CN104604667A - 一种异源四倍体棉花的人工合成方法及其遗传分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异源四倍体棉花的人工合成方法，其特征在于，其包括以下步骤：(1)预备供体材料；所述的供体材料包括为棉属染色体A组的棉种，及为棉属染色体D组的棉种；(2)在控制气候条件下对供体材料进行长期不间断纯化；(3)对供体材料进行定株编码宿根保存；(4)将分别对所获得的多代纯化后的A组、D组供体材料，远缘杂交；(5)以清晰稳定的父本特异性条带为判断依据，对各杂交后代进行真伪性鉴定，进行遗传分析；(6)将鉴定为真的F1代通过人工诱变方法，进行基因突变处理；经筛选后，所得到的杂交植株或杂交种子，即为AD杂交异源四倍体棉花。本发明还公开了通过该方法合成的异源四倍体棉花的遗传分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及棉花遗传育种领域，具体涉及一种人工控制条件下的异源四倍体棉花的人工合成方法，及该异源四倍体棉花遗传分析方法。
背景技术
棉属(Gossypium)有51个种，其中46个为二倍体棉种(2n＝2X＝26)，5个为异源四倍体棉种(2n＝4X＝52)分别为陆地棉(G.hirsutum，[AD]1)、海岛棉(G.barbadense，[AD]2)、夏威夷棉(G.tomentosum，[AD]3)、黄褐棉(G.mustillinum，[AD]4)和达尔文棉(G.darwinii，[AD]5)。
长期以来，自然界中5个棉属异源四倍体种的供体种问题一直是棉属起源和进化争论的热点。棉属异源多倍体也一直是研究多倍体中重复基因和重复基因组进化的良好材料，为了进一步探讨异源四倍体棉种的起源和基因组进化机理，目前最有效最明了的探索方法是将棉属异源四倍体棉种可能的A、D染色体组供体种，二倍染色体A组棉种草棉、亚洲棉和二倍染色体D组棉种雷蒙德氏棉、瑟伯氏棉、旱地棉等进行远缘杂交，然后将杂种F1(AD)进行染色体加倍人工合成异源四倍体种质(AADD)，进一步与自然界已有的5个异源四倍体棉种进行形态学、细胞遗传学和基因组学比较研究(SSR或SNP)，探索物种起源过程中的遗传变化规律和新物种形成后存活、进化和基因组互作机理。同时也为异源四倍体棉种基因组进化提供理论依据，为棉花育种提高宝贵的中间材料。
而目前四倍体棉花受到地域、气候等因素的限制，不能在其他地域进行生长，或繁殖，导致优质棉花不能被大量推广，且使用成本高。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供异源四倍体棉花的人工合成方法，及该异源四倍体棉花的遗传分析方法，克服异源四倍体棉花生长地域问题，同时为棉花起源研究、育种生产提供宝贵素材。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案为：
一种异源四倍体棉花的人工合成方法，其包括以下步骤：
(1)预备供体材料：所述的供体材料包括为棉属染色体A组的棉种，及为棉属染色体D组的棉种；
(2)在控制气候条件下对供体材料进行长期不间断直系纯化，进行单铃多代直系纯化育种：在年平均温度为22.5～25.6℃，温度范围在10～35℃，年光照时数1780～2600小时，太阳总辐射量4500～5800兆焦耳/平方米，年降水量1500～2500毫米，温度-湿度指数65～70，光合有效辐射2100～2600MJ/m2的环境条件下，对供体材料进行一年内3代以上单铃繁殖，经生长发育并结果后，待第一个铃吐絮时采摘，然后继续种植，以此类推，并在繁殖过程把混杂株、变异株去除，经20～30代种植纯化后，留取高纯植株；
(3)对供体材料进行定株编码宿根保存；
(4)将分别对所获得的多代纯化后的A组、D组供体材料，通过远缘杂交得到F1代；
(5)以清晰稳定的父本特异性条带为判断依据，对各杂交后代进行真伪性鉴定，进行遗传分析，鉴定为真的保留；
(6)将鉴定为真的F1代通过人工诱变方法，进行基因突变处理；经筛选后，所得到的杂交植株或杂交种子，即为AD杂交异源四倍体棉花。
在步骤2)的棉花纯化育种种植过程中，还包括套袋保护作业的步骤：
21)在棉花育苗期进行套袋保苗，该袋为聚乙烯、防老化剂和抗紫外线剂按重量比为100∶1∶0.5的混合材料，经拉丝织造的筛网袋，保护棉花苗株免受风、雨、病、虫害及鼠害，同时防止幼苗被强烈的阳光紫外线灼伤，无需喷洒农药以避免其对棉种纯度造成影响；
22)在棉花花蕾期进行套袋保铃，该保铃袋为无纺布制成并在开口处设有绑绳，将棉铃套入袋中后扎紧绑绳，保护棉铃免受风、雨、病、虫害及鼠害，无需喷洒农药以避免其对棉种纯度造成影响。
所述步骤(3)具体包括：
(31)种植棉花当年：按照播种期、种植密度和栽培管理方法进行栽培和管理；
(32)种植棉花第二季及以后：萌发新芽后，选留健壮芽培育成侧枝，并及时去除赘芽；夏季打顶、修剪和抹除赘芽；冬季进行棉田中耕、培土并重施有机肥；
(33)对于不能收到种子的材料或即将衰老的植株，通过取嫩芽嫁接繁殖保存。
所述步骤(4)具体包括：以经过纯化的棉属染色体A组的棉种为母本，以经过纯化的棉属染色体D组的棉种为父本，进行种间杂交，并获得杂种；
所述步骤(6)包括：
(61)对杂种F1代进行种植培育；
(62)用秋水仙碱水溶液，进行染色体加倍诱变；
(63)经筛选后得到异源四倍体棉花。
所述种间杂交具体包括：用镊子去雄，授粉后用“小指”轻轻地在柱头周围敲打，助推花粉粒与柱头加快且充分接触，节省识别时间进而减少外界环境的影响，提高成铃率。
所述步骤(62)具体包括：
(621)对于获得种子数量极少的F1代，或不可育的F1代，待长出侧芽后，取侧芽进行嫁接扩繁，并用0.3～0.5％秋水仙碱水溶液，处理生长点2×12小时，进行生长点染色体加倍诱变；
(622)对于获得种子数量较多的F1代，用0.05～0.5％的秋水仙碱水溶液，直接对杂种浸泡12～24小时，进行染色体加倍诱变。
对于获得种子数量较多的杂种F1代，直接进行种子侵泡染色体加倍诱变。留取少部分种子播种植苗，取大部分种子在25℃的黑暗环境中用0.05～0.5％的秋水仙碱水溶液浸泡12～24小时，诱变种子播种营养钵中置于25℃的黑暗环境发芽，待第一片真叶平展后搬至室外荫棚下，不可暴晒，温度控制在28℃，一天清水一天低浓度叶面肥喷晒促进植株生长。
对于获得种子数量极少的杂种F1代，须进行生长点染色体加倍诱变。待长出侧芽后，取侧芽进行嫁接扩繁，待嫁接苗长高20-30cm后，切取顶端生长点继续嫁接扩繁，切除原株生长点后加强水肥管理，待侧芽长有1cm后进行自然干旱，处缺水状态时，在25℃的黑暗环境中用0.3～0.5％秋水仙碱水溶液侵泡侧芽6～12小时，诱变植株置于室外荫棚下，不可暴晒，温度控制在28℃，一天清水一天低浓度叶面肥喷晒促进植株生长。先干旱再泡药目的是使苗吸收药液效果更佳。
根据所述方法合成的异源四倍体棉花的遗传分析方法，其包括以下步骤：
(I)对杂交后的杂种F1代进行培育，对F1代的叶片进行形态学分析，初步判断是否为杂株，杂株则保留，纯株则剔除；
(II)对F1代获得种子较多的杂株种子，通过直接对种子进行染色体加倍诱变，然后对加倍诱变结果采用形态学和细胞学进行观察分析，然后分别取亲本、杂种嫩叶，提取基因组gDNA，并测量基因组的浓度和纯度；
预备SSR引物，筛选出条带清晰、多态性好的SSR引物；
用SSR引物对父本进行聚合酶链式反应PCR扩增，筛选出具有父本特异性条带的引物，作为杂种鉴定的引物；
以清晰稳定的父本特异性条带为判断依据，对各杂交后代进行真伪性鉴定，鉴定为真的杂株则保留；
(III)对不可育的F1代，或获得种子数量极少的F1代，首先对杂种嫩叶进行简单重复序列SSR分子标记鉴定，进行嫁接扩繁及生长点染色体诱变后，对加倍结果采用形态学和细胞学，最后杂株现蕾后，取花蕾进行花粉母细胞减数***染色体行为进行观察，判断是否为真的杂株，判断为真的杂株则保留；
(IV)所述步骤(II)和步骤(III)不分先后。
所述步骤(III)具体包括：待杂株现蕾后，用固定液固定花蕾4～24小时后，用70％乙醇溶液对花蕾清洗后，侵泡在70％乙醇溶液中，在4℃唯独条件下进行保存，然后取花蕾做成压片，观察杂种F1花粉母细胞减数***中期I的染色体行为，包括染色体构型、细胞数，同时分析染色体组的亲和性指数。
所述的SSR分子标记鉴定包括以下步骤：
分别取亲本、杂种嫩叶，提取基因组gDNA，并测量基因组的浓度和纯度；
预备SSR引物，筛选出条带清晰、多态性好的SSR引物；
用SSR引物对父本进行聚合酶链式反应PCR扩增，筛选出具有父本特异性条带的引物，作为杂种鉴定的引物；
利用步骤筛选到的具有父本特异性条带的引物，以清晰稳定的父本特异性条带为判断依据，对各杂交后代进行真伪性鉴定。
所述的固定液由无水乙醇、三氯甲烷、冰醋酸按质量比为5∶3∶2制成。
所述聚合酶链式反应PCR扩增方法，包括以下步骤：
(i)预备以下反应组分：25mmol MgCl23μl，50mmol KCl 2μl，10mmol Tris-HCl(pH8.3)5μl，10mmol dNTPs 2μl，10μmol的引物2μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.2μl，10ng/μl的模板DNA 2μl以及ddH2O 8.8μl；
(ii)在94℃温度条件下预反应2～3min；
(iii)在94℃反应30s后，退火，在45℃～60℃条件下30s，然后在70℃条件下反应30s；
(iv)重复步骤(iii)30～40次后，在72℃温度条件下反应10min。
本发明的有益效果是：采用棉属种杂交新技术，即“助推法”，授粉后，用“小指”轻轻地在柱头周围敲打，助推花粉粒与柱头加快充分接触，节省识别时间进而减少外界逆境的影响，提高有效铃率，本方法不借助任何化学试剂亦能达到很高的成铃率，此物理法的成铃比“化学法”的更直接更成效，成铃率提高达到50％，尤其是通过成铃数来初步判断父、母本的亲和力。
采用“连、集、高、多”的模式，即连续性、集中性、高效性、多样性。另外不需考虑棉花过冬存活问题，不需每年播、耕整土地和去杂去劣，不需要中途取材料返回大陆，节省了实验材料繁殖、纯化、分析的时间和成本，避免了取材料返回内地途中降解的风险，简化了棉花杂种及新类型生产程序，提高了棉花种质创新和遗传分析的效率。
具体实施方式
实施例1：本实施例提供一种异源四倍体棉花的人工合成方法，其包括以下步骤：
(1)预备供体材料：所述的供体材料包括为棉属染色体A组的棉种，及为棉属染色体D组的棉种；
(2)在控制气候条件下对供体材料进行长期不间断直系纯化，进行单铃多代直系纯化育种：在年平均温度为22.5～25.6℃，温度范围在10～35℃，年光照时数1780～2600小时，太阳总辐射量4500～5800兆焦耳/平方米，年降水量1500～2500毫米，温度-湿度指数65～70，光合有效辐射2100～2600MJ/m2的环境条件下，对供体材料进行一年内3代以上单铃繁殖，经生长发育并结果后，待第一个铃吐絮时采摘，然后继续种植，以此类推，并在繁殖过程把混杂株、变异株去除，经20～30代种植纯化后，留取高纯植株；
(3)对供体材料进行定株编码宿根保存；
(4)将分别对所获得的多代纯化后的A组、D组供体材料，通过远缘杂交得到F1代；
(5)以清晰稳定的父本特异性条带为判断依据，对各杂交后代进行真伪性鉴定，进行遗传分析，鉴定为真的保留；
(6)将鉴定为真的F1代通过人工诱变方法，进行基因突变处理；经筛选后，所得到的杂交植株或杂交种子，即为AD杂交异源四倍体棉花。
所述步骤(1)具体包括，棉属染色体A组的棉种2个：草棉(A1)，供体品种为红星草棉；亚洲棉(A2)，供体品种为石系亚1号。棉属染色体D组的棉种10个，供体品种分别为：瑟伯氏(D1)、三裂棉(D8)、戴维逊氏棉(D3-d)、克劳茨基棉(D3-k)、拟似棉(D6)、旱地棉(D4)、斯温迪芒氏棉(D10)、裂片棉(D7)、松散棉(D9)、雷蒙德氏棉(D5)。
在步骤2)的棉花纯化育种种植过程中，还包括套袋保护作业的步骤：
21)在棉花育苗期进行套袋保苗，该袋为聚乙烯、防老化剂和抗紫外线剂按重量比为100∶1∶0.5的混合材料，经拉丝织造的筛网袋，保护棉花苗株免受风、雨、病、虫害及鼠害，同时防止幼苗被强烈的阳光紫外线灼伤，无需喷洒农药以避免其对棉种纯度造成影响；
22)在棉花花蕾期进行套袋保铃，该保铃袋为无纺布制成并在开口处设有绑绳，将棉铃套入袋中后扎紧绑绳，保护棉铃免受风、雨、病、虫害及鼠害，无需喷洒农药以避免其对棉种纯度造成影响。
套袋保苗时，套袋前，根据网袋口径大小及高度，取5根大小、长短适合的木棍支架杆在小苗周围进行均匀的垂直插地固定，撑开网袋袋口朝下，由上至下套住5根支架杆和整株小苗，留5cm高的袋口进行压土封口，使小苗在一个比较宽裕的透光透气的圆柱形空间生长，压土时务必使袋口压实压严，但不可伤及小苗。套袋期间正常肥水管理。随着棉苗的生长，套袋的规格随着棉苗的大小进行换袋调整，待棉苗长大并对外界环境具有足够抵抗力后方能停止套袋。
套袋保铃时，在开花前一天给完好的目标花蕾进行套袋，套袋宜选择晴天或阴天进行。如需自交，先按常规方法进行自交再套袋，撑开套袋袋口朝下，由上至下套住整个花蕾包括苞叶直至果柄基部，抽拉绑扎线2两线头收紧袋口，打结后两线头互为反向在袋口上方1cm的袋体处交叉缠绕、打结、绑紧，操作方便；如需杂交，按常规方法进行，套袋方法与上述方法一致，打结时务必使袋口系紧，但不可用力过猛，以防花蕾、果柄受伤。套袋期间正常肥水管理，待棉铃正常吐絮后拆袋。
所述步骤(3)具体包括：
(31)种植棉花当年：按照播种期、种植密度和栽培管理方法进行栽培和管理；
(32)种植棉花第二季及以后：萌发新芽后，选留健壮芽培育成侧枝，并及时去除赘芽；夏季打顶、修剪和抹除赘芽；冬季进行棉田中耕、培土并重施有机肥；
(33)对于不能收到种子的材料或即将衰老的植株，通过取嫩芽嫁接繁殖保存。
所述步骤(4)具体包括：以经过纯化的棉属染色体A组的棉种为母本，以经过纯化的棉属染色体D组的棉种为父本，进行种间杂交，并获得杂种；
所述步骤(6)包括：
(61)对杂种F1代进行种植培育；
(62)用秋水仙碱水溶液，进行染色体加倍诱变；
(63)经筛选后得到异源四倍体棉花。
所述种间杂交具体包括：用镊子去雄，授粉后用“小指”轻轻地在柱头周围敲打，助推花粉粒与柱头加快且充分接触，节省识别时间进而减少外界逆境的影响，提高成铃率。
所述步骤(62)具体包括：
(621)对于获得种子数量极少的F1代，或不可育的F1代，待长出侧芽后，取侧芽进行嫁接扩繁，并用0.3～0.5％秋水仙碱水溶液，处理生长点2×12小时，进行生长点染色体加倍诱变；
(622)对于获得种子数量较多的F1代，用0.05～0.5％的秋水仙碱水溶液，直接对杂种浸泡12～24小时，进行染色体加倍诱变。
杂交时，固定父本株对固定母本株进行授粉，即株对株授粉，以便对后代进行准确遗传分析。
因A组母本供体材料花蕾的子房较小，徒手去雄不便且易伤及子房，因此杂交操作时借助长尖头镊子去除花瓣和花药，具体操作，左手中指和无名指夹住花蕾基部的果枝，拇指轻轻撑开其中两片苞叶并轻压固定花蕾，食指轻轻拨开另一片苞叶，右手用镊子轻轻夹撕去除花瓣和花药，夹撕力度不可过大，以免撕拔掉整个花蕾。
因A组与D组棉属存在生物遗传隔离且亲缘关系较远，两组间的杂交属于远源杂交，杂交极难成铃结实，为了打破生物隔离，提高杂交成铃及结实率，首次采用“助推法”进行授粉，即环绕柱头授粉后用“小指”轻轻地在柱头周围敲打，助推花粉粒与柱头加快且充分接触，节省彼此识别时间进而减少外界逆境的影响，此物理方法代替了繁琐的赤霉素(GA3)等化学试剂保蕾保铃处理，成铃结实率大大提高。
根据所述方法合成的异源四倍体棉花的遗传分析方法，其包括以下步骤：
(I)对杂交后的杂种F1代进行培育，对F1代的叶片进行形态学分析，初步判断是否为杂株，杂株则保留，纯株则剔除；
(II)对F1代获得种子较多的杂株种子，通过直接对种子进行染色体加倍诱变，然后对加倍诱变结果采用形态学和细胞学进行观察分析，然后分别取亲本、杂种嫩叶，提取基因组gDNA，并测量基因组的浓度和纯度；
预备SSR引物，筛选出条带清晰、多态性好的SSR引物；
用SSR引物对父本进行聚合酶链式反应PCR扩增，筛选出具有父本特异性条带的引物，作为杂种鉴定的引物；
以清晰稳定的父本特异性条带为判断依据，对各杂交后代进行真伪性鉴定，鉴定为真的杂株则保留；
(III)对不可育的F1代，或获得种子数量极少的F1代，首先对杂种嫩叶进行简单重复序列SSR分子标记鉴定，进行嫁接扩繁及生长点染色体诱变后，对加倍结果采用形态学和细胞学，最后杂株现蕾后，取花蕾进行花粉母细胞减数***染色体行为进行观察，判断是否为真的杂株，判断为真的杂株则保留；
(IV)所述步骤(II)和步骤(III)不分先后。
所述步骤(III)具体包括：待杂株现蕾后，用固定液固定花蕾4～24小时后，用70％乙醇溶液对花蕾清洗后，侵泡在70％乙醇溶液中，在4℃唯独条件下进行保存，然后取花蕾做成压片，观察杂种F1花粉母细胞减数***中期I的染色体行为，包括染色体构型、细胞数，同时分析染色体组的亲和性指数。
所述的SSR分子标记鉴定包括以下步骤：
分别取亲本、杂种嫩叶，提取基因组gDNA，并测量基因组的浓度和纯度；
预备SSR引物，筛选出条带清晰、多态性好的SSR引物；
用SSR引物对父本进行聚合酶链式反应PCR扩增，筛选出具有父本特异性条带的引物，作为杂种鉴定的引物；
利用步骤筛选到的具有父本特异性条带的引物，以清晰稳定的父本特异性条带为判断依据，对各杂交后代进行真伪性鉴定。
所述的固定液由无水乙醇、三氯甲烷、冰醋酸按质量比为5∶3∶2制成。
所述聚合酶链式反应PCR扩增方法，包括以下步骤：
(i)预备以下反应组分：25mmol MgCl23μl，50mmol KCl 2μl，10mmol Tris-HCl(pH8.3)5μl，10mmol dNTPs 2μl，10μmol的引物2μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.2μl，10ng/μl的模板DNA 2μl以及ddH2O 8.8μl；
(ii)在94℃温度条件下预反应2～3min；
(iii)在94℃反应30s后，退火，在45℃～60℃条件下30s，然后在70℃条件下反应30s；
(iv)重复步骤(iii)30～40次后，在72℃温度条件下反应10min。
实施例2：本实施例提供一种异源四倍体棉花的人工合成方法及其遗传分析方法，其步骤与实施例1基本相同，其不同之处在于：
对父、母本的单铃连收连种直至24代高度纯化，对每株高度纯化的植株进行编码挂牌定株以便株对株杂交及准确的遗传分析。先后以棉属染色体A组两个种：草棉和亚洲棉为母本分别与棉属染色体D组野生种杂交(具体棉种见表1)，用镊子去雄，授粉后用“小指”轻轻地在柱头周围敲打，助推花粉粒与柱头加快充分接触，节省识别时间进而减少外界逆境的影响，提高成铃率。授粉第2天后进行化学防虫防菌喷雾，紧接用“棉花育种保铃袋”套住花蕾确保棉铃生长过程不遭虫害及鼠害，获得杂种后在育苗基质营养钵中播种，小苗长出3-4片真叶时对照亲本叶片进行形态学分析，初步判断是否为杂株，杂株移入花盆并化学防虫防菌喷雾，紧接用“棉花育种保苗袋”套住小苗确保棉苗不遭虫害、鼠害、蜗牛害。
对于不育杂种或收获种子较少的杂种，待杂株长出侧芽后取侧芽以抗土传病害的海岛棉7124号为砧木进行嫁接扩繁，嫁接时待砧木第一片真叶平展时嫁接较为理想；并对扩繁的植株进行生长点染色体加倍诱变，使用0.3～0.5％秋水仙碱水溶液处理生长点2×12小时进行诱变，加倍结果采用形态学、流式细胞仪、细胞学鉴定。
待杂株现蕾后用固定液(无水乙醇、三氯甲烷、冰醋酸按5∶3∶2比例现配制)固定花蕾4～24小时后，70％乙醇清洗3次，并侵泡在70％乙醇中4℃保存，同时取花蕾压片观察杂种F1花粉母细胞减数***中期I的染色体行为，包括染色体构型、细胞数，同时分析染色体组的亲和性指数。
对于获得种子数量多的杂种，直接进行种子侵种染色体加倍诱变。使用0.05～0.5％的秋水仙碱水溶液浸泡12～24小时进行诱变，加倍结果采用形态学、流式细胞仪、细胞学和SSR鉴定。
所述SSR鉴定方法为：进行基因组DNA的提取与检测，分别取亲本、杂种嫩叶为材料，采用CTAB法提取基因组，提取的gDNA，利用Eppendorf Bio-Photometer生物分光光度计测量DNA的浓度和纯度，-20℃保存备用。
SSR引物合成，通过预实验，筛选出条带清晰、多态性好的25对SSR核心引物。
杂种SSR鉴定，利用25对SSR引物进行亲本间的多态性分析，选择扩增带型清晰、稳定、主带明显、在父本雷蒙德氏棉扩增出特异性条带的引物作为杂种鉴定的引物。
利用以上筛选到的具有父本特异性条带的引物，以清晰稳定的父本特异性条带为判断依据，对各杂交后代进行真伪性鉴定。每对特异性引物重复试验一次，此外还同时用多个引物进行鉴定，最后依据父本特异性条带对试验结果进行统计。
采用上述方法先后获得11个含有染色体AD组的异源二倍体种间杂种，1个异源四倍体杂种。
对所获的不可育的异源二倍体种间杂种F1进行秋水仙碱溶液染色体加倍，试图获得可育的染色体AADD组的异源四倍体新类型，用于探索自然界中现有的异源四倍体棉种尤其是陆地棉种的起源问题，并进一步用于育种生产，培育丰产、优质、多抗的优良品种，丰富棉花种质遗传资源。
表1 棉属染色体A、D组种
| 学名 | 中文名 | 分布 | 染色体组 |
| G.arbaceum L. | 亚洲棉 | 亚洲棉和非洲栽培棉 | A2 |
| G.herbaceum L. | 草棉 | 南非、中东和非洲栽培 | A1 |
| G.thurberi Tod | 瑟伯氏 | 美国亚利桑那州、墨西哥北部 | D1 |
| G.trilobum Shov | 三裂棉 | 墨西哥 | D8 |
| G.davidsonii Kell | 戴维逊氏棉 | 墨西哥 | D3-d |
| G.klotzschianum Anderss | 克劳茨基棉 | 加拉帕戈斯群岛 | D3-k |
| G.armouriamum Keam | 辣根棉 | 墨西哥 | D2-1 |
| G.harknessii Brandg | 哈克尼西棉 | 墨西哥 | D2-1 |
| G.turneri Fryx | 特纳氏棉 | 墨西哥 | D |
| G.gossypioides(Ulbr.)Standl. | 拟似棉 | 墨西哥 | D6 |
| G.aridum(Rose&Standl.)Skov. | 旱地棉 | 墨西哥 | D4 |
| G.schwendimanii Fryx | 斯温迪芒氏棉 | 墨西哥 | D |
| G.lobatum G.entry | 裂片棉 | 墨西哥 | D7 |
| G.laxum Philips | 松散棉 | 墨西哥 | D9 |
| G.raimondii Ulbr. | 雷蒙德氏棉 | 秘鲁 | D5 |
表2 含有染色体AD组的异源二倍体种间杂种
| 杂种F1来源(A×D) | 中文名(A×D) | 研究进展 |
| G.arbaceum L.×G.thurberi Tod | 亚洲棉×瑟伯氏 | 二倍体、不可育 |
| G.arbaceum L.×G.davidsonii Kell | 亚洲棉×戴维逊氏棉 | 二倍体、不可育 |
| G.arbaceum L.×G.klotzschianum Anderss | 亚洲棉×克劳茨基棉 | 二倍体、不可育 |
| G.arbaceum L.×G.gossypioides(Ulbr.)Standl. | 亚洲棉×拟似棉 | 二倍体、不可育 |
| G.arbaceum L.×G.aridum(Rose&Standl.)Skov. | 亚洲棉×旱地棉 | 加倍为四倍体、可育 |
| G.arbaceum L.×G.schwendimanii Fryx | 亚洲棉×斯温迪芒氏棉 | 二倍体、不可育 |
| G.arbaceum L.×G.lobatum Gentry | 亚洲棉×裂片棉 | 二倍体、不可育 |
| G.arbaceum L.×G.raimondii Ulbr. | 亚洲棉×雷蒙德氏棉 | 二倍体、不可育 |
| G.herbaceum L.×G.raimondii Ulbr. | 草棉×雷蒙德氏棉 | 二倍体、不可育 |
| G.herbaceum L.×G.aridum(Rose&Standl.)Skov. | 草棉×旱地棉 | 二倍体、不可育 |
| G.herbaceum L.×G.gossypioides(Ulbr.)Standl. | 草棉×拟似棉 | 二倍体、不可育 |
| G.herbaceum L.×G.klotzschianum Anderss | 草棉×克劳茨基棉 | 二倍体、不可育 |
但以上所述仅为本发明的较佳可行实施例，并非用以局限本发明的专利范围，故凡运用本发明说明书内容所作的等效结构变化，均包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种异源四倍体棉花的人工合成方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)预备供体材料：所述的供体材料包括为棉属染色体A组的棉种，及为棉属染色体D组的棉种；
(2)在控制气候条件下对供体材料进行长期不间断直系纯化，进行单铃多代直系纯化育种：在年平均温度为22～25.6℃，温度范围在10～35℃，年光照时数1780～2600小时，太阳总辐射量4500～5800兆焦耳/平方米，年降水量1500～2500毫米，温度-湿度指数65～70，光合有效辐射2100～2600MJ/m2的环境条件下，对供体材料进行一年内3代以上单铃繁殖，经生长发育并结果后，待第一个铃吐絮时采摘，然后继续种植，以此类推，并在繁殖过程把混杂株、变异株去除，经20～30代种植纯化后，留取高纯植株；
(3)对供体材料进行定株编码宿根保存；
(4)将分别对所获得的多代纯化后的A组、D组供体材料，通过远缘杂交得到F1代；
(5)以清晰稳定的父本特异性条带为判断依据，对各杂交后代进行真伪性鉴定，进行遗传分析，鉴定为真的保留；
(6)将鉴定为真的F1代通过人工诱变方法，进行基因突变处理；经筛选后，所得到的杂交植株或杂交种子，即为AD杂交异源四倍体棉花。
2.根据权利要求1所述的异源四倍体棉花的人工合成方法，其特征在于，在步骤2)的棉花纯化育种种植过程中，还包括套袋保护作业的步骤：
21)在棉花育苗期进行套袋保苗，该袋为聚乙烯、防老化剂和抗紫外线剂按重量比为100∶1∶0.5的混合材料，经拉丝织造的筛网袋，保护棉花苗株免受风、雨、病、虫害及鼠害，同时防止幼苗被强烈的阳光紫外线灼伤，无需喷洒农药以避免其对棉种纯度造成影响；
22)在棉花花蕾期进行套袋保铃，该保铃袋为无纺布制成并在开口处设有绑绳，将棉铃套入袋中后扎紧绑绳，保护棉铃免受风、雨、病、虫害及鼠害，无需喷洒农药以避免其对棉种纯度造成影响。
3.根据权利要求1所述的异源四倍体棉花的人工合成方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：
(31)种植棉花当年：按照播种期、种植密度和栽培管理方法进行栽培和管理；
(32)种植棉花第二季及以后：萌发新芽后，选留健壮芽培育成侧枝，并及时去除赘芽；夏季打顶、修剪和抹除赘芽；冬季进行棉田中耕、培土并重施有机肥；
(33)对于不能收到种子的材料或即将衰老的植株，通过取嫩芽嫁接繁殖保存。
4.根据权利要求1所述的异源四倍体棉花的人工合成方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括：以经过纯化的棉属染色体A组的棉种为母本，以经过纯化的棉属染色体D组的棉种为父本，进行种间杂交，并获得杂种；
所述步骤(6)包括：
(61)对杂种F1代进行种植培育；
(62)用秋水仙碱水溶液，进行染色体加倍诱变；
(63)经筛选后得到异源四倍体棉花。
5.根据权利要求4所述的异源四倍体棉花的人工合成方法，其特征在于，所述种间杂交具体包括：用镊子去雄，授粉后轻轻地在柱头周围敲打，助推花粉粒与柱头加快且充分接触，节省识别时间进而减少外界环境的影响，提高成铃率。
6.根据权利要求4所述的异源四倍体棉花的人工合成方法，其特征在于，所述步骤(62)具体包括：
(621)对于获得种子数量极少的F1代，或不可育的F1代，待长出侧芽后，取侧芽进行嫁接扩繁，并用0.3～0.5％秋水仙碱水溶液，处理生长点2×12小时，进行生长点染色体加倍诱变；
(622)对于获得种子数量较多的F1代，用0.05～0.5％的秋水仙碱水溶液，直接对杂种浸泡12～24小时，进行染色体加倍诱变。
7.根据权利要求1～6之一所述方法合成的异源四倍体棉花的遗传分析方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(I)对杂交后的杂种F1代进行培育，对F1代的叶片进行形态学分析，初步判断是否为杂株，杂株则保留，纯株则剔除；
(II)对F1代获得种子较多的杂株种子，通过直接对种子进行染色体加倍诱变，然后对加倍诱变结果采用形态学和细胞学进行观察分析，然后分别取亲本、杂种嫩叶，提取基因组gDNA，并测量基因组的浓度和纯度；
预备SSR引物，筛选出条带清晰、多态性好的SSR引物；
用SSR引物对父本进行聚合酶链式反应PCR扩增，筛选出具有父本特异性条带的引物，作为杂种鉴定的引物；
以清晰稳定的父本特异性条带为判断依据，对各杂交后代进行真伪性鉴定，鉴定为真的杂株则保留；
(III)对不可育的F1代，或获得种子数量极少的F1代，首先对杂种嫩叶进行简单重复序列SSR分子标记鉴定，进行嫁接扩繁及生长点染色体诱变后，对加倍结果采用形态学和细胞学，最后杂株现蕾后，取花蕾进行花粉母细胞减数***染色体行为进行观察，判断是否为真的杂株，判断为真的杂株则保留；
(IV)所述步骤(II)和步骤(III)不分先后。
8.根据权利要求7所述的遗传分析方法，其特征在于，所述步骤(III)具体包括：待杂株现蕾后，用固定液固定花蕾4～24小时后，用70％乙醇溶液对花蕾清洗后，侵泡在70％乙醇溶液中，在4℃唯独条件下进行保存，然后取花蕾做成压片，观察杂种F1花粉母细胞减数***中期I的染色体行为，包括染色体构型、细胞数，同时分析染色体组的亲和性指数。
9.根据权利要求8所述的遗传分析方法，其特征在于，所述的固定液由无水乙醇、三氯甲烷、冰醋酸按质量比为5∶3∶2制成。
10.根据权利要求7所述的遗传分析方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应PCR扩增方法，包括以下步骤：
(i)预备以下反应组分：25mmol MgCl2 3μl，50mmol KCl 2μl，10mmol Tris-HCl(pH8.3)5μl，10mmol dNTPs 2μl，10μmol的引物2μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.2μl，10ng/μl的模板DNA 2μl以及ddH2O 8.8μl；
(ii)在94℃温度条件下预反应2～3min；
(iii)在94℃反应30s后，退火，在45℃～60℃条件下30s，然后在70℃条件下反应30s；
(iv)重复步骤(iii)30～40次后，在72℃温度条件下反应10min。
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|---|---|---|---|---|
| CN105706914A (zh) * | 2016-04-01 | 2016-06-29 | 山西农业大学 | 棉花子叶色素腺体延缓形成的新种质及其选育方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1219347A (zh) * | 1997-12-12 | 1999-06-16 | 中国科学院遗传研究所 | 棉花远缘杂交育种方法 |
| CN203136662U (zh) * | 2013-02-22 | 2013-08-21 | 中国农业科学院棉花研究所 | 一种棉花育种保铃袋 |
| CN203692081U (zh) * | 2013-10-22 | 2014-07-09 | 中国农业科学院棉花研究所 | 一种棉花育种保苗袋 |
-
2015
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1219347A (zh) * | 1997-12-12 | 1999-06-16 | 中国科学院遗传研究所 | 棉花远缘杂交育种方法 |
| CN203136662U (zh) * | 2013-02-22 | 2013-08-21 | 中国农业科学院棉花研究所 | 一种棉花育种保铃袋 |
| CN203692081U (zh) * | 2013-10-22 | 2014-07-09 | 中国农业科学院棉花研究所 | 一种棉花育种保苗袋 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 中国农业科学院棉花研究所: "《中国棉花遗传育种学》", 30 June 2003 * |
| 李再云等: "植物远缘杂交中的染色体行为及其遗传与进化意义", 《遗传》 * |
| 王坤波等: "棉属多倍化研究进展", 《中国农业科技导报》 * |
| 王学德: "《三系杂交棉：棉花细胞质雄性不育的研究与利用》", 30 June 2011 * |
| 郭旺珍等: "利用SSR 标记技术研究棉属A、D染色体组的进化", 《遗传学报》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105706914A (zh) * | 2016-04-01 | 2016-06-29 | 山西农业大学 | 棉花子叶色素腺体延缓形成的新种质及其选育方法 |
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