CN104620914B - 一种三叶青抗病促生的生物防治方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三叶青抗病促生的生物防治方法，包括：将枯草芽孢杆菌制成密度109～1010cfu/mL的高密度菌悬液；将三叶青健康枝条剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施枯草芽孢杆菌高密度菌悬液，经发酵后得到能有效抑制杀灭三叶青病理真菌的生物肥，将该生物肥用在三叶青抗病促生上。本发明中，产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌是对三叶青起抗病促生作用的植物益生菌，将其加入堆肥中，显著加强对三叶青病害真菌的生物防治作用，并提高三叶青产量。堆肥过程处理简便，无废水排放，投资少、能耗低、易操作，易于工业化大规模生产，具有良好的经济效益和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物防治肥的制备领域，具体涉及一种三叶青抗病促生的生物防治方法。
背景技术
三叶青正名三叶崖爬藤(学名：Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)，又名金线吊葫芦、蛇附子、石老鼠，属鼠李目，葡萄科草质藤本。全草均可入药，以地下块根和果实的药用效果最好。三叶青每年5月份开花至秋季未结果，花期较长，果实为绿豆般大小，色泽鲜红艳丽，味甘、性凉，具有滋补功效，属极品。分布于浙江、江西、福建、湖北、湖南、广东、广西、四川等地区。
危害三叶青主要病害是叶斑病，链格孢(Alternaria alternata)是主要病原菌之一。植物病理真菌主要存在于土壤中，在植物生长中感染植物，引起植物病害、造成生产损失。因此，要从生物防治的角度消除植物真菌病害，除了杀灭植株上的病理真菌，杀灭或抑制土壤中的病理真菌也至关重要，而使用具有生物防治功效的生物肥是实现这一目的的有效途径。在各种生物肥中，长久以来我国应用的都是无芽孢菌类。但是无芽孢菌抗逆性低，对于干燥高温的抵抗能力差，所以当制成液体或者吸附剂时稳定性不高。生物肥发展的新趋势应是大力发展抗逆性高、能够长期稳定生存的芽孢杆菌。特别是芽孢杆菌能够产生多种抗真菌物质，对植物病原菌有显著抑制作用，并且对人畜无害，也不会污染环境，将在防治植物真菌病害中起重要作用。
芽孢杆菌形态上呈直或者近直的杆状，好氧或者兼性厌氧，革兰氏阳性，在特定环境条件下能产生抗逆性内生孢子。芽孢杆菌在植物中广泛定殖，被认为是公认的食品级安全微生物(generally regarded as safety,GRAS)。枯草芽抱杆菌是一种典型的芽孢杆菌，产生抗菌蛋白、多肽类物质、脂类物质及beta葡聚糖酶等抗菌物质，特别是beta葡聚糖酶等水解酶类与其抗植物病理真菌能力有密切关系，因为真菌细胞壁的组成是葡聚糖。
发明内容
本发明提供了一种三叶青抗病促生的生物防治法，通过将产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)融入三叶青天然菌群中，制成能够通过生物防治途径有效抑制杀灭三叶青病理真菌的生物肥。
一种三叶青抗病促生的生物防治方法，包括以下步骤：
1)将枯草芽孢杆菌(CICC 10339)进行培养，制成密度109～1010cfu/mL的高密度菌悬液；
2)将三叶青健康枝条剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，堆肥结束后进行发酵，经发酵后得到能有效抑制杀灭三叶青病理真菌的生物肥，将该生物肥用在三叶青抗病促生上。
本发明中，将三叶青健康枝条剪成小节堆肥，使所制备生物肥中的菌群即为健康三叶青植株本身天然菌群，此菌群与三叶青植株协同进化生长，形成了互益共生体系，对病害真菌有一定生物防治作用。进一步地，将能够产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)加入堆肥中，显著加强对三叶青病害真菌的生物防治作用。枯草芽孢杆菌(CICC 10339)由于产beta葡聚糖酶，对三叶青植株纤维有良好分解作用，为堆肥发酵过程所必须，故能够充分融入到堆肥菌群中稳定持久地增殖。如同乳酸菌对于动物的益生作用，抑制杀灭植物病理真菌的微生物可以称之为植物益生菌。本发明所制备生物肥中，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)即是三叶青益生菌，对三叶青病理真菌有显著生物防治作用。
步骤1)中，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)采用现有技术，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼；保藏日期为2007年，菌种保持编号为10339。枯草芽孢杆菌(CICC 10339)可以向中国工业微生物菌种保藏管理中心购买。
将枯草芽孢杆菌(CICC 10339)进行培养，包括：枯草芽孢杆菌(CICC10339)的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为1％～5％，33℃～39℃振荡培养20～28h，至菌液密度为109～1010cfu/mL的高密度菌悬液。
进一步优选，将枯草芽孢杆菌(CICC 10339)进行培养，包括：枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为2％～3％，36℃～37℃振荡培养22～26h，至菌液密度为109～1010cfu/mL的高密度菌悬液。
所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：
进一步优选，所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：
液体培养基在121℃灭菌20min。
步骤2)中，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到30℃～34℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到41℃～45℃时堆肥结束。
堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到32℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到43℃时堆肥结束。
步骤2)中，堆肥结束后，将堆肥搅拌摊凉。所述的发酵采用自然状态下发酵。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明中，将三叶青健康枝条剪成小节堆肥，使所制备生物肥中的菌群即为健康三叶青植株本身天然菌群，此菌群与三叶青植株协同进化生长，形成了互益共生体系，对病害真菌有一定生物防治作用。
枯草芽孢杆菌(CICC 10339)产beta葡聚糖酶，强力破坏病理真菌细胞壁，对病理真菌有显著抑制杀灭作用。如同乳酸菌对于动物的益生作用，抑制杀灭植物病理真菌的微生物可以称之为植物益生菌。本发明所制备生物肥中富含的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)即是三叶青益生菌，对三叶青病理真菌有显著生物防治作用。
堆肥过程在自然状态下进行，依靠微生态稳定的三叶青植株天然菌群进行发酵，而枯草芽孢杆菌(CICC 10339)由于产beta葡聚糖酶，对三叶青植株纤维有良好分解作用，为堆肥发酵过程所必须，因此，枯草芽孢杆菌(CICC10339)能够充分融入到堆肥菌群中稳定持久地增殖。堆肥过程处理简便，无废水排放，投资少、能耗低、易操作，易于工业化大规模生产，具有良好的经济效益和广阔的应用前景。
具体实施方式
实施例1
1)产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的高密度培养，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的出发密度为1.06×106个/mL，接种至液体培养基(葡萄糖14g/L、牛肉膏25g/L、磷酸二氢钾2.45g/L、花生饼粉10g/L，pH＝7.0，121℃灭菌20min)中，接种量为2％，37℃振荡培养24h，菌液密度为2.25×109cfu/mL，得到高密度菌悬液。
2)将三叶青健康枝条共100kg剪成小节进行自然堆肥，在堆肥内部温度达到32℃时喷施1)中制备得到的高密度菌悬液2L，继续堆肥，待堆肥内部温度超过43℃时堆肥结束，搅拌摊凉，自然状态下后发酵，成为富含产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌的生物肥，即能有效抑制杀灭三叶青病理真菌的生物肥。
3)步骤1)中制备得到的高密度菌悬液及步骤2)中制备得到的生物肥显著具有Beta葡聚糖酶活力，对三叶青病理真菌具有显著抑制杀灭作用，具体见下表1。
链格孢(Alternaria alternata)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，菌种编号为2465。
Beta葡聚糖酶活力测定：采用还原糖测定法，Beta葡聚糖酶能够将Beta葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色深浅与还原糖生成量成正比，而还原糖生成量又与反应液Beta葡聚酶活力成正比，从而利用比色测定反应液的吸光值计算还原糖生成量，得到Beta葡聚糖酶活力。Beta葡聚酶活力单位定义：在测定条件下，每分钟水解Beta葡聚糖产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量，定义为一个酶活单位(IU)。
平板抑制抑菌宽带：采用平板喷雾法，待测菌株点接在NA平板，每平板2株，各3个重复，28℃培养24h，把蘸有氯仿的滤纸片放进倒置的培养皿底部熏蒸20min，重复一次，杀死待测菌；将病原真菌配成108菌悬液，用无菌喉头喷雾器迅速将其喷在接有待测菌的平板上(0.1ml/皿)，28℃继续培养48-60h后，记录形成抑菌圈大小。
平板拮抗：将NA培养基倒入平板，凝固后在培养基上成三角放置牛津杯，向牛津杯内加入发酵液100μL，28℃温箱培养，待病原真菌生长后记录抑菌圈大小。
表1
注：抑菌宽带指抑菌半径与待测菌落半径之差，-：表示无抑菌带；+：表示抑菌宽带<5mm；++表示抑菌宽带>5mm。
实施例2
1)产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的高密度培养，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的出发密度为1.88×106个/mL，接种至液体培养基(葡萄糖14g/L、牛肉膏25g/L、磷酸二氢钾2.45g/L、花生饼粉10g/L，pH＝7.0，121℃灭菌20min)中，接种量为3％，37℃振荡培养24h，菌液密度为3.56×109cfu/mL，得到高密度菌悬液。
2)将三叶青健康枝条共100kg剪成小节进行自然堆肥，在堆肥内部温度达到32℃时喷施1)中制备得到的高密度菌悬液3L，继续堆肥，待堆肥内部温度超过43℃时堆肥结束，搅拌摊凉，自然状态下后发酵，成为富含产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌的生物肥。
3)步骤1)中制备得到的高密度菌悬液及步骤2)中制备得到的生物肥显著具有Beta葡聚糖酶活力，对三叶青病理真菌具有显著抑制杀灭作用，具体见下表2。
表2
注：抑菌宽带指抑菌半径与待测菌落半径之差，-：表示无抑菌带；+：表示抑菌宽带<5mm；++表示抑菌宽带>5mm。
实施例3
1)产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的高密度培养，枯草芽孢杆菌(CICC 10339)的出发密度为1.76×106个/mL，接种至液体培养基(葡萄糖14g/L、牛肉膏25g/L、磷酸二氢钾2.45g/L、花生饼粉10g/L，pH＝7.0，121℃灭菌20min)中，接种量为3％，37℃振荡培养24h，菌液密度为2.25×109cfu/mL，得到高密度菌悬液。
2)将三叶青健康枝条共100kg剪成小节进行自然堆肥，在堆肥内部温度达到32℃时喷施1)中制备得到的高密度菌悬液3L，继续堆肥，待堆肥内部温度超过43℃时堆肥结束，搅拌摊凉，自然状态下后发酵，成为富含产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌的生物肥。
3)步骤2)中制备得到的生物肥对三叶青具有明显促生益生作用，提高单株块根产量16.5％(p<0.05)，具体见下表3和表4。三叶青植株为采自浙江省丽水地区的野生型。
表3
表4
Claims (9)
1.一种三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将枯草芽孢杆菌CICC 10339进行培养，制成密度109～1010cfu/mL的高密度菌悬液；
2)将三叶青健康枝条剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，堆肥结束后进行发酵，经发酵后得到能有效抑制杀灭三叶青病理真菌的生物肥，将该生物肥用在三叶青抗病促生上。
2.根据权利要求1所述的三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，步骤1)中，将枯草芽孢杆菌CICC 10339进行培养，包括：枯草芽孢杆菌CICC 10339的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为1％～5％，33℃～39℃振荡培养20～28h，至菌液密度为109～1010cfu/mL的高密度菌悬液。
3.根据权利要求2所述的三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，步骤1)中，将枯草芽孢杆菌CICC 10339进行培养，包括：枯草芽孢杆菌CICC 10339的出发密度为106～107个/mL，接种至液体培养基中接种量为2％～3％，36℃～37℃振荡培养22～26h，至菌液密度为109～1010cfu/mL的高密度菌悬液。
4.根据权利要求2或3所述的三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：
调节pH＝6.5～7.5。
5.根据权利要求4所述的三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：
调节pH＝7.0。
6.根据权利要求1所述的三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，步骤2)中，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到30℃～34℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到41℃～45℃时堆肥结束。
7.根据权利要求6所述的三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，步骤2)中，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到32℃时，喷施步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到43℃时堆肥结束。
8.根据权利要求1所述的三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，步骤2)中，堆肥结束后，将堆肥搅拌摊凉。
9.根据权利要求1所述的三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，步骤2)中，所述的发酵采用自然状态下发酵。
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