5-125nM预退火ssM13。每个反应的初始速率根据引物-模板浓度和下面的公式计算：
V表示初始速率，[D]表示引物和模板浓度，[E]表示酶的浓度，Kcat表示逆向速率，Km(DNA)表示达到最大酶活一半时模板-引物的浓度。
结果：与Dbh相比，Sdbh表现出聚合酶催化速率的增加，这表明融合了Sso7d的Y家族聚合酶可以在不影响聚合酶催化活性的前提下提高聚合酶的持续合成能力。
表2.稳定动力学分析
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种增强DNA聚合酶Dbh持续合成DNA能力的方法，其特征在于，利用柔性linker在Dbh的N末端连接蛋白Sso7d；编码所述柔性linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码所述Sso7d蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述DNA聚合酶Dbh的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述N末端连接了Sso7d的DNA聚合酶Dbh的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
2.一种持续合成DNA能力增强的DNA聚合酶Dbh，其特征在于，其N端通过柔性linker连接了蛋白Sso7d；编码所述Sso7d蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述柔性linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码所述N末端连接了Sso7d的DNA聚合酶Dbh的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种获得权利要求2所述持续合成DNA能力增强的DNA聚合酶Dbh的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：合成编码DNA聚合酶Dbh的核苷酸序列，并在C末端附加6个组氨酸作为标签；合成编码Sso7d的核苷酸序列，以柔性linker将Sso7d连接到Dbh的N末端，以载体pSV2-DHFR携带编码连接了Sso7d的Dbh的基因，转化大肠杆菌进行表达，分离纯化得到连接了Sso7d的Dbh。
4.含有如SEQ ID NO.3所示的编码N末端连接了Sso7d的DNA聚合酶Dbh的核苷酸序列的载体或重组细胞。
5.含有权利要求2所述DNA聚合酶Dbh的试剂盒。
6.权利要求2所述DNA聚合酶Dbh在DNA复制中的应用。
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