CN104611289A - 自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品 - Google Patents
自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104611289A CN104611289A CN201510014832.3A CN201510014832A CN104611289A CN 104611289 A CN104611289 A CN 104611289A CN 201510014832 A CN201510014832 A CN 201510014832A CN 104611289 A CN104611289 A CN 104611289A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- autologous
- skin
- inoblast
- minutes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备的方法，其中，所述方法包括通过从自体皮肤中获取表皮细胞和培养得到成纤维细胞；本发明还提供了含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，其中，所述产品包括将其中一种或两种细胞添加到自体外周血富含血小板的血浆中，同时可以添加营养因子，生产出含自体活细胞的生物美容产品，可用于白癜风祛斑、疤痕修复、皮肤祛皱以及除斑等美容作用。
Description
技术领域
本发明涉及自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备的方法以及通过所述方法获得的生物美容产品。特别地，本发明涉及通过从自体皮肤中获取表皮细胞和培养得到成纤维细胞，将其中一种或两种细胞添加到自体外周血富含血小板的血浆中，同时还可以添加营养因子，生产出含自体活细胞的生物美容产品，本发明的生物美容产品可用于白癜风祛斑、疤痕修复、皮肤祛皱以及除斑等美容作用。
背景技术
日前，市场上已经出现了各种细胞用于美容方面的产品，也被商家赋予了各种神奇的功效和希望，尤其是干细胞在美容方面的应用。事实上，活细胞在医学美容的应用上取得一些很好的效果，主要体现在皱纹填充、祛斑等方面起到一定作用。但是现在市场上应用的活细胞多数都为同源异体的，进入皮肤内容易发生免疫排斥而被清除，因而在皮肤中发挥作用的细胞微乎其微。
细胞生长因子也是一直受追捧的美容方法，出现很多细胞生长因子被应用到美容中，包括干细胞因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、神经生长因子及纤维母细胞生长因子等。各种细胞因子需要在低温条件下保存，以保持其蛋白活性。然而在化妆品制作过程中，由于无法保证整个生产过程均处在低温条件下，那么添加该产品极易造成细胞因子的失活和变性，从而失去细胞因子对组织和细胞的修复活性。同时，细胞因子加入到化妆品中，其有效浓度必然被降低，不能保证细胞因子对细胞核组织的修复效果。消费者在使用过程中很难对该产品进行定量使用，可能会造成效果不稳定的现象。
另外，羊胎素和肉毒杆菌内毒素作为目前备受消费者青睐的产品，因其使用简便、效果显著、安全可靠而广受欢迎。但它们使用后的副反应较多，常见的有表情不自然、畏光流泪、局部肿胀、淤斑、注射部位麻木、头痛、额部紧绷感、邻近部位皱纹加深等。这两种因子应用易产生较明显的依赖性，随着注射的次数增多，人对其的敏感性降低，而导致病人使用该方法更为频繁，每次的使用量也会逐渐增多。
综上，因为各种原因和问题，目前市场上生物美容产品存在各种效果不佳，对人们的皮肤美容的疗效还远远不够，即使其中加入各种营养成分。本发明利用个体化的材料和营养物质，发挥其细胞生物学活性和自分泌营养因子的功能，将对消费者的美容效果达到更佳的美容作用，并且联合美容物理疗法将产生更好的白癜风祛斑、疤痕修复、皮肤祛皱以及除斑等效果。
发明内容
本发明是我们研发团队通过多年的科研工作，发现了能从自体皮肤中获得表皮细胞和成纤维细胞，通过体外体内实验证实这两种细胞对皮肤产生更好地白癜风祛斑、疤痕修复、皮肤祛皱以及除斑等作用。本发明利用自体皮肤来源的表皮细胞和成纤维细胞的生物学作用，可以高效产生皮肤美容作用，而且联合美容物理疗法将产生更好功效。本发明中的表皮细胞是成对存在，中间的孔隙中气孔，可以进行气体交换，细胞内有叶绿体，对皮肤起重要保护作用。
本发明中成纤维细胞是皮肤真皮中的主体细胞成分，其分泌的胶原纤维，弹性纤维及基质成分，与成纤维细胞一同构成了真皮的主体。尽管很多化妆品公司和美容医生声称非介入的美容方法能达到使皮肤皱纹消失的效果，但科学研究表示这一方法的效果是有限的。皮肤衰老反映在细胞水平即为细胞衰老。当紫外线和其他外界环境能刺激成纤维母细胞，上调胶原酶的基因表达，从而使胶原酶生成增多，这导致了胶原蛋白被降解，水分流失，皮肤组织失去支撑，皱纹和黄斑即生成。
本发明提供了自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备的方法，其中，所述方法包括通过从自体皮肤中获取表皮细胞和培养得到成纤维细胞。
本发明所述的自体表皮细胞由自体皮肤经酶消化法和机械法直接获得表皮单细胞悬液，减去了中间复杂的过程，并保证了表皮细胞的活性和数量。获得的表皮细胞经western blotting蛋白质表达检测，其高表达特异高表达表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)。
同时，本发明所述的自体成纤维细胞由同一皮肤的真皮经酶消化法和机械法获得细胞悬液后，在体外培养条件下获得足量的成纤维细胞，并westernblotting蛋白质表达检测特异高表达成纤维生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)。
本发明所述的自体皮肤来源于耳后取皮、眼袋割除后皮肤、手臂取皮和腿上取皮等，优选地，选择耳后取皮。
本发明还提供了含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，其中，所述产品包括将其中一种或两种细胞添加到自体外周血富含血小板的血浆中，同时可以添加营养因子，生产出含自体活细胞的生物美容产品。
本发明所述的自体富含血小板血浆是通过采集抗凝外周血两次离心获得的富含血小板的血浆，其富含各种生长因子，其中成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子与血管内皮生长因子等。
含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品主要由如下成分组成：
1)1-20×106自体表皮细胞和/或成纤维细胞；
2)1-50ml自体富含血小板血浆；
3)任选的10ng-1ug营养因子；
生物美容制剂装入10ml无菌的塑料针管中，可用盖子密封包装，形成产品。
该生物美容制剂保存在4℃条件下，保质期为48小时。
本发明所述的一种或两种自体表皮细胞和/或成纤维细胞，优选地包括加入自体表皮细胞和成纤维细胞两种细胞。
本发明所述的营养因子，即为超氧化歧化酶、灵芝多糖、胎盘提取多肽素和银杏叶提取液等，优选地，含有两种以上。
通过本发明的方法，通过自体皮肤获取的表皮细胞和/或成纤维细胞，加入到自体外周血来源的富含血小板血浆，优选添加一种或多种皮肤营养因子，制备成生物美容产品。由本发明提供的方法得到含有自体皮肤获取的表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，能够对白癜风祛斑、皮肤疤痕修复、皮肤祛皱以及除斑等功能。特别当联合物理美容疗法使用时，将产生更佳的美容疗效，即白癜风磨削术、高温深蓝射频美容疗法、微针疗法等，能打开表皮毛孔或微创表皮皮层，为营养因子和细胞进入皮肤的通道，有助于皮肤的再生增殖。
附图说明
图1表示由实施例2所制备的成纤维细胞在倒置显微镜下观察的生长图片。
图2表示由实施例3制备的自体成纤维细胞表达成纤维细胞生长因子Westem Blotting图片。
图3表示1名女性经由实施例5所制备的自体表皮细胞和成纤维细胞的生物美容产品治疗后腿部白癜风改善的图片。
具体实施方式
本发明提供了自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备的方法，其中，所述方法包括通过从自体皮肤中获取表皮细胞和培养得到成纤维细胞。
所述自体表皮细胞由取人0.1-2cm2皮肤，用1×磷酸盐缓冲液(PBS，pH值7.4，含100活性单位/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素)5ml浸润15分钟，用1ml移液枪吸弃，再用1×PBS(pH值7.4，含100活性单位/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素)同样反复中洗，洗涤后用disperse II消化，放置4℃冰箱过夜，第二天取出皮肤用镊子将表皮和真皮撕开。
表皮用眼科剪刀剪碎至1mm3左右，用1×PBS洗涤后加入到15ml离心管中，1000转每分种离心5分钟后弃上清，加入3ml 0.25％(质量体积比)胰酶消化1-60分钟，其中胰酶含质量体积比0.01％EDTA；消化后过40μm细胞筛，过滤后加入5-10ml 1×PBS，经1000转每分钟离心10分钟得到细胞沉淀，再次5-15ml 1×PBS重悬后，经1000转每分钟离心10分钟获得表皮细胞沉淀，加1-5ml 0.9％生理盐水重悬，苔盘兰计数，得到的107-108表皮细胞放置4℃冰箱存放备用。获得的表皮细胞经western blotting蛋白质检测表皮细胞生长因子表达水平，经灰度分析结果显示其灰度值达到9000以上。
获得的表皮细胞经western blotting蛋白质检测，其高表达表皮细胞生长因子。本发明的制造方法中对表皮细胞进行冻存，冻存液优选为90％胎牛血清和10％二甲基亚砜。复苏后培养的表皮细胞仍高表达EGF。
所述自体成纤维细胞由上述获得真皮用眼科剪刀剪碎至1mm3左右，用1×PBS洗涤后加入到15ml离心管中，1000转每分种离心5分钟后弃上清，加入3ml 0.25％胰酶消化1-60分钟，消化后过40μm细胞筛，过滤后加入5-10ml1×PBS，经1000转每分钟离心10分钟得到单细胞沉淀，再次5-15ml 1×PBS重悬后，经1000转每分钟离心10分钟获得单细胞沉淀，加入α-MEM培养基重悬，苔盘兰计数，用α-MEM培养基(含1-10％胎牛血清、1-100ng/ml重组人干细胞生长因子、1-50ng/ml重组人表皮生长因子和1-50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)按1-10×106细胞/ml加入10-20ml到75cm2培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养；每隔2天更换一次新鲜培养液；
成纤维细胞在75cm2培养瓶中生长融合达到90％以上，用5ml移液管吸弃培养液，加入0.5ml 0.25％胰酶消化后1000转每分钟离心5分钟收集成纤维细胞；用5ml移液管加入10ml新鲜的α-MEM培养基(含1-10％胎牛血清、1-100ng/ml重组人干细胞生长因子、1-50ng/ml重组人表皮生长因子和1-50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)，加入到75cm2培养瓶中继续在37℃，5％CO2培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液；如此连续传代1-5代培养经胰酶消化离心后，获得4×107以上的成纤维细胞，用4-10ml生理盐水重悬，计数，即获得成纤维细胞，放置冰箱4℃存放备用。
获得的成纤维细胞经western blotting蛋白质检测成纤维生长因子表达水平，经灰度分析结果显示其灰度值达到12000以上。本发明的制造方法中对成纤维细胞进行冻存，冻存液优选为50％小牛血清、40％成纤维细胞培养液和10％二甲基亚砜，其中细胞培养液更优选为成纤维细胞培养液。复苏后培养的成纤维细胞仍高表达FGF。
本发明所述的自体皮肤来源于耳后取皮、眼袋割除后皮肤、手臂取皮和腿上取皮等，优选地，选择耳后取皮。
本发明还提供了含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，其中，所述产品包括将其中一种或两种细胞添加到自体外周血富含血小板的血浆中，优选同时可以添加营养因子，生产出含自体活细胞的生物美容产品。
所述自体血浆由抽取人50-100ml肝素或EDTA抗凝外周血，经1000转每分钟离心10分钟得到的10-40ml血浆，再次3000转每分钟离心10分钟获得10-40ml富含血小板血浆，放置4℃冰箱存放备用。
取1-10×106自体表皮细胞和/或成纤维细胞，加入到5ml自体富含血小板的血浆中，混匀，优选同时还可以加入10ng-1ug营养因子，装入10ml无菌可密封的针管中，制备成含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，放置冰箱4℃中保存，保质期为48小时。
含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品主要由如下成分组成：
1)1-20×106自体表皮细胞和/或成纤维细胞；
2)1-50ml自体富含血小板血浆；
3)任选的10ng-1ug营养因子；
生物美容制剂装入10ml无菌的塑料针管中，可用盖子密封包装，形成产品。
该生物美容制剂保存在4℃条件下，保质期为48小时。
根据本发明所述的含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，其特征在于，所述的一种或两种自体表皮细胞和/或成纤维细胞，优选地包括加入自体表皮细胞和成纤维细胞两种细胞。
根据本发明所述的含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，其特征在于，优选地，添加了一种或一种以上营养因子，即为超氧化歧化酶、灵芝多糖、胎盘提取多肽素和银杏叶提取液等，更优选地，含有两种以上。
本发明提供了含自体表皮细胞和/或成纤维细胞、自体富含血小板血浆和营养因子的生物美容产品，能够对对白癜风祛斑、皮肤疤痕修复、皮肤祛皱以及除斑等功能。本发明还提供了联合物理美容疗法使用，即白癜风磨削术、高温深蓝射频美容疗法、微针疗法等，能打开表皮毛孔或微创表皮皮层，为营养因子和细胞进入皮肤的通道将产生，更佳的美容疗效。与白癜风磨削术联合美容具体方法如下：
白癜风患者躺卧在手术台上，使用白癜风皮肤进行清洁，清水擦洗干净；麻醉达成后，以皮肤磨削机磨削创面达点状渗血，尽可能使皮肤磨削厚度均匀一致，肾上腺素盐水纱布等合适止血后，将本发明的6ml含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品涂抹在皮肤磨削机磨削创面，纳米银敷料覆盖，无菌敷料包扎固定，注意适当加压。
患者减少局部活动，患肢抬高，红外线照射，减少分泌物渗出。术后第3～5天打开外层敷料，保持干燥，直至敷料脱落。创面愈合后应用胶原美皮护、抗瘢痕药物、弹力绷带等综合抗瘢痕治疗，预防瘢痕增生。
以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。
实施例1 人自体表皮细胞的制备
由取人0.1-2cm2皮肤，用1×磷酸盐缓冲液(PBS，pH值7.4，含100IU/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素)5ml浸润15分钟，用1ml移液枪吸弃，再用1×PBS(pH值7.4，含100IU/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素)同样反复冲洗，洗涤后用disperse II消化，放置4℃冰箱过夜，第二天取出皮肤用镊子将表皮和真皮撕开。
表皮用眼科剪刀剪碎至1mm3左右，用1×PBS洗涤后加入到15ml离心管中，1000转每分种离心5分钟后弃上清，加入3ml 0.25％(质量体积比)胰酶消化30分钟，其中胰酶含质量体积比0.01％EDTA；消化后过40μm细胞筛，过滤后加入10ml 1×PBS，经1000转每分钟离心10分钟得到细胞沉淀，再次10ml 1×PBS重悬后，经1000转每分钟离心10分钟获得表皮细胞沉淀，加5ml0.9％生理盐水重悬，苔盘兰计数，得到的5.4×107表皮细胞放置4℃冰箱存放备用。
实施例2 人自体成纤维细胞的制备
取制备例1中获得的真皮用眼科剪刀剪碎至1mm3左右，用1×PBS洗涤后加入到15ml离心管中，1000转每分种离心5分钟后弃上清，加入3ml 0.25％胰酶消化30分钟，消化后过40μm细胞筛，过滤后加入10ml 1×PBS，经1000转每分钟离心10分钟得到单细胞沉淀，再次10ml 1×PBS重悬后，经1000转每分钟离心10分钟获得单细胞沉淀，加入α-MEM培养基重悬，苔盘兰计数，用α-MEM培养基(含10％胎牛血清、50ng/ml重组人干细胞生长因子、25ng/ml重组人表皮生长因子和25ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)按1-10×106细胞/ml加入15ml到75cm2培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养；每隔2天更换一次新鲜培养液；
成纤维细胞在75cm2培养瓶中生长融合达到90％以上，用5ml移液管吸弃培养液，加入0.5ml 0.25％胰酶消化后1000转每分钟离心5分钟收集成纤维细胞；用5ml移液管加入10ml新鲜的α-MEM培养基(含10％胎牛血清、50ng/ml重组人干细胞生长因子、25ng/ml重组人表皮生长因子和25ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子)，加入到75cm2培养瓶中继续在37℃，5％CO2培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液；如此连续传代5代培养经胰酶消化离心后，获得4.6×107的成纤维细胞，用4.6ml生理盐水重悬，计数，即获得成纤维细胞，放置冰箱4℃存放备用。图1为成纤维细胞在倒置显微镜下观察生长图片，图1A中为成纤维细胞第1代时生长形态，成纤维细胞成长梭形；图1B中成纤维细胞第5代时生长形态，成纤维细胞成长梭形更加明现。
实施例3 人自体表皮细胞和成纤维细胞特异蛋白表达检测
取实施例1中制备的自体表皮细胞和实施例2中制备的成纤维细胞悬液各1份50μL(2×106个)加入500μL预冷即用型总蛋白提取裂解液(RIPA，北京百泰克公司)(含体积比1％蛋白酶抑制剂，瑞士Roche公司)，冰上孵育20分钟后，每分钟13000转，4℃离心20分钟。取上清，分装-80℃保存备用。按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(武汉博士德公司)使用说明操作，测定蛋白浓度。以RIPA调整蛋白浓度，样品终浓度为1.0μg/μL，加入5×蛋白样品缓冲液，95℃下5分钟。
根据目的蛋白的分子量，配制10％分离胶，浓缩胶浓度为5％。待检测蛋白样品上样量：20μg/孔。电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20分钟；分离胶恒压120V，通过标准分子量预染蛋白来确定电泳停止时间。湿转法，转膜条件：300mA恒流；0.45μm孔径PVDF膜，转膜时间80分钟。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。封闭：将膜完全浸没于5％(mg/mL)牛血清白蛋白(BSA)的转膜缓冲液(含体积比3％吐温-20，TBST)中，室温下水平摇床孵育1小时。
一抗孵育：5％(mg/mL)BSA-TBST分别稀释一抗EGF和FGF(均购自美国Santa公司；β肌动蛋白，Beta actin为内参对照)，4℃水平摇床孵育过夜。
次日，洗膜：TBST洗3次，每次10分钟。二抗孵育：5％(mg/mL)BSA-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG(H+L)辣根过氧化酶(HRP)和山羊抗鼠IgG(H+L)HRP 1∶10000，室温孵育40分钟。洗膜：TBST洗膜3次，每次10分钟。化学发光底物ECL滴加到膜的蛋白面，反应3-5分钟；胶片曝光：10秒-5分钟(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2分钟，定影。胶片用扫描仪扫描为大于300DPI的TIF格式图片。
图2中为人自体表皮细胞和成纤维细胞特异蛋白western blotting检测图片。图2A为实施例1中制备的自体表皮细胞1及其冻存复苏后的自体表皮细胞2表达EGF的westem blotting检测，结果表明两者均表达EGF蛋白；图2B为实施例2中制备的自体成纤维细胞1及其冻存复苏后的自体成纤维细胞2表达bFGF的western blotting检测，结果表明两者均高表达bFGF蛋白；阴性对照为293T细胞(人肾上皮细胞系)。
使用Quantity One分析软件(Bio-Rad公司)进行灰度分析，经灰度分析结果显示EGF蛋白灰度值达到10900，bFGF蛋白灰度值达到21300。
实施例4 自体表皮细胞和/或成纤维细胞生物美容产品的制备
所述自体血浆由抽取人70ml肝素或EDTA抗凝外周血，经1000转每分钟离心10分钟得到的30ml血浆，再次3000转每分钟离心10分钟获得30ml富含血小板血浆，放置4℃冰箱存放备用。
分别取5×106实施例1中制备的自体表皮细胞和实施例2中制备的成纤维细胞，加入到5ml自体富含血小板的血浆中，混匀，分别加入100ng灵芝多糖和胎盘提取多肽素，装入10ml无菌可密封的针管中，制备成含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，放置冰箱4℃中保存，保质期为48小时。
实施例5 白癜风皮肤修复
白癜风患者躺卧在手术台上，使用白癜风皮肤进行清洁，清水擦洗干净；麻醉达成后，以皮肤磨削机磨削创面达点状渗血，尽可能使皮肤磨削厚度均匀一致，肾上腺素盐水纱布等合适止血后，将本发明的6ml实施例4中生产的生物美容产品涂抹在皮肤磨削机磨削创面，纳米银敷料覆盖，无菌敷料包扎固定，注意适当加压。
患者减少局部活动，患肢抬高，红外线照射，减少分泌物渗出。术后第3天打开外层敷料，保持干燥，直至敷料脱落。创面愈合后应用胶原美皮护、抗瘢痕药物、弹力绷带等综合抗瘢痕治疗，预防瘢痕增生。
图3中是一名患有白癜风的34岁女性，进行本发明的自体表皮细胞和成纤维细胞的生物美容产品进行白癜风皮肤修复，经自体表皮细胞和成纤维细胞的生物美容产品治疗后腿部白癜风改善的图片。图3A图为该患者治疗前腿部白癜风的图片，图3B为患者腿部白癜风磨削后，经自体表皮细胞和成纤维细胞的生物美容产品治疗一次后，发现该女性腿部白癜风得到明显的改善，皮肤上白癜风几乎消失，恢复成与周围皮肤相似的肤色。
Claims (10)
1.一种自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备的方法，其中，所述方法包括通过从自体皮肤中获取表皮细胞和经体外培养得到成纤维细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述自体表皮细胞由取人0.1-2cm2皮肤，用1×磷酸盐缓冲液PBS 5ml浸润15分钟，用1ml移液枪吸弃，再用1×PBS同样反复冲洗，洗涤后用分散剂II(disperse II)消化，放置4℃冰箱过夜，第二天取出皮肤用镊子将表皮和真皮撕开，表皮用眼科剪刀剪碎至1mm3左右，用1×PBS洗涤后加入到15ml离心管中，1000转每分种离心5分钟后弃上清，加入3ml 0.25％(质量体积比)胰酶消化1-60分钟，其中胰酶含质量体积比0.01％EDTA；消化后过40μm细胞筛，过滤后加入5-10ml 1×PBS，经1000转每分钟离心10分钟得到细胞沉淀，再次5-15ml 1×PBS重悬后，经1000转每分钟离心10分钟获得表皮细胞沉淀，加1-5ml 0.9％生理盐水重悬，苔盘兰计数，得到的107-108表皮细胞；放置4℃冰箱存放备用；
获得的表皮细胞经western blotting蛋白质检测表皮细胞生长因子表达水平，经灰度分析结果显示其灰度值达到9000以上。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述自体成纤维细胞由上述获得真皮用眼科剪刀剪碎至1mm3左右，用1×PBS洗涤后加入到15ml离心管中，1000转每分种离心5分钟后弃上清，加入3ml 0.25％胰酶消化1-60分钟，消化后过40μm细胞筛，过滤后加入5-10ml 1×PBS，经1000转每分钟离心10分钟得到单细胞沉淀，再次5-15ml 1×PBS重悬后，经1000转每分钟离心10分钟获得单细胞沉淀，加入α-MEM培养基重悬，苔盘兰计数，用α-MEM培养基按1-10×106细胞/ml加入10-20ml到75cm2培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养；每隔2天更换一次新鲜培养液；
成纤维细胞在75cm2培养瓶中生长融合达到90％以上，用5ml移液管吸弃培养液，加入0.5ml 0.25％胰酶消化后1000转每分钟离心5分钟收集成纤维细胞；用5ml移液管加入10ml新鲜的α-MEM培养基，加入到75cm2培养瓶中继续在37℃，5％CO2培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液；如此连续传代1-5代培养经胰酶消化离心后，获得4×107以上的成纤维细胞，用4-10ml生理盐水重悬，计数，即获得成纤维细胞，放置冰箱4℃存放备用；
获得的成纤维细胞经western blotting蛋白质检测成纤维细胞生长因子表达水平，经灰度分析结果显示其灰度值达到12000以上。
4.根据权利要求2-3任一项所述的方法，其特征在于，所述自体皮肤来源于耳后取皮、眼袋割除后皮肤、手臂取皮和腿上取皮；优选地，选择耳后取皮。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述PBS的pH值7.4，其含100活性单位/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素。
6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，所述α-MEM培养基，其含1-10％胎牛血清、1-100ng/ml重组人干细胞生长因子、1-50ng/ml重组人表皮生长因子和1-50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子。
7.一种含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，其特征在于，所述产品包括将权利要求1-6任一项所述的自体表皮细胞、成纤维细胞中的一种或两种添加到自体外周血富含血小板的血浆中，生产出含自体活细胞的生物美容产品；优选同时添加营养因子；
所述自体血浆由抽取人50-100ml肝素或EDTA抗凝外周血，经1000转每分钟离心10分钟得到的10-40ml血浆，再次3000转每分钟离心10分钟获得10-40ml富含血小板血浆，放置4℃冰箱存放备用；
取1-10×106自体表皮细胞和/或成纤维细胞，加入到5ml自体富含血小板的血浆中，混匀；优选，同时加入10ng-1ug营养因子，装入10ml无菌可密封的针管中，制备成含自体表皮细胞和/或成纤维细胞的生物美容产品，放置冰箱4℃中保存，保质期为48小时。
8.根据权利要求7所述的生物美容产品，其特征在于，优选加入所述自体表皮细胞和成纤维细胞；优选同时添加所述营养因子。
9.根据权利要求7-8任一项所述的生物美容产品，其特征在于，所述营养因子，即为超氧化歧化酶、灵芝多糖、胎盘提取多肽素和银杏叶提取液；优选地，含有两种以上所述营养因子。
10.一种权利要求7-9中任一项所述的生物美容产品的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510014832.3A CN104611289A (zh) | 2015-01-13 | 2015-01-13 | 自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510014832.3A CN104611289A (zh) | 2015-01-13 | 2015-01-13 | 自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104611289A true CN104611289A (zh) | 2015-05-13 |
Family
ID=53145941
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510014832.3A Pending CN104611289A (zh) | 2015-01-13 | 2015-01-13 | 自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104611289A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105176914A (zh) * | 2015-10-13 | 2015-12-23 | 怡诺博(北京)生物医学技术有限公司 | 自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品 |
| CN108743514A (zh) * | 2018-06-15 | 2018-11-06 | 天晴干细胞股份有限公司 | 一种延长皮肤衰老功能改善的组合物及其制备方法 |
| CN109010247A (zh) * | 2018-09-20 | 2018-12-18 | 浙江卫未生物医药科技有限公司 | 一种自体成纤维细胞来源的外泌体冻干粉的应用及制备方法 |
| CN109666632A (zh) * | 2017-10-17 | 2019-04-23 | 王振坤 | 一种皮肤成纤维前体细胞分离培养及制剂制备方法 |
| CN110337490A (zh) * | 2017-01-11 | 2019-10-15 | 脊核细胞有限责任公司 | 增强成纤维细胞治疗活性的方法 |
| CN110408589A (zh) * | 2018-04-26 | 2019-11-05 | 西安新长安再生医学科技研发有限公司 | 一种自体再生生物材料的制备方法及自体再生生物材料 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006014089A1 (en) * | 2004-08-06 | 2006-02-09 | Tego Science Inc. | Cosmetic composition containing keratinocyte and/or fibroblast |
| CN103037871A (zh) * | 2010-05-11 | 2013-04-10 | 医疗集团蓓世体安 | 用于缓解或治疗皮肤缺损的自体皮肤细胞治疗剂的制备方法 |
| CN105176914A (zh) * | 2015-10-13 | 2015-12-23 | 怡诺博(北京)生物医学技术有限公司 | 自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品 |
-
2015
- 2015-01-13 CN CN201510014832.3A patent/CN104611289A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006014089A1 (en) * | 2004-08-06 | 2006-02-09 | Tego Science Inc. | Cosmetic composition containing keratinocyte and/or fibroblast |
| CN103037871A (zh) * | 2010-05-11 | 2013-04-10 | 医疗集团蓓世体安 | 用于缓解或治疗皮肤缺损的自体皮肤细胞治疗剂的制备方法 |
| CN105176914A (zh) * | 2015-10-13 | 2015-12-23 | 怡诺博(北京)生物医学技术有限公司 | 自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| WILLIAM K. BOSS ET AL.: "Autologous cultures fibroblasts as cellular therapy in plastic surgery", 《CLIN PLAST SURG OF NORTH AM》 * |
| 吴昌炎: "自体表皮细胞悬液促进皮肤创面愈合的作用与研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
| 徐小珂等: "表皮细胞悬液自体移植治疗节段型白癜风", 《中华医学美学美容杂志》 * |
| 赵娟: "自体皮肤成纤维细胞在医学美容中的应用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
| 赵娟等: "自体皮肤成纤维细胞与毛发角蛋白复合填充材料在医学美容中的应用", 《中国生物制品学杂志》 * |
| 高文娟等: "表皮细胞培养及其临床应用", 《中国组织工程研究与临床康复》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105176914A (zh) * | 2015-10-13 | 2015-12-23 | 怡诺博(北京)生物医学技术有限公司 | 自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品 |
| CN110337490A (zh) * | 2017-01-11 | 2019-10-15 | 脊核细胞有限责任公司 | 增强成纤维细胞治疗活性的方法 |
| CN109666632A (zh) * | 2017-10-17 | 2019-04-23 | 王振坤 | 一种皮肤成纤维前体细胞分离培养及制剂制备方法 |
| CN110408589A (zh) * | 2018-04-26 | 2019-11-05 | 西安新长安再生医学科技研发有限公司 | 一种自体再生生物材料的制备方法及自体再生生物材料 |
| CN108743514A (zh) * | 2018-06-15 | 2018-11-06 | 天晴干细胞股份有限公司 | 一种延长皮肤衰老功能改善的组合物及其制备方法 |
| CN108743514B (zh) * | 2018-06-15 | 2022-03-11 | 天晴干细胞股份有限公司 | 一种延长皮肤衰老功能改善的组合物及其制备方法 |
| CN109010247A (zh) * | 2018-09-20 | 2018-12-18 | 浙江卫未生物医药科技有限公司 | 一种自体成纤维细胞来源的外泌体冻干粉的应用及制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105176914A (zh) | 自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品 | |
| CN104611289A (zh) | 自体表皮细胞和成纤维细胞同时制备方法及其生物美容产品 | |
| Sclafani et al. | Platelet preparations for use in facial rejuvenation and wound healing: a critical review of current literature | |
| Sano et al. | Acellular adipose matrix as a natural scaffold for tissue engineering | |
| CN107823632A (zh) | 一种骨髓间充质干细胞注射液及制备方法 | |
| NO317738B1 (no) | Anvendelse av dermalfibroblaster i fremstillingen av et middel for bruk i kosmetisk augmentasjon samt et middel for bruk i en kirurgisk metode for langvarig, kosmetisk augmentasjon. | |
| JP2010538681A (ja) | 人または動物胚から間葉系幹細胞を抽出及びその分泌物を抽出する方法 | |
| AU2007265862A1 (en) | Soft tissue filler composition comprising autologous dermis-derived cell culture product and hyaluronic acid | |
| CN106029102A (zh) | 使用富血小板血浆进行组织的修复和复壮 | |
| CN105820998A (zh) | 临床回输级细胞治疗用人脂肪干细胞ADSCs分离提取培养方法 | |
| CN108057116A (zh) | 干细胞组合物在皮肤损伤治疗药物中的应用 | |
| CN108486047A (zh) | 一种干细胞提取物的医用敷料及其制备方法 | |
| CN108888634A (zh) | 毛囊干细胞提取物冻干粉的制备方法及应用 | |
| CN108126246A (zh) | 基于复合干细胞的人工皮肤构建方法 | |
| CN108066750A (zh) | 干细胞及其分泌物用于治疗皮肤烧烫伤的新用途 | |
| KR20010072553A (ko) | 살아있는 키메릭 피부 대체물 | |
| JP5340564B2 (ja) | 人工皮膚およびその製造方法 | |
| CN109771694A (zh) | 自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料的制备方法及应用 | |
| JP2022033694A (ja) | 瘢痕修復製剤の調製における幹細胞由来のナノ小胞の応用 | |
| KR20080071656A (ko) | 배양된 모낭구성세포를 이용한 생인공피부 제조방법 | |
| CN109554454A (zh) | 一种通过测定细胞因子含量评价冻干粉生发作用的方法 | |
| US20160129045A1 (en) | Composition for wound-healing comprising adult stem cells and elastin-like polypeptides | |
| CN108066824A (zh) | 一种制备表皮缺损治疗药物的新方法 | |
| AU2016357986A1 (en) | Method for the production of hair follicles and de novo papillae, and use thereof for in vitro test and in vivo implants | |
| TW201432048A (zh) | 生長因子製劑及其生產方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150513 |