CN104603276A - 具有修饰的种子油组成的芸苔属植物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含突变ROD1基因、ROD1核酸序列和蛋白质的芸苔属植物，以及用于产生并鉴定所述植物和等位基因的方法，所述方法可以用于种子中具有提高的C18:1水平的植物。
Description
技术领域
本发明涉及农学领域。提供通过以多种方式(包括提供敲除的ROD1等位基因或提供针对rod1基因的抑制性RNA)调节rod1基因表达，调节芸苔属植物种子中脂肪酸组成(如增加芸苔属植物种子中不饱和脂肪酸水平)的方法和手段。
发明背景
许多植物物种在它们的种子中贮藏三酰甘油(TAG)作为碳储备。这些TAG是植物生活早期阶段期间支持幼苗发展的能量和碳原料主要来源。来自大豆(Glycine max)、芸苔(Brassica)(欧洲油菜(Brassica napus)或芜青(B.rapa))、向日葵(Helianthus annuus)和许多其他油料作物的植物油还是用于人类膳食或工业应用的油的重要来源，所述工业应用包括但不限于生物燃料、生物润滑剂、尼龙前体和洗涤剂原料。就食品或非食品产业中的油用途而言，植物油的多不饱和脂肪酸的程度和/或量是特征性和决定性属性。更具体地，植物油的特征性属性和用途主要由TAG中其脂酰基组成决定。
大部分植物油主要由棕榈酸酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1cisΔ9)、亚油酸(18:2cisΔ9,12)、和α-亚麻酸(18:3cisΔ9,12,15或C18:3)组成。棕榈酸和硬脂酸分别地是具有16碳长度和18碳长度的饱和脂肪酸。油酸、亚油酸和亚麻酸是具有18碳长度的分别含有一个、两个和三个双键的不饱和脂肪酸。油酸称作单不饱和脂肪酸，而亚油酸和亚麻酸称作多不饱和脂肪酸。已经寻求对脂肪酸组成的修饰至少一个世纪，以提供最佳油产品用于人类营养用途和化学用途(例如，油料化学)(Gunstone,1998,Prog Lipid Res37:277；Broun等人,1999,Annu Rev Nutr 19:107；Jaworski等人,2003,Curr Opin Plant Biol 6:178)。特别地，多不饱和脂肪酸(18:2和18:3)已经受到密切关注，因为它们是影响营养价值和油稳定性的主要因素。然而，尽管这两种脂肪酸为人和动物提供必需养分，但是它们增加油不稳定性，因为它们包含可能在加工和储存期间轻易氧化的多个双键。
18:1去饱和成18:2是合成多不饱和脂肪酸的关键步骤。在贮藏脂质生物合成期间，已知这种反应由脂肪酸去饱和酶FAD2(一种位于内质网(ER)上的膜结合酶)催化(Browse和Somerville，1991,Annu Rev Plant PhysiolPlant Mol Biol 42:467)。FAD2底物18:1必须在作为植物细胞的主要膜磷脂的磷脂酰胆碱(PC)的sn-2位置上酯化(Miquel和Browse,1992,J BiolChem 267:1502；Okuley等人,1994,Plant Cell 6:147)。因此，不令人惊讶，下调FAD2(和FAD3)基因已经变成一项优选策略以避免需要氢化植物油和同时产生不希望的反式脂肪酸。例如，大豆具有种子特异性和组成型FAD2去饱和酶，从而对种子特异性同工型的基因沉默已经允许产生高油酸酯栽培品种(油中>88％18:1)，其中膜不饱和度和植物性能大多不受影响。然而显而易见，这类FAD2基因沉默策略是基本上有限的，因为例如卡诺拉油菜和其他油籽植物仅具有组成型FAD2酶。因此，在卡诺拉油菜和其他这类组成型FAD2作物中，沉默或下调FAD2不仅改变种子中贮藏三酰甘油(TAG)的脂肪酸组成，还改变细胞膜的脂肪酸组成，这严重破坏植物的生长和产量。例如，拟南芥属(Arabidopsis)突变体fad2中的缺陷性FAD2改变种子以及营养组织的脂肪酸组成，并严重破坏植物生长(Browse和Somerville，上文)。产生油中最高18:1水平的FAD2突变和沉默还减少营养组织和种子组织中的膜不饱和度，产生萌发和生长低劣的植物。因此，仅部分下调FAD2表达是可能的，在商业栽培品种如Nexera/Natreon(DowAgroSciences)和Clear Valley 75(Cargill)的油中产生大约70-75％18:1。
Lu等人(2009，Proc Natl Acad Sci USA 106:18837)和WO 2009/111587描述了鉴定来自拟南芥的磷脂酰胆碱:二酰甘油胆碱磷酸转移酶(PDCT)，所述转移酶由rod1基因编码，参与18:1转移至磷脂酰胆碱中用于去饱和并且还用于18:2和18:3逆转移至三酰甘油合成路线中。PDCT酶催化18:2和18:3转移至三酰甘油合成路线中。相对于野生型，拟南芥rod1突变体的种子具有下降的18:2和18:3多不饱和脂肪酸和同时增加的18:1，同时不影响拟南芥中鉴定的叶组织或根组织的脂肪酸组成。WO 2009/111587还描述了来自欧洲油菜、芜青(Brassica rapa)和甘蓝的ROD1同源物。
为了在芸苔属植物中利用rod1基因增加18:1水平并减少18:2和18:3水平，仍需要了解芸苔属植物基因组中的全部rod1基因序列和所编码蛋白质的功能性。对经济上重要的十字花科(Brassicaceae)植物如菜籽油菜中与rod1相对应的突变等位基因的分离可能因菜籽油菜中的双二倍体和因而所致的相应基因功能冗余而复杂化。
因此，现有技术缺少芸苔属植物中存在多少rod1基因和哪种rod1基因编码有功能的蛋白质或需要失活以增加种子中18:1水平的教导。如本文所述，已经解决这个问题，从而允许调节PDCT表达，目的在于调节芸苔属植物种子中的18:1水平，如将从不同实施方案和权利要求书变得显而易见。
发明概述
本发明的第一实施方案是提供一种包含至少一种rod1基因的芸苔属植物或其植物细胞、部分、种子或子代，特征在于至少一种rod1基因是失活或敲除的rod1基因。在又一个实施方案中，所述芸苔属植物是芜青，并且所述失活或敲除的rod1基因是编码与SEQ ID No.15、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21或SEQ ID No.24具有至少90％序列同一性的蛋白质的rod1基因的敲除等位基因。在又一个实施方案中，所述芸苔属植物是甘蓝(Brassica oleracea)，并且所述敲除的rod1基因是编码与SEQ ID No.27、SEQ ID No.30、SEQ ID No.33或SEQ ID No.36具有至少90％序列同一性的蛋白质的rod1基因的敲除等位基因。在又一个实施方案中，所述芸苔植物是欧洲油菜，并且所述敲除的rod1基因是编码与SEQ ID No.3或SEQID No.6具有至少90％序列同一性的蛋白质的rod1基因的敲除等位基因，如从选自以下的种子可获得的欧洲油菜：已经按检索号NCIMB 41995保藏在NCIMB的包含HIOL306的种子、已经按检索号NCIMB 42000保藏在NCIMB的包含HIOL307的种子、已经按检索号NCIMB 41996保藏在NCIMB的包含HIOL310的种子、已经按检索号NCIMB 42001保藏在NCIMB的包含HIOL313的种子、已经按检索号NCIMB 41997保藏在NCIMB的包含HIOL316的种子、已经按检索号NCIMB 41998保藏在NCIMB的包含HIOL318的种子和已经按检索号NCIMB 41999保藏在NCIMB的包含HIOL319的种子，或如包含两个敲除ROD1等位基因的欧洲油菜，所述敲除等位基因之一是编码与SEQ ID No.3具有至少90％序列同一性的蛋白质的rod1基因的敲除等位基因，并且所述敲除等位基因之一是编码与SEQ ID No.6具有至少90％序列同一性的蛋白质的rod1基因的敲除等位基因。
在又一个实施方案中，所述芸苔属植物对所述敲除的rod1基因纯合。
在又一个实施方案中，提供包含嵌合基因的转基因芸苔属植物，所述嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段：植物可表达启动子，转录时产生抑制至少一种rod1基因的RNA分子的DNA区域和任选地在植物细胞中有功能的转录终止和多聚腺苷化区。在另一个实施方案中，所述转基因芸苔属植物是欧洲油菜，并且所述RNA分子对编码与SEQ ID No.3或SEQ ID No.6具有至少90％序列同一性的蛋白质的rod1基因是抑制的。
在又一个实施方案中，提供来自本发明植物(即包含敲除的rod1基因或抑制rod1基因的RNA的植物)的种子。在又一个实施方案中，提供来自本发明植物的种子的油。
在另一个实施方案中，提供一种用于增加种子油中C18:1水平的方法，所述方法包括调节rod1基因的表达。在又一个实施方案中，提供一种用于增加种子油中C18:1水平的方法，所述方法包括步骤引入或提供嵌合基因至芸苔属植物细胞以产生转基因细胞，所述嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段：植物可表达启动子；转录时产生抑制至少一种rod1基因的RNA分子的DNA区域和任选地在植物细胞中有功能的转录终止和多聚腺苷化区；并且从所述转基因细胞再生转基因植物。
在又一个实施方案中，提供一种用于增加种子油中C18:1水平的方法，所述方法包括步骤：用致突变化学物质或用电离辐射处理种子或植物材料；鉴定rod1基因突变的植物，其中rod1基因，在经突变之前，编码与SEQ ID No.3或与SEQ ID No.6具有至少90％序列同一性的多肽；并且与其中rod1基因未突变的植物相比，选择种子中C18:1水平升高的植物。
在又一个实施方案中，提供一种用于获得种子中具有增加的C18:1水平的芸苔属植物的方法，所述方法包括步骤：在所述芸苔属植物中引入rod1基因的敲除等位基因并且通过以下方式针对所述rod1基因的敲除等位基因的存在，选择种子中具有增加的C18:1水平的所述芸苔属植物：对来自所述植物的基因组DNA分析至少一种分子标记的存在，其中所述至少一种分子标记与所述rod1基因的敲除等位基因连锁。
在另一个实施方案中，提供一种确定rod1基因的敲除等位基因在生物样品中存在或不存在的方法，所述方法包括提供来自所述生物样品的基因组DNA并且对所述DNA分析至少一种分子标记的存在，其中至少一种分子标记与所述rod1基因的敲除等位基因连锁。
又一个实施方案，提供一种用于检测芸苔属DNA样品中rod1基因的敲除等位基因的试剂盒，其中所述试剂盒包含一个或多个PCR引物对，所述PCR引物对能够扩增与所述rod1基因的敲除等位基因连锁的DNA标记。
在又一个实施方案中，提供一种确定植物或其细胞、部分、种子或子代中突变ROD1等位基因的接合性状态的方法，所述方法包括确定所述植物或其细胞、部分、种子或子代的基因组DNA中突变体和/或相应野生型ROD1特异性区域的存在。
然而，又一个实施方案提供一种用于转移来自一个植物的至少一种敲除的ROD1等位基因至另一个植物的方法，所述方法包括步骤：鉴定包含至少一种敲除的ROD1等位基因的第一植物；将第一植物与不包含所述至少一种敲除的ROD1等位基因的第二植物杂交并从杂种收集F1杂交种子；任选地，鉴定包含至少一种敲除的ROD1等位基因的F1植物；将包含至少一种敲除的ROD1等位基因的F1植物与不包含至少一种敲除的ROD1等位基因的第二植物回交至少一个世代(x)并且从杂种收集BCx种子；在每个世代中通过对所述BCx植物的基因组DNA分析至少一种分子标记的存在，鉴定包含至少一种敲除的ROD1等位基因的BCx植物，其中至少一种分子标记与所述敲除的ROD1等位基因连锁。
另一个实施方案提供包含以下有效相连的元件的嵌合基因：植物可表达启动子；DNA区域，其转录时产生抑制至少一种rod1基因的RNA分子；和任选地在植物细胞中有功能的转录终止和多聚腺苷化区。
在又一个实施方案中，提供rod1基因的敲除等位基因，其中敲除的ROD1等位基因是选自以下的天然rod1基因的突变形式：包含与SEQ IDNo.1、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.10、SEQ ID No.13、SEQ ID No.16、SEQ ID No.19、SEQ ID No.22、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.31、SEQ ID No.34、SEQ ID No.84、SEQ ID No.86、SEQ ID No.88或SEQ ID No.90有至少90％序列同一性的核酸分子；或编码下述氨基酸序列的核酸分子，所述氨基酸序列包含与SEQ ID No.3、SEQ ID No.6、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21、SEQ ID No.24、SEQ ID No.27、SEQ ID No.30、SEQID No.33、SEQ ID No.36、SEQ ID No.85、SEQ ID No.87、SEQ ID No.89或SEQ ID No.91的至少90％序列同一性，其中与有功能的rod1基因中相应的野生型DNA区域相比，所述突变rod1等位基因包含由一个或多个***、缺失或置换的核苷酸组成的突变的DNA区域并且其中所述突变rod1等位基因不编码有功能的ROD1蛋白或编码活性减少的ROD1蛋白。
在又一个实施方案中，提供一种用于产生油的方法，所述方法包括从本发明的植物(即，包含失活或敲除的rod1基因或抑制rod1基因的RNA的植物)收获种子并从所述种子提取油。
在又一个实施方案中，提供一种产生食物或饲料如油、饼粕、籽粒、淀粉、面粉或蛋白质、或工业品如生物燃料、纤维、工业化学品、药物或保健食品的方法，所述方法包括获得本发明的植物或其部分，并且从该植物或其部分制备食物、饲料或工业品。
附图简述
图1.BnROD1-A1(黑色菱形)、BnROD1-C1(灰色三角形)、BnROD1-A2(灰色圆圈)和BnROD1-C2(黑色方块)的17种组织-阶段组合中的基因表达水平。1：播种后(DAS)10日的子叶；2：播种后14日2周的茎；3：播种后14日的根；4：播种后33日的顶端分生组织；5：播种后33日的幼叶；6：播种后33日5周的茎；7：播种后42日的小花芽(≤5mm)；8：播种后42日的大花芽(≥5mm)；9：播种后52日的展开花；10：受精后(DAF)14-20日2期荚瓣；11：受精后21-25日3期荚瓣，；12：受精后14-20日2期种子；13：受精后21-25日3期种子；14：受精后26-30日4期种子；15：受精后31-35日5期种子；16：受精后42日6期种子；17：受精后49日7期种子。
图2.酵母中ROD1等位基因的活性。A：野生型BnROD1同源物的活性。泳道1：DAG；泳道2：拟南芥ROD1，泳道3：拟南芥ROD1；泳道4：BnROD1-A1；泳道5：BnROD1-A2；泳道6：BnROD1-C1；泳道：BnROD1-C2，泳道8：阳性对照。B：BnROD1-A1的突变体的活性。泳道1：DAG；泳道2：阴性对照(空载体)，泳道3：煮沸过的拟南芥ROD1；泳道4：拟南芥ROD1；泳道5：BnROD1-A1；泳道6：BnROD1-A1突变体HIOL305；泳道7：BnROD1-A1突变体HIOL306；泳道8：BnROD1-A1突变体HIOL307；泳道9：BnROD1-A1突变体HIOL302；泳道10：BnROD1-A2；泳道11：BnROD1-C2；泳道12：阳性对照。C：BnROD1-C1的突变体的活性。泳道1：DAG；泳道2：BnROD1-A1；泳道3：BnROD1-C1；泳道4：BnROD1-C1突变体HIOL311；泳道5：BnROD1-C1突变体HIOL314；泳道6：BnROD1-C1突变体HIOL315；泳道7：BnROD1-C1突变体HIOL310；泳道8：BnROD1-C1突变体HIOL313；泳道9：BnROD1-C1突变体HIOL309；泳道10：阳性对照。在左侧的箭头：上部箭头指示14C Di 18:1-DAG；中部箭头指示14C Di 18:1-PC；下部箭头指示来源。
图3.具有ROD1发夹构建体的转化体T1S1种子中C18:1、SATS(C16:0、C18:0、C20:0、C22:0和C24:0)水平和C18:1和C18:2之间的相关性。全部水平均按重量百分比计。A：C18:1水平。1：野生型对照，2：用ROD1-Bn2(通用)发夹构建体转化的不同株系；3：用ROD1-Bn1(专用)发夹转化的不同株系。B：SATS(C16:0、C18:0、C20:0、C22:0和C24:0)的水平。1：野生型对照，2：用ROD1-Bn2(通用)发夹构建体转化的不同株系；3：用ROD1-Bn1(专用)发夹转化的不同株系。C：C18:1和C18:2之间的相关性。将C18:2水平对来自具有ROD1-Bn2(通用)发夹构建体或ROD1-Bn1(专用)发夹构建体的不同转化体的种子中的C18:1水平作图。以等式y＝-0.6961x+63.183计算线性回归，R平方值为0.8643。
图4.具有ROD1发夹构建体的转化体T1S2种子中C18:1和SATS(C16:0、C18:0、C20:0、C22:0和C24:0)水平。全部水平均按重量百分比计。A：与其野生型分离子(对角条纹线)相比转化植物(灰色线)的C18:1水平。1：野生型对照，2：用ROD1-Bn2(通用)发夹构建体转化的不同株系；3：用ROD1-Bn1(专用)发夹转化的不同株系。B：与其野生型分离子(对角条纹线)相比转化植物(灰色线)的SATS(C16:0、C18:0、C20:0、C22:0和C24:0)水平。1：野生型对照，2：用ROD1-Bn2(通用)发夹构建体转化的不同株系；3：用ROD1-Bn1(专用)发夹转化的不同株系。
图5.具有ROD1-A1和ROD1-C1及其组合的EMS突变体的T1S2种子中ROD1中的C18:1和SATS(C16:0、C18:0、C20:0、C22:0和C24:0)水平。全部水平均按重量百分比计。A：野生型分离子(黑色线)、纯合单突变体、仅C1(对角条纹线)、仅纯合单突变体A1(垂直条纹线)和纯合双突变体A1和C1(灰色线)的C18:1水平。在左侧指示在ROD1-A1和ROD1-C1中的突变等位基因。B：野生型分离子(黑色线)、纯合单突变体、仅C1(对角条纹线)、仅纯合单突变体A1(垂直条纹线)和纯合双突变体A1和C1(灰色线)的SATS(C16:0、C18:0、C20:0、C22:0和C24:0)水平。在左侧指示在ROD1-A1和ROD1-C1中的突变等位基因。
一般定义
如本文所用，”rod1基因”或“ROD1等位基因”，是包含与拟南芥(Arabidopsis thaliana)rod1基因的编码序列具有至少60％序列同一性的序列的基因或等位基因，如WO 2009/111587中所述。
rod1基因或ROD1等位基因可以，但是不需要编码有功能的ROD1蛋白。可以如实施例4中所述或如Lu等人(2009)Proc Natl Acad Sci USA106:18839所描述例如在酵母中检验ROD1蛋白的功能。
如本文所用的“敲除的rod1基因”或“敲除的rod1等位基因”是不编码有功能的ROD1蛋白或编码活性减少的ROD1蛋白的rod1基因或rod1等位基因。所述“敲除的rod1基因”可以是完全敲除的rod1基因，不编码有功能的ROD1蛋白，或可以是部分敲除的rod1基因，编码活性减少的ROD1蛋白。所述“敲除的rod1基因”或“敲除的rod1等位基因”可以是突变rod1等位基因或突变rod1基因，其可以不编码有功能的ROD1蛋白或可以编码活性减少的突变ROD1蛋白。这种基因或等位基因也可以称作失活的基因或等位基因。
如本文所用的“有功能的ROD1基因”或“有功能的ROD1等位基因”是编码有功能的ROD1蛋白的ROD1基因或ROD1等位基因。
如本文所用，“突变rod1基因”或“突变rod1等位基因”指在天然种群或繁育种群的植物中不存在，但是通过人类干预如诱变或基因打靶产生的任何rod1基因或rod1等位基因。突变rod1等位基因包括敲除的rod1等位基因和有功能的rod1等位基因。
有功能的ROD1蛋白是具有参比欧洲油菜ROD1-A1基因编码的蛋白质的至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％活性的ROD1蛋白，如实施例4中所述例如在酵母中所检验，其中参比欧洲油菜ROD1-A1基因编码具有如SEQ ID No.3中所述的氨基酸序列的蛋白质。
功能减少的突变ROD1蛋白是突变rod1基因编码的ROD1蛋白，其中与野生型rod1基因编码的相应野生型ROD1蛋白相比，所述ROD1蛋白具有减少的活性。所述活性可以减少至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％。
术语“核酸序列”(或核酸分子)指处于单链或双链形式的DNA或RNA分子，尤其编码本发明蛋白质或蛋白质片段的DNA。“内源核酸序列”指植物细胞内部的核酸序列，例如在芸苔属植物细胞的核基因组内部存在的ROD1基因的内源等位基因。“分离的核酸序列”用来指不再处于其天然环境(例如在体外或处于重组细菌或植物宿主细胞)中的核酸序列。
术语“基因”意指与调节区(例如启动子)有效连接的包含下述区域(转录的区域)的DNA序列，其中所述区域在细胞中转录成RNA分子(例如转录成包含内含子序列的前mRNA，所述前mRNA随后剪接成成熟mRNA，或直接转录成无内含子序列的mRNA)。基因可以因而包含几个有效连接的序列，如启动子、包含例如参与翻译起始的序列的5’前导序列、(蛋白质)编码区(cDNA或基因组DNA)和包含例如转录终止位点的3’非翻译序列。“内源基因”用来区分“外来基因”、“转基因”或“嵌合基因”，并且指来自某个植物属、物种或品种的植物的基因，所述基因没有通过转化过程引入该植物中(即它不是一个“转基因”)，但是它正常情况下存在于这个属、物种或变种的植物中，或所述基因通过正常育种技术或通过体细胞杂交(例如通过原生质体融合法)从该基因正常情况下存在于其中的另一个植物属、物种或变种的植物引入该植物中。类似地，基因的“内源等位基因”没有通过植物转化法引入植物或植物组织中，但是例如通过植物诱变和/或选择来产生或通过筛选天然植物群体来获得。
“基因的表达”或“基因表达”指这样的过程，其中与适宜调节区、尤其启动子有效连接的DNA区域转录成RNA分子。该RNA分子随后在细胞内部(通过转录后过程)进一步加工，例如通过RNA剪接和翻译起始以及翻译成氨基酸链(多肽)并且由翻译终止密码子终止翻译。术语“功能性表达”在本中用来表示产生有功能的蛋白质；术语“未功能性表达”在本中用来表示产生功能(生物活性)显著减少或无功能的蛋白质或表示没有产生蛋白质(见下文)。
术语“蛋白质”或“多肽”互换地使用并指由氨基酸的链组成的分子，而不指具体作用模式、大小、三维结构或起源。ROD1蛋白的“片段”或“部分”因此仍可以称作“蛋白质”。“分离的蛋白质”用来指不再处于其天然环境(例如在体外或处于重组细菌性或植物宿主细胞)中的蛋白质。
如本文中所用，术语“等位基因”意指基因在特定基因座的任意一个或多个可变形式。在生物的二倍体(或双二倍体)细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或基因座处。一个等位基因存在于成对同源染色体的每条染色体上。
如本文中所用，术语“同源染色体”意指这样的染色体，它们含有相同生物学特征的信息并且在相同基因座处含有相同的基因，但可能含有这些基因的不同等位基因。同源染色体是减数***期间配对的染色体。代表某生物的全部生物学特征的“非同源染色体”形成一个集合，并且细胞中的集合数目称作倍性。二倍体生物含有两组非同源染色体，其中每条同源染色体从不同的亲本继承。在双二倍体物种中，实质上存在两组二倍体基因组，因而这两个基因组的染色体称作“同源染色体”(并且类似地，这两个基因组的基因座或基因称作同源基因座或基因)。二倍体或双二倍体物物种可以在特定基因座处包含巨大数目的不同等位基因。
如本文中所用，术语“杂合”意指当两个不同等位基因位于某个特定基因座处，但各自定位在细胞中的相应同源染色体对上的遗传情况。相反，如本文中所用，术语“纯合”意指两个相同等位基因位于某个特定基因座处，但各自定位在细胞中的相应同源染色体对上的遗传情况。
如本文所用，术语“基因座”(复数形式：基因座(loci))意指染色体上其中存在例如基因或遗传标记的一个特定位置或多个位置或一个位点。
如本文中所用，“野生型”(也书写为“野生型(wildtype)”或“野生型(wild-type)”)指植物或基因如其在自然界中最常存在的典型形式。“野生型植物”指在天然群体中或育种种群中的植物。“野生型等位基因”指在野生型植物中存在的基因的等位基因。
无论何时提到本发明的“植物”或“多个植物”时，除非另外说明，否则应当理解本文中还包括植物部分(细胞、组织或器官、种荚、种子、分开的部分如根、叶、花、花粉等)、植物的仍保留亲本的区别特征(尤其果实开裂特性)的子代、如通过自交或杂交获得的种子，例如(通过两个近交亲本系杂交获得的)杂种、杂交植物和从中衍生的植物部分。
如本文所用，“产生繁殖材料”指本领域已知的产生其他植物、植物部分或种子的任何手段并且尤其包括营养性繁殖方法(例如空中压条法或地面压条法、分株、嫁(芽)接、微繁殖，匍匐茎或长匐茎、贮藏器官如鳞茎、球茎、块茎和根状茎、striking或插条、双鳞片)、有性繁殖(与另一株植物杂交)和无性繁殖(例如单性生殖、体细胞杂交)。
如本文中所用，“诱变”指这样的过程，其中植物细胞(例如，多个拟南芥种子或其他部分，如花粉等)接受一种技术，所述技术在所述细胞的DNA中引起突变，如接触诱变剂如化学物质(如甲磺酸乙酯(EMS)、乙基亚硝脲(ENU)等)或电离辐射(中子(如在快中子诱变法等中)、α射线、伽玛射线(如钴60源所提供)、X-射线、紫外辐射等)，或接受T-DNA***诱变(Azpiroz-Leehan等人(1997)Trends Genet 13:152-156)、转座子诱变(McKenzie等人(2002)Theor Appl Genet 105:23-33)或组织培养诱变(诱导体细胞克隆变异)或这些技术中两者或更多者的组合作用。因此，可以通过上文方法之一完成一种或多种ROD1等位基因的所需诱变。尽管通过辐射产生的突变经常是巨大缺失或其他严重损伤如易位或复杂重排，然而通过化学诱变产生的突变经常是更离散的损伤如点突变。例如，EMS使鸟嘌呤碱基烷基化，这导致碱基错配：烷基化的鸟嘌呤将与胸腺嘧啶碱基配对，从而主要产生G/C至A/T转换。诱变后，使用已知技术从处理的细胞再生芸苔属植物。例如，可以根据常规培育方法种植所得的芸苔属植物种子并且在自我授粉后，在该植物上形成种子。备选地，可以提取重双单倍体小植物以立即形成纯合植物，例如，如Coventry等人(1988,Manual forMicrospore Culture Technique for Brassica napus.Dep.Crop Sci.Techn.Bull.OAC Publication 0489.Univ.of Guelph,Guelph,Ontario,Canada)所描述。可以收获因这种自我授粉在当前或后续世代中形成的额外种子并对其筛选突变rod1等位基因的存在。已知几项技术筛选特定突变等位基因，例如,DeleteageneTM(缺失-一个-基因；Li等人,2001,Plant J 27：235-242)使用聚合酶链反应(PCR)测定法来筛选通过快中子诱变法产生的缺失突变体，TILLING(基因组中定向诱导的局部损伤；McCallum等人,2000,NatBiotechnol 18:455-457)鉴定EMS诱导的点突变等。在下文实施例中描述筛选特定突变rod1等位基因的存在的额外技术。
术语“基因打靶”在本文中指使用机理如同源重组、错配修复或位点定向诱变的定向基因修饰。该方法可以用来在植物细胞中替换、***和缺失内源序列或先前引入的序列。用于基因打靶的方法可以在例如WO2006/105946或WO 2009/002150中找到。基因打靶可以用来产生突变rod1等位基因，如敲除的rod1等位基因。
“品种”在本文中遵照UPOV公约使用，并且指在最低已知阶元的单一植物学分类单位内部的植物群，所述植物群可以通过因给定基因型或基因型组合所致的特征的表达定义，可以因至少一个所述特征的表达而与任何其他植物群区分并且就其以恒定方式(稳定)繁殖的适宜性而言视为一个单位。
术语“包含”将解读为指明存在所述的部分、步骤或组分，但不排除存在一个或多个额外部分、步骤或部分。包含某个性状的植物因而可以包含额外的性状。
可以理解当提及单数形式的某个词汇(例如一株植物或一个根)时，本文中也包括复数形式(例如多株植物、多个根)。因而，借助非限定冠词“a”或“an”对某要素的提及不排除存在多于一个该要素的可能性，除非上下文清楚地要求应当存在一个要素且仅存在一个所述要素。非限定冠词“a”或“an”因而通常意指“至少一个”。
出于本发明目的，两个相关核苷酸序列或氨基酸序列的“序列同一性”(表述为百分数)指两条经最优比对的序列中具有相同残基的位置的数目(x 100)除以比较的位置的数目。空位(即，比对结果中一个残基存在于一个序列中但不存在于另一个序列中的位置)视为具有不相同残基的位置。根据欧洲分子生物学开放软件包(The European Molecular Biology OpenSoftware Suite)(EMBOSS,Rice等人,2000,Trends in Genetics 16(6):276-277；例如参见http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)中的Needleman和Wunsch总体比对算法(Needleman和Wunsch,1970,J MolBiol 48(3):443-53)，使用默认设置(空位开放罚分＝10(用于核苷酸)/10(用于蛋白质)和空位延伸罚分＝0.5(用于核苷酸)/0.5(用于蛋白质))，通过在整个长度范围内比对两个序列，找到这两个序列的“最佳比对”。对于核苷酸，所用的默认计分矩阵是EDNAFULL，并且对于蛋白质，默认计分矩阵是EBLOSUM 62。
如本文中所用，“基本上相同”或“基本上相似”指当如上文所定义最佳比对时，共有至少某个最小百分数的(如下文进一步定义的)序列同一性的序列。
“严格杂交条件”可以用来鉴定与给定的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列。严格条件具有序列依赖性并且会在不同环境中不同。通常，选择严格条件为在确定的离子强度和pH下，低于特定序列的热解链温度(Tm)约5℃。Tm是(在确定的离子强度和pH下)这样的温度，在所述温度，50％的靶序列与完美匹配的探针杂交。一般，将选择其中盐浓度是在pH 7约0.02摩尔并且温度是至少60℃的严格条件。降低盐浓度和/或增加温度增加了严格性。用于RNA-DNA杂交的严格条件(使用例如100nt的探针的RNA印迹)例如是包括至少一次在63℃于0.2X SSC中20分钟洗涤或等同条件洗涤的那些条件。
可以例如通过以下方式提供“高严格性条件”：在65℃于含有6x SSC(20x SSC含有3.0M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)、5x Denhardt(100xDenhardt含有2％Ficoll、2％聚乙烯吡咯烷酮、2％牛血清白蛋白)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)和作为非特异性竞争物的20μg/ml变性载体DNA(单链鱼精DNA，平均长度为120-3000个核苷酸)的水溶液中杂交。在杂交后，可以在几个步骤中进行高严格性洗涤，在杂交温度于0.2-0.1×SSC，0.1％SDS中进行最终洗涤(约30分钟)。
“中等严格性条件”指与上述溶液中但是在约60-62℃杂交等同的条件。中等严格性洗涤可以在杂交温度于1x SSC，0.1％SDS中进行。
“低严格性”指与上述溶液中在约50-52℃杂交等同的条件。低严格性洗涤可以在杂交温度于2x SSC，0.1％SDS中进行。还参见Sambrook等人(1989)和Sambrook和Russell(2001)。
发明详述
本发明基于芜青中和甘蓝中4种ROD1基因的鉴定及欧洲油菜中8种ROD1基因的鉴定，和芸苔属植物ROD1基因产物在脂肪酸去饱和中作用的鉴定。
本发明的第一实施方案是提供一种包含至少一种ROD1基因的芸苔属植物或其植物细胞、部分、种子或子代，特征在于至少一种ROD1基因是失活或敲除的ROD1基因。所述至少一种ROD1基因可以例如是一种ROD1基因、或两种ROD1基因，或四种ROD1基因、或八种ROD1基因。在又一个实施方案中，所述芸苔属植物是芜青，并且所述敲除的rod1基因是编码与SEQ ID No.15、与SEQ ID No.18、与SEQ ID No.21或与SEQ ID No.24具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因的敲除等位基因，如包含编码与SEQ ID No.15具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因的敲除等位基因的芜青植物。在又一个实施方案中，所述芸苔属植物是甘蓝，并且所述敲除的rod1基因是编码与SEQ ID No.27、与SEQ ID No.30、与SEQ ID No.33或与SEQ ID No.36具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因的敲除等位基因，如包含编码与SEQ ID No.30具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因的敲除等位基因的甘蓝植物。在又一个实施方案中，所述芸苔植物是欧洲油菜，并且所述敲除的rod1基因是编码与SEQ ID No.3或SEQ ID No.6具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因的敲除等位基因，如从选自以下的种子可获得的欧洲油菜：已经按检索号NCIMB 41995保藏在NCIMB的包含HIOL306的种子、已经按检索号NCIMB 42000保藏在NCIMB的包含HIOL307的种子、已经按检索号NCIMB 41996保藏在NCIMB的包含HIOL310的种子、已经按检索号NCIMB 42001保藏在NCIMB的包含HIOL313的种子、已经按检索号NCIMB 41997保藏在NCIMB的包含HIOL316的种子、已经按检索号NCIMB 41998保藏在NCIMB的包含HIOL318的种子和已经按检索号NCIMB 41999保藏在NCIMB的包含HIOL319的种子，或如包含两个敲除rod1等位基因的欧洲油菜，所述敲除等位基因之一是编码与SEQ ID No.3具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因的敲除等位基因，并且所述敲除等位基因之一是编码与SEQ ID No.6具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因的敲除等位基因。
在又一个实施方案中，所述芸苔属植物对所述敲除的rod1基因纯合。
如本文所用的至少90％序列同一性可以是至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少98％序列同一性，或可以是100％序列同一性。
编码与SEQ ID No.15具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因的敲除等位基因可以是ROD1基因的与SEQ ID No.13具有至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少98％序列同一性或具有100％序列同一性的敲除等位基因。
编码与SEQ ID No.27具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因的敲除等位基因可以是ROD1基因的与SEQ ID No.25具有至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少98％序列同一性或具有100％序列同一性的敲除等位基因。
编码与SEQ ID No.3或SEQ ID No.6具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因的敲除等位基因可以是ROD1基因的分别与SEQ ID No.1、SEQ ID No.4具有至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少98％序列同一性或具有100％序列同一性的敲除等位基因。
所述ROD1基因的敲除等位基因可以是突变ROD1基因，其相对于野生型核酸序列包含一个或多个核苷酸缺失、***或取代。所述突变可以在编码的蛋白质的氨基酸序列中导致一种或多种变化(缺失，***和/或取代)，所述蛋白质不是有功能的ROD1蛋白。
本发明的核酸序列
提供了编码有功能的ROD1蛋白的野生型ROD1核酸序列和来自芸苔属植物、尤其来自欧洲油菜、芜青和芸苔的ROD1基因的突变rod1核酸序列(包含一个或多个突变，优选地不导致编码的ROD1蛋白的生物活性显著减少或导致不产生ROD1蛋白的突变)。
然而，本文中也提供分离的ROD1和rod1核酸序列(例如通过克隆从植物分离或通过DNA合成法合成产生)以及其变体和任意的这些序列的片段，因为这些序列可以用来确定哪个序列内源存在于植物或植物部分中、该序列是否编码有功能、无功能的蛋白质或不编码蛋白质(例如，通过如下文所述的重组宿主细胞中的表达确定)和用于选择特定等位基因并将其从一个植物转移至另一个植物中，旨在产生具有所需功能性等位基因和突变等位基因组合的植物。
已经从欧洲油菜分离ROD1-A1、ROD1-C1、ROD1-A2、ROD1-C2、ROD1-A3和ROD1-C4的核酸序列，已经从甘蓝分离并且从芜青分离ROD1-1、ROD1-2、ROD1-3和ROD1-4的核酸序列，如序列表中所述。描述了野生型ROD1序列，同时参考野生型ROD1序列，下文和实施例中描述了这些序列的和基本上与这些序列相似的序列的突变rod1序列。来自欧洲油菜、甘蓝和芜青的编码ROD1蛋白的基因组DNA包含任何内含子。在序列表中还描述了不包含内含子的芸苔属植物ROD1基因的编码序列或cDNA序列。
如本文所用，“欧洲油菜ROD1-A1基因”、“BnROD1-A1基因”、“欧洲油菜ROD1-A1等位基因”、“BnROD1-A1等位基因”或“来自欧洲油菜的ROD1-A1”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.1具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
如本文所用，“欧洲油菜ROD1-C1基因”、“BnROD1-C1基因”、欧洲油菜ROD1-C1等位基因”、“BnROD1-C1等位基因”或“来自欧洲油菜的ROD1-C1”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.4具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
如本文所用，“欧洲油菜ROD1-A2基因”、“BnROD1-A2基因”、“欧洲油菜ROD1-A2等位基因”、“BnROD1-A2等位基因”或“来自欧洲油菜的ROD1-A2”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.7具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
如本文所用，“欧洲油菜ROD1-C2基因”、“BnROD1-C2基因”、“欧洲油菜ROD1-C2等位基因”、“BnROD1-C2等位基因”或“来自欧洲油菜的ROD1-C2”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.10具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
如本文所用，“欧洲油菜ROD1-A3基因”、“BnROD1-A3基因”、“欧洲油菜ROD1-A3等位基因”、“BnROD1-A3等位基因”或“来自欧洲油菜的ROD1-A3”或其变体核酸序列指其cDNA序列与SEQ ID No.84具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
如本文所用，“欧洲油菜ROD1-C3基因”、“BnROD1-C3基因”、“欧洲油菜ROD1-C3等位基因”、“BnROD1-C3等位基因”或“来自欧洲油菜的ROD1-C3”或其变体核酸序列指其cDNA序列与SEQ ID No.86具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
如本文所用，“欧洲油菜ROD1-A4基因”、“BnROD1-A4基因”、“欧洲油菜ROD1-A4等位基因”、“BnROD1-A4等位基因”或“来自欧洲油菜的ROD1-A4”或其变体核酸序列指其cDNA序列与SEQ ID No.88具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
如本文所用，“欧洲油菜ROD1-C4基因”、“BnROD1-C4基因”、“欧洲油菜ROD1-C4等位基因”、“BnROD1-C4等位基因”或“来自欧洲油菜的ROD1-C4”或其变体核酸序列指其cDNA序列与SEQ ID No.90具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
如本文所用，“芜青ROD1-1基因”、“BnROD1-1基因”、“芜青ROD1-1等位基因”、“BnROD1-1等位基因”或“来自芜青的ROD1-1”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.13具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
如本文所用，“芜青ROD1-2基因”、“BnROD1-2基因”、“芜青ROD1-2等位基因”、“BnROD1-2等位基因”或“来自芜青的ROD1-2”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.16具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
如本文所用，“芜青ROD1-3基因”、“BnROD1-3基因”、“芜青ROD1-3等位基因”、“BnROD1-3等位基因”或“来自芜青的ROD1-3”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.19具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
如本文所用，“芜青ROD1-4基因”、“BnROD1-4基因”、“芜青ROD1-4等位基因”、“BnROD1-4等位基因”或“来自芜青的ROD1-4”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.22具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
如本文所用，“甘蓝ROD1-1基因”、“BoROD1-1基因”、“甘蓝ROD1-1等位基因”、“BoROD1-1等位基因”或“来自甘蓝的ROD1-1”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.25具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
如本文所用，“甘蓝ROD1-2基因”、“BoROD1-2基因”、甘蓝ROD1-2等位基因”、“BoROD1-2等位基因”或“来自甘蓝的ROD1-2”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.28具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
如本文所用，“甘蓝ROD1-3基因”、“BoROD1-3基因”、“甘蓝ROD1-3等位基因”、“BoROD1-3等位基因”或“来自甘蓝的ROD1-3”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.31具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
如本文所用，“甘蓝ROD1-4基因”、“BoROD1-4基因”、甘蓝ROD1-4等位基因”、“BoROD1-4等位基因”或“来自甘蓝的ROD1-4”或其变体核酸序列指与SEQ ID No.34具有至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的基因、等位基因或序列。
因此，本发明提供了编码野生型有功能的ROD1蛋白的核酸序列，包括其变体和片段(如下文进一步定义)，以及这些核酸序列中任一者的突变核酸序列，因而与野生型ROD1蛋白相比，所述核酸序列中的突变优选地导致***、缺失或取代一个或多个氨基酸。优选地，核酸序列中的突变产生一个或多个氨基酸改变(即相对于野生型氨基酸序列，***、缺失和/或取代一个或多个氨基酸)，因而ROD1蛋白的生物活性显著减少或完全消除。
可以如实施例4中所述或如Lu等人(2009)Proc Natl Acad Sci USA106:18839所描述例如在酵母中检验ROD1蛋白的功能。
本文中提供了内源核酸序列和分离的核酸序列。根据本发明另一个方面，还提供了上文所定义的ROD1序列和ROD1变体核酸序列的片段，用作引物或探针和用作试剂盒的组分(进一步参见下文)。ROD1或rod1核酸序列或(如定义的)其变体的“片段”可以具有多种长度，如ROD1或rod1序列(或变体序列)的至少10、12、15、18、20、50、100、200、500、600个连续核苷酸。
编码野生型ROD1蛋白的野生型核酸序列
序列表中所述的核酸序列编码来自欧洲油菜、来自芜青和来自甘蓝的野生型ROD1蛋白。因而，这些序列对于从中分离它们的芸苔属植物是内源的。
可以对其他芸苔属作物物种、变种、繁育系或野生种质筛选编码相同ROD1蛋白或其变体的其他ROD1等位基因。例如，核酸杂交技术(例如DNA印迹分析，使用例如严格杂交条件)或基于核酸扩增的技术如PCR技术可以用来鉴定对于其他芸苔属植物(如多个欧洲油菜、芜青或甘蓝变种、品系或种质)内源的ROD1等位基因。为了对此类植物、植物器官或组织筛选ROD1等位基因的存在，可以使用序列表中提供的ROD1核酸序列或这些核酸序列中任意序列的变体或片段。例如，可以使用完整序列或片段作为探针或引物。例如，特异性或简并性引物可以用来从植物、植物器官或组织的基因组DNA扩增编码ROD1蛋白的核酸序列。可以使用标准分子生物学技术分离这些ROD1核酸序列并测序。生物信息学分析随后可以用来表征等位基因，例如以确定哪个ROD1等位基因对应于该序列和哪种ROD1蛋白或蛋白质变体由该序列编码。
另外，应当理解可以通过对核酸数据库筛选基本上相似的序列，以计算机方式鉴定ROD1核酸序列及其变体(或这些核酸序列中任意序列的片段)。类似地，核酸序列可以化学合成。也提供了下文进一步描述的本发明核酸分子的片段。
编码突变ROD1蛋白的突变核酸序列
相对于野生型核酸序列包含一个或多个核苷酸缺失、***或取代的核酸序列是本发明的另一个实施方案，而这类突变核酸分子的片段也是本发明的另一个实施方案。如下文进一步描述，使用多种已知方法，可以产生和/或鉴定此类突变核酸序列(称作rod1序列)。再次，此类核酸分子以内源形式和以分离的形式提供。在一个实施方案中，突变导致编码的ROD1蛋白的氨基酸序列中的一个或多个改变(缺失、***和/或取代)(即，它不是“沉默突变”)。在另一个实施方案中，与野生型蛋白相比，核酸序列中的突变导致所编码的ROD1蛋白的显著减少或彻底消除的生物活性。
敲除的ROD1基因因此可以包含一个或多个突变，如：
(a)“错义突变”，它是核酸序列中导致一个氨基酸取代另一个氨基酸的改变；
(b)“无义突变”或“终止密码子突变”，它是在核酸序列中导致早熟终止密码子的引入并因而翻译终止(产生截短的蛋白质)的改变；植物基因含有翻译终止密码子“TGA”(RNA中是UGA)、“TAA”(RNA中是UAA)和“TAG”(RNA中是UAG)；因而导致这些密码子之一处于正在翻译的成熟mRNA中(可读框中)的任何核苷酸取代、***、缺失将终止翻译；
(c)一个或多个氨基酸的“***突变”，这归因于该核酸的编码序列中已经添加一个或多个密码子；
(d)一个或多个氨基酸的“缺失突变”，这归因于该核酸的编码序列中缺失一个或多个密码子；
(e)“移码突变”，其导致核酸序列在该突变下游的一个不同可读框中翻译。移码突变可能具有多种原因，如***、缺失或重复一个或多个核苷酸；
(f)剪接位点突变，导致改变的剪接，这导致改变的mRNA加工并因此导致编码的蛋白质改变，所述蛋白质含有各种长度的缺失、取代或***，可能与早熟翻译终止组合。
因而，在一个实施方案中，提供了包含一个或多个任何类型的上文所述突变的核酸序列。在另一个实施方案中，提供了包含一个或多个终止密码子(无义)突变、一个或多个错义突变、一个或多个移码突变和/或一个或多个剪接位点突变的rod1序列。提供任一个上述突变核酸序列本身(处于分离的形式)，同样也提供了内源包含此类序列的植物和植物部分。在下文的表中，描述了最优选的rod1等位基因并且包含一种或多种突变rod1等位基因的欧洲油菜种子的种子保藏物已经如所示那样保藏。
在表1a-p中分别显示BnROD1-A1、BnROD1-C1、BnROD1-A2、BnROD1-C2、BoROD1-1、BrROD1-1、BoROD1-2、BrROD1-2、BoROD1-3、BrROD1-3、BoROD1-4和BrROD1-4基因中一系列可能的EMS终止密码子突变，并且在表1q-ab中分别显示BnROD1-A1、BnROD1-C1、BnROD1-A2、BnROD1-C2、BoROD1-1、BrROD1-1、BoROD1-2、BrROD1-2、BoROD1-3、BrROD1-3、BoROD1-4、和BrROD1-4基因中一系列可能的EMS剪接位点突变。
表1a：BnROD1-A1中的可能终止密码子突变
表1b：BnROD1-C1中的可能终止密码子突变
表1c：BnROD1-A2中的可能终止密码子突变
表1d：BnROD1-C2中的可能终止密码子突变
表1e：BnROD1-A3中的可能终止密码子突变
表1f：BnROD1-C3中的可能终止密码子突变
表1g：BnROD1-A4中的可能终止密码子突变
表1h：BnROD1-C4中的可能终止密码子突变
表1i：BoROD1-1中的可能终止密码子突变
表1j：BrROD1-1中的可能终止密码子突变
表1k：BoROD1-2中的可能终止密码子突变
表1l：BrROD1-2中的可能终止密码子突变
表1m：BoROD1-3中的可能终止密码子突变
表1n：BrROD1-3中的可能终止密码子突变
表1o：BoROD1-4中的可能终止密码子突变
表1p：BrROD1-4中的可能终止密码子突变
表1q：BnROD1-A1中的可能剪接位点突变
表1r：BnROD1-C1中的可能剪接位点突变
表1s：BnROD1-A2中的可能剪接位点突变
表1t：BnROD1-C2中的可能剪接位点突变
表1u：BoROD1-1中的可能剪接位点突变
表1v：BrROD1-1中的可能剪接位点突变
表1w：BoROD1-2中的可能剪接位点突变
表1x：BrROD1-2中的可能剪接位点突变
表1y：BoROD1-3中的可能剪接位点突变
表1z：BrROD1-3中的可能剪接位点突变
表1aa：BoROD1-4中的可能剪接位点突变
表1ab：BrROD1-4中的可能剪接位点突变
显然，突变不限于上表中所示的那些，并且可以理解，除序列表中所述和上表中提到的那些之外，类似的终止突变可以存在于rod1等位基因中。终止密码子突变和导致氨基酸取代的突变均可以导致功能减少或无可检测活性的蛋白质。
在另一个实施方案中，欧洲油菜中所述敲除的rod1基因选自包含以下突变的核酸：
-在SEQ ID No.1的第1802位置处G至A突变；
-在SEQ ID No.1的第1822位置处G至A突变；
-在SEQ ID No.1的第1834位置处C至T突变；
-在SEQ ID No.1的第1866位置处G至A突变；
-在SEQ ID No.4的第2956位置处G至A突变；
-在SEQ ID No.4的第3005位置处G至A突变；
-在SEQ ID No.4的第3008位置处G至A突变；
-在SEQ ID No.4的第3040位置处C至T突变；
-在SEQ ID No.4的第3046位置处G至A突变；
-在SEQ ID No.4的第2968位置处C至T突变。
在一个具体实施方案中，欧洲油菜中所述敲除的rod1基因选自包含以下突变的核酸：
-在SEQ ID No.1的第1834位置处C至T突变；
-在SEQ ID No.1的第1866位置处G至A突变；
-在SEQ ID No.4的第2380位置处G至A突变；
-在SEQ ID No.4的第2429位置处G至A突变；
-在SEQ ID No.4的第2470位置处G至A突变；
-在SEQ ID No.4的第2392位置处C至T突变。
来自如本文所述的A基因组的野生型和突变ROD1核酸序列如BnROD1-A1、BnROD1-A2、BnROD1-A3、BnROD1-A4、BrROD1-1、BrROD1-2、BrROD1-3和BrROD1-4也适合用于包含A基因组的其他芸苔属物种(Brassica sp.)如芥菜(Brassica juncea)中。
来自如本文所述的C基因组的野生型和突变ROD1核酸序列如BnROD1-C1、BnROD1-C2、BnROD1-C3、BnROD1-C4、BoROD1-1、BoROD1-2、BoROD1-3和BoROD1-4也适合用于包含C基因组的其他芸苔属物种如埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)中。
本发明的氨基酸序列
提供来自十字花科、特别来自芸苔属物种、特别来自欧洲油菜、芜青和甘蓝的野生型ROD1氨基酸序列和突变ROD1氨基酸序列(包含一个或多个突变，优选地导致ROD1蛋白的生物活性显著减少或无生物活性的突变)。另外，诱变方法可以用来在野生型ROD1等位基因中产生突变，因而产生可以编码其他突变ROD1蛋白的突变等位基因。在一个实施方案中，野生型和/或突变ROD1氨基酸序列在芸苔属植物内部(即内源地)提供。然而，本文中也提供分离的ROD1氨基酸序列(例如从植物分离或合成方式产生)以及其变体和这些序列中任一序列的片段。
已经分离来自欧洲油菜的ROD1-A1、ROD1-C1、ROD1-A2和ROD1-C2蛋白、来自芜青的ROD1-1、ROD1-2、ROD1-3和ROD1-4蛋白和来自甘蓝的ROD1-1、ROD1-2、ROD1-3和ROD1-4蛋白的氨基酸序列，如序列表中所述。描述了野生型ROD1序列，同时参考野生型ROD1序列，下文描述了这些序列的和基本上与这些序列相似的序列的突变ROD1序列。
本发明的“欧洲油菜ROD1-A1氨基酸序列”或“BnROD1-A1氨基酸序列”或其变体氨基酸序列根据是与SEQ ID NO:3具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
根据本发明的“欧洲油菜ROD1-C1氨基酸序列”或“BnROD1-C1氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:6具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
根据本发明的“欧洲油菜ROD1-A2氨基酸序列”或“BnROD1-A2氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:9具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
根据本发明的“欧洲油菜ROD1-C2氨基酸序列”或“BnROD1-C2氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:12具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
根据本发明的“欧洲油菜ROD1-A3氨基酸序列”或“BnROD1-A3氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:85具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
根据本发明的“欧洲油菜ROD1-C3氨基酸序列”或“BnROD1-C3氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:87a具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
根据本发明的“欧洲油菜ROD1-A4氨基酸序列”或“BnROD1-A4氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:89具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
根据本发明的“欧洲油菜ROD1-C4氨基酸序列”或“BnROD1-C4氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:91具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
根据本发明的“芜青ROD1-1氨基酸序列”或“BrROD1-1氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:15具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
根据本发明的“芜青ROD1-2氨基酸序列”或“BrROD1-2氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:18具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
根据本发明的“芜青ROD1-3氨基酸序列”或“BrROD1-3氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:21具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
根据本发明的“芜青ROD1-4氨基酸序列”或“BrROD1-4氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:24具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
根据本发明的“甘蓝ROD1-1氨基酸序列”或“BoROD1-1氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:27具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
根据本发明的“甘蓝ROD1-2氨基酸序列”或“BoROD1-2氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:30具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
根据本发明的“甘蓝ROD1-3氨基酸序列”或“BoROD1-3氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:33具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
根据本发明的“甘蓝ROD1-4氨基酸序列”或“BoROD1-4氨基酸序列”或其变体氨基酸序列是与SEQ ID NO:36具有至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列也可以称作与序列表中提供的ROD1序列“基本上相似”或“基本上相同”。
因此，本发明提供了野生型蛋白的氨基酸序列，包括其变体和片段(如下文进一步定义)，以及这些氨基酸序列中任一序列的突变氨基酸序列，因而与相应野生型ROD1蛋白的生物活性相比，氨基酸序列中的突变优选地导致ROD1蛋白的生物活性显著减少或完全消除。
本文中提供了内源氨基酸序列和分离的氨基酸序列。还提供是上文定义的ROD1氨基酸序列和ROD1变体氨基酸序列的片段。ROD1氨基酸序列或其变体(如定义)的“片段”可以具有多种长度，如ROD1序列(或变体序列)的至少10、12、15、18、20、50、100、150、175、180个连续氨基酸。
野生型ROD1蛋白的氨基酸序列
序列表中所述的氨基酸序列是来自欧洲油菜的野生型ROD1蛋白。因而，这些序列对于从中分离它们的欧洲油菜植物是内源的。如上所述，可以对其他芸苔属植物、变种、繁育系或野生种质筛选具有相同氨基酸序列的其他有功能的ROD1蛋白或其变体。
另外，应当理解可以通过对氨基酸数据库筛选基本上相似的序列，以计算机方式鉴定ROD1核酸序列及其变体(或这些氨基酸序列中任意序列的片段)。也提供本发明氨基酸分子的片段。
突变ROD1蛋白的氨基酸序列
相对于野生型氨基酸序列包含一个或多个氨基酸缺失、***或取代的氨基酸序列是本发明的另一个实施方案，而这类突变氨基酸分子的片段也是本发明的另一个实施方案。如上所述，使用多种已知方法，可以产生和/或鉴定此类突变氨基酸序列。再次，此类氨基酸分子以内源形式和以分离的形式提供。
在一个实施方案中，与野生型蛋白相比，氨基酸序列中的突变导致ROD1蛋白的显著减少或彻底消除的生物活性。基本上如上所述，产生相对于野生型蛋白而言包含至少一个氨基酸***、缺失和/或取代的蛋白质的任何突变可以导致明显减少的生物活性或无生物活性。
因此，在一个实施方案中，提供了包含一个或多个缺失突变或***突变的突变ROD1蛋白，因而所述缺失或***产生具有明显减少的体内活性或没有体内活性的突变蛋白。此类突ROD1蛋白是其中与野生型ROD1蛋白相比，缺失、***或取代至少1个、至少2,3,4,5,10,20,30,50,100,150,200个或更多个氨基酸的ROD1蛋白，因而所述缺失或***产生具有明显减少的活性或没有活性的突变蛋白。
在另一个实施方案中，提供了截短的突变ROD1蛋白，因而所述的截短产生具有明显减少的活性或没有活性的突变蛋白。
因此在又一个实施方案中，提供了包含一个或多个取代突变的突变ROD1蛋白，因而所述取代产生具有明显减少的活性或没有活性的突变蛋白。
在又一个实施方案中，来自欧洲油菜的所述突变体ROD1蛋白选自包含以下突变的蛋白质：
-在SEQ ID No.3的第138位置处氨基酸后的截短；
-在SEQ ID No.3的第146位置处R至K的取代；
-在SEQ ID No.3的第150位置处T至I取代；
-在SEQ ID No.3的第161位置处G至S取代；
-在SEQ ID No.6的第142位置处E至K取代；
-在SEQ ID No.6的第158位置处R至H取代；
-在SEQ ID No.6的第159位置处G至D取代；
-在SEQ ID No.6的第170位置处P至S取代；
-在SEQ ID No.6的第145位置处氨基酸后截短；
在一个具体实施方案中，欧洲油菜中所述敲除的rod1基因选自包含以下突变的核酸：
-在SEQ ID No.3的第150位置处T至I取代；
-在SEQ ID No.3的第161位置处G至S取代；
-在SEQ ID No.6的第142位置处E至K取代；
-在SEQ ID No.6的第158位置处R至H取代；
-在SEQ ID No.6的第145位置处的氨基酸后截短；
在又一个实施方案中，提供包含嵌合基因的转基因芸苔属植物，所述嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段：植物可表达启动子，转录时产生抑制至少一种ROD1基因RNA分子的DNA区域；和任选地在植物细胞中有功能的转录终止和多聚腺苷化区。在另一个实施方案中，所述转基因芸苔属植物是欧洲油菜，并且所述RNA分子对编码与SEQ ID No.3具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因并对编码与SEQ ID No.6具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因抑制。
对至少一种ROD1基因抑制的RNA分子可以是通过降低可用于翻译的ROD1mRNA的水平下调ROD1基因表达的RNA。所述RNA可以通过例如共抑制作用(有义RNA抑制)、反义RNA，双链RNA(dsRNA)或微RNA(miRNA)或ta-siRNA下调ROD1基因表达。
所述对至少一种ROD1基因抑制的RNA分子的特征在于，所述RNA分子包含与所述待下调的ROD1基因具有足够同源性的区域。
如本文所用，与待下调ROD1基因的足够同源性意指转录的DNA区域(和所得的RNA分子)包含与待下调ROD1基因的核苷酸序列或其互补核苷酸序列具有至少95％序列同一性的至少20个连续核苷酸。
所述对至少一种ROD1基因抑制的RNA分子可以是能够通过共抑制作用下调一个或多个有功能的ROD1基因表达的有义RNA分子。所述RNA分子包含至少20个连续核苷酸，所述连续核苷酸与植物细胞或植物中存在的一种或多种ROD1基因的核苷酸序列具有至少95％序列同一性。
所述对至少一种ROD1基因抑制的RNA分子还可以是能够下调一个或多个有功能的ROD1基因表达的反义RNA分子。所述RNA分子包含至少20个连续核苷酸，所述连续核苷酸与植物细胞或植物中存在的一种或多种有功能的ROD1基因的核苷酸序的互补序列具有至少95％序列同一性。
ROD1基因的约20个nt的反义或有义RNA区域的最短核苷酸序列可以包含于一个较大RNA分子内部，所述较大RNA分子在大小上从20个nt变动至等同于靶基因大小的长度。提到的反义或有义核苷酸区域可以因此长从约21nt至约1300nt，如长21nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt或甚至约1300nt或更长。另外，出于本发明的目的，不要求所用的抑制性ROD1RNA分子或转基因编码区的核苷酸序列与旨在植物细胞中减少其表达的内源ROD1基因完全相同或互补。序列越长，对总体序列同一性要求的严格性越低。因此，有义或反义区可以与内源ROD1基因的核苷酸序列或其互补序列具有约40％或50％或60％或70％或80％或90％或100％的总体序列同一性。然而，如所提到，反义或有义区应当包含与内源ROD1基因的核苷酸序列具有约95％至约100％序列同一性的20个连续核苷酸的核苷酸序列。具有约95％至约100％序列同一性的一段序列可以是约50个、75个或100个nt。将显而易见，可以按有义和/或反义方向在所提到的长度和序列同一性之间进行全部组合。
上述嵌合基因还可以包含导致异常、非多聚腺苷酸化的ROD1抑制性RNA分子表达的DNA元件。适用于此目的的这样一种DNA元件是编码自剪接核酶的DNA区域，如WO 00/01133中所述。如WO 03/076619中所述，也可以通过提供具有细胞核定位或停留信号的所产生的RNA分子增强效率。
所述对至少一种ROD1基因抑制的RNA分子还可以是能够下调ROD1基因表达的双链RNA分子。一旦转录该DNA区域，则RNA能够借助有义区和反义区之间的常规碱基配对作用形成dsRNA分子，因而有义区和反义区是如前文所述的核苷酸序列。本发明对编码dsRNA的减少ROD1表达的嵌合基因还可以包含内含子，例如异源内含子，根据WO 99/53050的公开内容，所述内含子位于例如有义RNA区和反义RNA区之间的间隔序列中。为实现这种转基因的构建，可以利用WO 02/059294A1中所述的载体。
所述对至少一种ROD1基因抑制的RNA分子还可以是前miRNA分子，所述前miRNA分子加工成能够指导切割ROD1mRNA的miRNA。miRNA是调节植物中和其他真核生物中基因表达的内源性小RNA。在植物中，这些长约21个核苷酸的RNA通过DICERLIKE1(DCL1)的切割活性而从长的内源性前miRNA的茎-环区加工而来。植物miRNA与保守的靶mRNA高度互补并且指导其靶的切割。miRNA似乎是调节本身参与发育的复杂通路网络的基因表达的关键组分。
如本文所用，“miRNA”是长度约20至22个核苷酸的RNA分子，RNA分子可以载入RISC复合物中并且指导对靶RNA分子的切割，其中所述靶RNA分子包含与该miRNA分子的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列，其中可以存在一个或多个下述错配：
-在所述miRNA 5'末端的核苷酸与靶RNA分子中的相应核苷酸序列之间的错配；
-在所述miRNA第1位置至第9位置中的任一个核苷酸与靶RNA分子中的相应核苷酸序列之间的错配；
-在所述miRNA第12位置至第21位置中的任一个核苷酸与靶RNA分子中的相应核苷酸序列之间的三个错配，条件是存在不超过两个连续错配；
在所述miRNA第10和第11位置不允许错配(全部miRNA位置均从该miRNA分子的5’端开始显示)。
如本文所用，“前miRNA”分子是具有约100至约200个核苷酸、优选地约100至约130个核苷酸的RNA分子，所述RNA分子可以采用下述二级结构，所述二级结构包含dsRNA茎和单链RNA环，并且还在双链RNA茎中包含miRNA的核苷酸序列及其miRNA*的互补序列。优选地，该miRNA及其互补序列位于距离该miRNA dsRNA茎的游离末端约10个至约20个核苷酸处。单链环区域的长度和序列并非关键并且可以大幅度变动，例如，长度在30至50nt之间。优选地，未配对和配对的RNA结构之间的自由能差异在-20与-60kcal/摩尔之间，特别地在-40kcal/摩尔左右。miRNA与miRNA*之间的互补性不需要完美，并且约1个至3个非配对核苷酸凸起可以容忍。可以通过本领域常规的计算机算法如mFold、UNAFold和RNAFold预测RNA分子所采用的二级结构。来自前miRNA中的dsRNA茎的特定链由5'端处的互补性程度决定，其中所述特定链因DCL活性释放并加载到RISC复合体上，因而在其5'端处最少参与已切割的dsRNA茎的不同链的核苷酸之间成氢键作用的链加载到RISC复合体上并且将决定靶RNA分子降解的序列特异性。但是，如果在经验上来自特定合成性前miRNA分子的miRNA分子因为“错误”链加载到RISC复合物上而无功能，则立即显而易见的是，可以通过交换miRNA分子及其互补物在前miRNA分子的dsRNA茎的相应链上的位置解决这个问题。如本领域已知，涉及两个氢键的A和U之间结合作用或涉及两个氢键的G和U之间的结合作用不如涉及三个氢键的G和C之间的结合作用强。
miRNA分子可以包含于其天然存在的前miRNA分子中，但是也可以通过将从这种现存的前miRNA分子中正常加工的miRNA分子的核苷酸序列交换成另一个目的miRNA的核苷酸序列，将它们引入现存的前miRNA分子支架中。前miRNA的支架也可以是完全合成的。类似地，合成的miRNA分子可以包含于现存的前-miRNA分子支架或合成性前miRNA支架中或从中加工出来。
所述对至少一种ROD1基因抑制的RNA分子还可以是如WO2006/074400中所述的ta-siRNA。
所述RNA分子可以对存在于所述芸苔属植物中的全部ROD1基因抑制。例如，所述转基因芸苔属植物是芜青，并且所述RNA分子对下述ROD1基因抑制：编码与SEQ ID No.15具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因、和编码与SEQ ID No.18具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因、和编码与SEQ ID No.21具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因、和编码与SEQ ID No.24具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因，如分别与SEQ ID No.13、SEQ ID No.16、SEQ ID No.19或SEQ ID No.22具有至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少98％序列同一性或具有100％序列同一性的ROD1基因。另外，所述转基因芸苔属植物可以是甘蓝，并且所述RNA分子可以对下述ROD1基因抑制：编码与SEQ ID No.27具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因、和编码与SEQ ID No.30具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因、和编码与SEQ ID No.33具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因、和编码与SEQ ID No.36具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因，如分别与SEQ ID No.25、SEQ ID No.28、SEQ ID No.31或SEQ ID No.34具有至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少98％序列同一性或具有100％序列同一性的ROD1基因。备选地，所述转基因芸苔属植物可以是欧洲油菜，并且所述RNA分子可以对下述ROD1基因抑制：编码与SEQ ID No.3具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因、和编码与SEQ ID No.6具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因、和编码与SEQ ID No.9具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因、和编码与SEQ ID No.12具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因、和编码与SEQ ID No.85具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因、和编码与SEQ ID No.87具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因、和编码与SEQ ID No.89具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因、和编码与SEQ ID No.91具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因，如分别与SEQ ID No.1、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.10、SEQ ID No.84、SEQ ID No.86、SEQ IDNo.88或SEQ ID No.90具有至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少98％序列同一性或具有100％序列同一性的ROD1基因。所述对至少一种ROD1基因抑制的RNA分子可以例如包含SEQ ID No.48的第1405-3650nt的序列。
所述RNA分子还可以抑制仅编码有功能的蛋白质的ROD1基因，如编码与SEQ ID No.3和SEQ ID No.6具有至少90％序列同一性的蛋白质的欧洲油菜ROD1基因，如R分别与SEQ ID No.1和与SEQ ID No.4具有至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少98％序列同一性或具有100％序列同一性的ROD1基因。所述对至少一种ROD1基因抑制的RNA分子可以例如包含SEQ ID No.47的第1405-3072nt的序列。
所述RNA分子还可以抑制仅一种ROD1基因，例如，对下述ROD1基因抑制：编码与SEQ ID No.15具有至少90％序列同一性的蛋白质的芜青ROD1基因，如与SEQ ID No.13具有至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少98％序列同一性或具有100％序列同一性的ROD1基因，或如编码与SEQ ID No.27具有至少90％序列同一性的蛋白质的甘蓝ROD1基因，如与SEQ ID No.25具有至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少98％序列同一性或具有100％序列同一性的ROD1基因。
如本文中使用时，术语“植物可表达启动子”意指能够在植物细胞中控制(启动)转录的DNA序列。这包括植物来源的任何启动子，还包括能够在植物细胞中指导转录的任何非植物源启动子，即，某些病毒源或细菌来源启动子，例如CaMV 35S(Harpster等人(1988)Mol Gen Genet.212(1):182-90，地三叶病毒启动子No 4或No 7(WO 9606932)或T-DNA基因启动子，还包括组织特异性或器官特异性启动子，包括但不限于种子特异性启动子(例如，WO 89/03887)、器官原基特异性定启动子(An等人(1996)Plant Cell 8(1):15-30)、茎特异性启动子(Keller等人(1988)EMBO J.7(12):3625-3633)、叶特异性启动子(Hudspeth等人(1989)Plant Mol Biol.12:579-589)、叶肉特异性启动子(如光诱导型核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子)、根特异性启动子(Keller等人(1989)Genes Dev.3:1639-1646)、块茎特异性启动子(Keil等人(1989)EMBO J.8(5):1323-1330)、维管组织特异性启动子(Peleman等人(1989)Gene 84:359-369)、雄蕊选择性启动子(WO 89/10396、WO 92/13956)、开裂区特异性启动子(WO 97/13865)等。
如本文所用，“异源启动子”指一种启动子，所述启动子正常情况下在其天然环境中不结合在本发明的DNA分子中与该启动子有效连接的编码性DNA区域。
所述植物可表达启动子可以例如是组成型启动子，如CaMV 35S启动子(Harpster等人(1988)Mol Gen Genet.212(1):182-90)，或种子特异性启动子，如拟南芥油质蛋白启动子(WO 1998/045461)。
组成型启动子是本领域熟知的并且包括CaMV 35S启动子(Harpster等人(1988)Mol Gen Genet.212(1):182-90)、肌动蛋白启动子，例如，来自稻肌动蛋白基因的启动子(McElroy等人,1990,Plant Cell 2:163)、木薯叶脉花叶病毒启动子(Verdaguer等人,1996Plant Mol.Biol.31:1129)、GOS启动子(de Pater等人,1992,Plant J.2:837)、组蛋白H3启动子(Chaubet等人1986,Plant Mol Biol 6:253)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂氨酸合成酶(Nos)启动子(Depicker等人,1982,J.Mol.Appl.Genet.1:561)，或遍在蛋白启动子，例如，玉米遍在蛋白1基因启动子(Christensen等人,1992,Plant Mol.Biol.18:675)。
种子特异性启动子是本领域熟知的，包括拟南芥油质蛋白启动子(WO1998/045461)、DE10211617中描述的来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子；WO 2009/073738中描述的启动子序列；如WO 2009/077478中所述用于种子特异性基因表达的来自欧洲油菜的启动子；US2007/0022502中描述的植物种子特异性启动子；WO 03/014347中描述的植物种子特异性启动子；WO 2009/125826中描述的种子特异性启动子；WO 2006/005807中描述的ω_3脂肪酸去饱和酶家族的启动子。
如本文所用的“转录终止和多聚腺苷化区”是驱动新生RNA的切割的序列，此后在所产生的RNA 3’末端添加植物中有功能的多聚(A)尾。植物中有功能的转录终止和多聚腺苷化信号包括但不限于3’no、3’35S、3’his和3’g7。
在又一个实施方案中，本发明植物的种子具有增加的C18:1水平、或增加的C18:1水平和降低的C18:2水平、或增加的C18:1水平和降低的SATS水平。
在又一个实施方案中，提供来自本发明植物(即包含敲除的ROD1基因或抑制ROD1基因的RNA的植物)的种子。在又一个实施方案中，提供来自本发明植物的种子的油。
在另一个实施方案中，提供一种用于增加种子油中C18:1水平的方法，所述方法包括调节ROD1基因的表达。在又一个实施方案中，提供一种用于增加种子油中C18:1水平的方法，所述方法包括步骤引入或提供嵌合基因至芸苔属植物细胞以产生转基因细胞，所述嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段：植物可表达启动子；转录时产生抑制至少一种ROD1基因的RNA分子的DNA区域；和任选地在植物细胞中有功能的转录终止和多聚腺苷化区；并且从所述转基因细胞再生转基因植物。
如本文所用的“C18:1”，也称作“油酸”、“顺式-9-十八烯酸”、“18:1”、“18:1(n-9)”、“9c-18:1”或“18:1cisΔ9“，指单不饱和ω-9脂肪酸，IUPAC名称为(9Z)-十八碳-9-烯酸。
如本文所用、“C18:2”，也称作”亚油酸”、“顺式-9,12-十八碳二烯酸”、“18:2”、“18:2(n-6)”、“9c12c-18:1或“18:2cisΔ9,12“，指具有18碳链和两个双键的羧酸，IUPAC名称为顺式,顺式-9,12-十八碳二烯酸。
如本文所用，SATS指饱和脂肪酸，其指C12:0、C14:0、C16:0、C18:0、C20:0、C22:0和C24:0的总水平。
种子油中渐增的C18:1水平或增加的C18:1水平可以是C18:1水平升高至少2％、或至少5％、或至少8％、或至少10％、或至少12％。所述增加是相对于如对照植物中所获得的C18:1水平的增加。
降低的C18:2水平可以是种子油中C18:2水平下降至少2％、或至少5％、或至少8％、或至少10％、或至少20％、或至少30％。
降低的SATS水平可以是种子油中SATS的水平下降至少2％、或至少3％、或至少5％。SATS水平下降指C16:0、C18:0、C20:0、C22:0和C24:0总和的总水平下降。因而，SATS水平下降可以是仅一种饱和脂肪酸或多于一种饱和脂肪酸的水平下降。
任选地，种子中或种子油中C18:1水平的增加或C18:2或SATS的下降比膜脂质中C18:1水平的增加或C18:2或SATS的下降更大。例如，种子中C18:1水平升高或C18:2水平或SATS增加，但是膜脂质中C18:1水平、C18:2水平和SATS水平未改变。
C18:1水平、C18:2水平和SATS水平可以如本文所述那样测量，例如，使用如实施例5和6中所述的方法测量。
如本文所用的“对照植物”通常是相同物种的植物，所述植物具有ROD1的野生型水平。如本文所用，“ROD1的野生型水平”指植物中ROD1蛋白的一般水平，如同它在自然界中最通常发生的水平。所述对照植物含有对ROD1抑制的RNA分子，并且其中ROD1基因是野生型ROD1基因。
可以使用本领域熟知的方法向植物或植物细胞提供嵌合基因。认为向植物细胞提供嵌合体的方法对本发明并非关键，并且可以使用向植物细胞提供适于特定植物物种的嵌合基因的任何方法。这类方法是本领域熟知的并且包括农杆菌介导的转化法、粒子枪递送法、微量注射法、完好细胞的电穿孔法、聚乙二醇介导的原生质体转化法、原生质体的电穿孔法、脂质体介导的转化法、硅晶须介导的转化法等。可以将所述嵌合体瞬时引入植物细胞或植物细胞核中。所述嵌合体可以稳定整合至所述植物细胞的基因组中，产生转化的植物细胞。以这种方式获得的转化植物细胞随后可以再生成成熟能育的转化植物。
获得的转化植物(其包含对至少一种ROD1基因抑制的RNA分子)可以在常规育种方案中用来产生具有相同特征的更多转化植物，或用来在相同或相关植物物种的其它品种中或在杂交植物中引入本发明的转基因。从转化植物中获得的种子含有作为稳定基因组***片段的本发明嵌合基因，并且也由本发明包括。
在又一个实施方案中，提供一种用于增加种子油中C18:1水平的方法，所述方法包括步骤：用诱变性化学物质或用电离辐射处理种子或植物材料；鉴定突变的ROD1基因的植物，其中ROD1基因，在经突变之前，编码与SEQ ID No.3、与SEQ ID No.6、与SEQ ID No.15或与SEQ ID No.27具有至少90％序列同一性的多肽；并且与其中ROD1基因未突变的植物相比，选择种子中C18:1水平升高的植物。
所述ROD1基因，在经突变之前，可以例如是与SEQ ID No.1、或SEQID No.4、或SEQ ID No.13、或SEQ ID No.25具有至少90％序列同一性，或至少95％序列同一性，或至少98％序列同一性或具有100％序列同一性的ROD1基因。
在又一个实施方案中，提供一种用于获得种子中具有增加的C18:1水平的芸苔属植物的方法，所述方法包括步骤：在所述芸苔属植物中引入ROD1基因的敲除等位基因并且通过以下方式针对所述ROD1基因的敲除等位基因的存在，选择种子中具有增加的C18:1水平的所述芸苔属植物：对来自所述植物的基因组DNA分析至少一种分子标记物的存在，其中所述至少一种分子标记物与所述ROD1基因的敲除等位基因连锁。
可以通过如上文所述的诱变或基因打靶引入ROD1的所述敲除等位基因。还可以通过将敲除的ROD1等位基因从一个植物引入另一个植物中，引入所述敲除的等位基因。
在另一个实施方案中，提供一种确定ROD1基因的敲除等位基因在生物样品中存在或不存在的方法，所述方法包括提供来自所述生物样品的基因组DNA并且对所述DNA分析至少一种分子标记物的存在，其中至少一种分子标记物与所述ROD1基因的敲除等位基因连锁。
可以通过从所述生物样品分离基因组DNA，提供所述基因组DNA。分离基因组DNA涉及从如组织的分离部分(例如叶的部分)分离包含基因组DNA的生物样品。从所述生物样品分离基因组DNA可以，但是不必须包括纯化来自所述样品的基因组DNA。
又一个实施方案，提供一种用于检测芸苔DNA样品中ROD1基因的敲除等位基因的试剂盒，其中所述试剂盒包含一个或多个PCR引物对，所述PCR引物对能够扩增与所述ROD1基因的敲除等位基因连锁的DNA标记。在又一个实施方案中，所述试剂盒还包含一种或多种探针。
在一个具体实施方案中，所述ROD1基因的敲除等位基因是突变ROD1等位基因。
在又一个实施方案中，提供一种确定植物或其细胞、部分、种子或子代中突变ROD1等位基因的接合性状态的方法，所述方法包括确定所述植物或其细胞、部分、种子或子代的基因组DNA中突变体和/或相应野生型ROD1特异性区域的存在。
然而，又一个实施方案提供一种用于转移来自一个植物的至少一种敲除的ROD1等位基因至另一个植物的方法，所述方法包括步骤：鉴定包含至少一种敲除的ROD1等位基因的第一植物；将第一植物与不包含至少一种敲除的ROD1等位基因的第二植物杂交并从杂种收集F1杂交种子；任选地，鉴定包含至少一种敲除的ROD1等位基因的F1植物；将包含至少一种敲除的ROD1等位基因的F1植物与不包含至少一种敲除的ROD1等位基因的第二植物回交至少一个世代(x)并且从杂种收集BCx种子；在每个世代中通过对所述BCx植物的基因组DNA分析至少一种分子标记物的存在，鉴定包含至少一种敲除的ROD1等位基因的BCx植物，其中至少一种分子标记物与所述敲除的ROD1等位基因连锁。
与所述ROD1基因的敲除等位基因连锁的分子标记物或所述突变ROD1等位基因可以包含如下文所述的特异性检测所述ROD1基因的所述敲除等位基因的一种或更多种引物或探针
本发明的方法
可以使用一系列在本领域为常规的方法，例如使用扩增部分或全部ROD1基因组或cDNA的基于核酸扩增的方法，产生(例如通过诱变法诱导)和/或鉴定突变rod1等位基因。
诱变后，使用已知技术从处理的种子长出或从处理的细胞再生出芸苔属植物。例如，可以根据常规培育方法种植诱变的种子并且在自花授粉后，在该植物上形成种子。备选地，可以从处理的小孢子或花粉细胞提取双单倍体小植物以立即形成纯合植物，例如，如Coventry等人(1988,Manualfor Microspore Culture Technique for Brassica napus.Dep.Crop Sci.Techn.Bull.OAC Publication 0489.Univ.of Guelph,Guelph,Ontario,Canada)所描述。可以在当前或后续世代收获因这种自花授粉形成的额外种子并且使用本领域常用的技术，例如基于核酸扩增的技术，如基于聚合酶链反应(PCR)的技术(扩增rod1等位基因)或基于杂交的技术，例如DNA印迹分析、BAC文库筛选等和/或对rod1等位基因直接测序，筛选突变ROD1等位基因的存在。为了筛选突变ROD1等位基因中点突变(所谓单核苷酸多态性或SNP)的存在，可以使用本领域常规的SNP检测方法，例如基于寡核苷酸连接(oligoligation)的技术、基于单碱基延伸的技术或基于限制性位点中差异的技术，如TILLING。
如上所述，对特定野生ROD1等位基因的(自发的以及诱导的)诱变导致在所得的突变ROD1等位基因中存在一个或多个缺失、***或取代的核苷酸(在下文称作“突变区域”)。突变ROD1等位基因可以因而由野生型ROD1等位基因中一个或多个缺失、***或取代的核苷酸的位置和构型表征。野生型ROD1等位基因中已经分别***、缺失或取代一个或多个核苷酸的位点在本文中也称作“突变区或序列”。如本文中所用，“5’或3’侧翼区或序列”指在突变(或相应野生型)ROD1等位基因中至少20bp、优选至少50bp、至少750bp、至少1500bp和直至5000bp DNA的DNA区域或序列，所述DNA区域或序列不同于含有所述一个或多个缺失、***或取代核苷酸的DNA，优选地不同于来自所述突变(或相应野生型)ROD1等位基因的DNA，所述DNA紧邻所述突变ROD1等位基因(或在相应的野生型ROD1等位基因)中突变区上游并且与之连续存在(5’侧翼区或序列”)或者紧邻突变区下游并且与之连续存在(3’侧翼区或序列”)。如本文所用，“连接区”指在突变(或相应野生型)ROD1等位基因中突变区和5’或3’侧翼区彼此连接的DNA区域。“跨越突变区和5’或3’侧翼区之间连接区的序列”因此包含突变序列以及与之连续存在的侧翼序列。
为鉴定特定突变ROD1等位基因或包含特定突变ROD1等位基因的植物或植物材料或包含植物材料(其包含特定突变ROD1等位基因)的产品所开发的工具是基于特定突变ROD1等位基因与相应野生型ROD1等位基因的基因组特征相比的特定基因组特征，如包含突变区的基因组区的特异性限制图谱、包含如下文描述的引物和/或探针的分子标记物或侧翼区和/或突变区的序列。
一旦已经将特定突变ROD1等位基因测序，则可以借助分子生物学技术开发分子标记物，如引物和探针，所述分子标记物特异性识别在样品的核酸(DNA或RNA)中突变ROD1等位基因的5’侧翼区、3’侧翼区和/或突变区内的序列。例如，可以开发扩增方法以鉴定生物样品(如植物样品、植物材料样品或包含植物材料的产品的样品)中的突变ROD1等位基因。这种扩增基于至少两种“特异性引物”：识别突变ROD1等位基因的5’或3’侧翼区域内序列的一种引物和识别突变ROD1等位基因的3’或5’侧翼区域内序列的另一种引物；或识别突变ROD1等位基因的5’或3’侧翼区域内序列的一种引物和识别突变ROD1等位基因的突变区内序列的另一种引物；或分别识别突变ROD1等位基因的5’或3’侧翼区内序列的一种引物和识别下述序列的另一种引物，所述序列跨越特定突变ROD1等位基因的3’或5’侧翼区和突变区之间的连接区(如下文进一步描述)。
所述引物优选地具有15个至35个核苷酸的序列，所述核苷酸在优化的扩增条件下“特异性识别”5’或3’侧翼区内的序列、突变区内的序列或跨越特定突变ROD1等位基因的3’或5’侧翼区和突变区之间连接区内的序列，因而从包含特定突变ROD1等位基因的核酸样品中扩增特异性片段(“突变ROD1特异性片段”或区分性扩增子)。这意味在优化的扩增条件下仅扩增所靶向的突变ROD1等位基因并且不扩增植物基因组中的其他序列。
适用于本发明的PCR引物可以是以下引物：
-长度范围从17nt至约200nt的寡核苷酸，其包含选自特定突变
ROD1等位基因的5’或3’侧翼序列中的至少17个连续核苷酸、优选地
20个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列(即，例如在本发明的突变
ROD1等位基因中缺失、***或取代的一个或多个核苷酸5’或3'侧翼的
序列，如在上文所述的无义突变、错意突变、移码突变或剪接位点突变
或在上表中所示的终止密码子突变或上文所示的取代突变5’或3'侧翼的
序列或其互补序列)(识别5’侧翼序列的引物)；
-长度范围从17nt至约200nt的寡核苷酸，其包含选自特定突变ROD1等位基因的突变区的序列中至少17个连续核苷酸、优选地20个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补核苷酸序列(即，例如具有在本发明ROD1基因中***或取代的核苷酸的序列或其互补序列)(识别突变序列的引物)。
引物当然可以比提到的17个连续核苷酸更长，并且可以长例如18、19、20、21、30、35、50、75、100、150、200nt或甚至更长。所述引物可以完全由选自侧翼序列和突变序列的所提及核苷酸序列中的核苷酸序列组成。然而，引物在其5’端(即3’存在的17个连续核苷酸外侧的)核苷酸序列是较不重要的。因而，所述引物的5’序列可以根据需要由选自侧翼序列或突变序列的核苷酸序列组成，但是可以含有几个(例如1、2、5、10个)错配。所述引物的5’序列甚至可以完全由与侧翼序列或突变序列不相关的核苷酸序列(例如代表限制酶识别位点的核苷酸序列)组成。这类不相关序列或带错配的侧翼DNA序列应当优选地不长于100个、更优选地不长于50个或甚至25个核苷酸。
另外，合适的引物可以包含下述核苷酸序列或由其组成，所述的核苷酸序列跨越侧翼序列和突变序列之间的连接区(即，例如，在本发明的突变ROD1等位基因中缺失、***或取代的一个或多个核苷酸5’或3'侧翼的序列和具有***或取代的一个或多个核苷酸的序列或分别在缺失的一个或多个核苷酸3’或5’旁侧分布的序列之间的连接区，如在本发明的ROD1基因中上文所述的无义突变、错义突变、移码突变或剪接位点突变3’或5'旁侧分布的序列和具有所述无义突变、错义突变、移码突变或剪接位点突变的序列之间的连接区、或在上表中所示的潜在终止密码子突变或上文所示的取代突变5’或3'旁侧分布的序列和分别具有所述潜在终止密码子突变或取代突变的序列之间的连接区，条件所述核苷酸序列不仅仅从突变区或侧翼区衍生。
技术人员也将马上明白：恰当选择的PCR引物对还应当不包含彼此互补的序列。
出于本发明的目的，“SEQ ID No:X中所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列”是可以通过以下方式从所代表的核苷酸序列衍生的核苷酸序列：将所述核苷酸根据Chargaff’法则替换为其互补性核苷酸并以5’至3’方向(即以所代表的核苷酸序列的相反方向)读取该序列。
在实施例中描述了合适鉴定特定突变ROD1等位基因的引物的例子。
如本文中所用，“SEQ ID No.Z从第X位置第Y位置的核苷酸序列”指包括两个核苷酸终点在内的核苷酸序列。
优选地，扩增的片段具有50个至1000个核苷酸的长度，如，50个至500个核苷酸的长度或50至350个核苷酸的长度。特异性引物可以具有这种序列，所述序列与特定突变ROD1等位基因的5’或3’侧翼区内部的序列、与其突变区内部的序列、与跨越其3’或5’侧翼区和突变区之间连接区的序列有80％至100％同一性，条件是错配仍允许用这些引物在优化的扩增条件下特异性鉴定特定突变ROD1等位基因。但是，可允许错配的范围可以通过实验轻易确定并且是本领域技术人员已知的。
可以按多种方式进行“突变ROD1特异性片段”的检测和/或鉴定，例如，通过凝胶电泳或毛细管电泳后检查大小或通过基于荧光的检测方法。也可以对突变ROD1特异性片段直接测序。用于检测扩增的DNA片段的其他序列特异性方法也是本领域已知的。
本领域中描述了标准核酸扩增方案，如PCR方案，如在'PCRApplications Manual"(Roche Molecular Biochemicals,第2版,1999)和其他参考文献中描述。在每种特定突变ROD1等位基因的“PCR鉴定方案”中详述用于扩增的最适条件(包括特异性引物的序列)。然而，可以理解PCR鉴定方案中的许多参数可能需要针对具体实验室条件调整并且可以作出轻微修改以获得相似的结果例如，。用于制备DNA的不同方法的使用可能需要调整，例如所用的引物的量、聚合酶、MgCl2浓度或复性条件。类似地，其他引物的选择可以决定用于PCR鉴定方案的其他最适条件。但是，对本领域技术人员而言，这些调整将显而易见并且在目前的PCR应用手册(如上文引用的那本手册)中进一步详述。
备选地，特异性引物可以用来扩增突变ROD1特异性片段，所述片段可以用作鉴定生物学样品中特定突变体ROD1等位基因的“特异性探针”。生物样品的核酸与探针在允许该探针与核酸中相应片段杂交的条件下的接触导致核酸/探针杂交分子的形成。可以检测这种杂交分子的形成(例如标记所述核酸或探针)，因而这种杂交分子的形成指示存在特定突变ROD1等位基因。本领域中已经描述这类基于与特异性探针(在固相载体上或在溶液中)杂交的鉴定方法。特异性探针优选地是在优化条件下与特定突变ROD1等位基因的5’或3’侧翼区内部和/或其突变区内部的区域(下文称作“突变ROD1特异性区域”)特异性杂交的序列。优选地，此特异性探针包含长度在10和1000bp之间、50和600bp之间、100和500bp之间、150和350bp之间的序列，所述序列与特定区域的核苷酸序列有至少80％、优选地地80％至85％、更选地85％至90％、尤其优选地90％至95％、最优选地95％至100％同一性(或互补)。优选地，该特异性探针将包含与特定突变ROD1等位基因的特定区域相同(或互补)的约13个至约100个连续核苷酸的序列。
适用于本发明的特异探针可以是以下探针：
-长度范围从13nt至约1000nt的寡核苷酸，其包含选自特定突变ROD1等位基因的5’或3’侧翼序列中的至少13个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列(即，例如在本发明的突变ROD1等位基因中缺失、***或取代的一个或多个核苷酸5’或3'侧翼的序列，如在上文所述的无义突变、错意突变、移码突变或剪接位点突变5’或3'侧翼的序列或在上表中所示的潜在终止密码子突变或上文所示的取代突变5’或3'侧翼的序列)，或与之具有至少80％序列同一性的序列(识别5’侧翼序列的探针)；或
-长度范围从13nt至约1000nt的寡核苷酸，其包含选自特定突变ROD1等位基因的突变序列中至少13个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补核苷酸序列(即，例如具有在本发明ROD1基因中***或取代的核苷酸的序列，或其互补序列)，或与之具有至少80％序列同一性的序列(识别突变序列的探针)。
所述探针可以完全由选自侧翼序列和突变序列的所提及核苷酸序列中的核苷酸序列组成。然而，探针在其5'或3'端的核苷酸序列较不重要。因而，所述探针的5'或3'序列可以根据需要由选自侧翼序列或突变序列的核苷酸序列组成，但是可以由与侧翼序列或突变序列不相关的核苷酸序列组成。这类不相关的序列应当优选地不长于50个、更优选地不长于25个或甚至不长于20个或15个核苷酸。
另外，合适的探针可以包含下述核苷酸序列或由其组成，所述的核苷酸序列跨越侧翼序列和突变序列之间的连接区(即，例如，在本发明的突变ROD1等位基因中缺失、***或取代的一个或多个核苷酸5’或3'侧翼的序列和具有***或取代的一个或多个核苷酸的序列或分别在缺失的一个或多个核苷酸3’或5’侧翼的序列之间的连接区，如在本发明的ROD1基因中上文所述的无义突变、错义突变、移码突变或剪接位点突变5’或3'侧翼的序列和具有所述无义突变、错义突变、移码突变或剪接位点突变的序列之间的连接区、或在上表中所示的潜在终止密码子突变或上文所示的取代突变5’或3'侧翼的序列和分别具有所述潜在终止密码子突变或取代突变的序列之间的连接区)，条件是提到的核苷酸序列不仅仅从突变区或侧翼区衍生。
可以按多种方式检测和/或鉴定与特异性探针杂交的“突变ROD1特异性区域”，例如，通过凝胶电泳后检查大小或通过基于荧光的检测方法。用于检测与特异性探针杂交的“突变ROD1特异性区域”的其他序列特异性方法也是本领域已知的。
备选地，可以使用其他方法，如使用PCR筛选通过快中子诱变法产生的缺失突变体的“DeleteageneTM法”(Li和Zhang,2002,Funct IntegrGenomics 2:254-258综述)、通过使用检测碱基对改变的变性高效液相色谱(DHPLC)借助异源双链体分析鉴定EMS诱导的点突变的TILLING法(定向诱导的基因组中局部损伤)(McCallum等人,2000,Nat Biotech 18:455和McCallum等人2000,Plant Physiol.123,439-442)等，产生并鉴定包含一种或多种突变rod1等位基因的植物或植物部分。如所提及，TILLING使用针对突变的高通量筛选法(例如使用Cel 1切割突变-野生型DNA异源双链体并使用测序凝胶***检测)。因此，本文中涵盖使用TILLING鉴定包含一种或多种突变rod1等位基因的植物或植物部分和用于产生并鉴定这类植物、植物器官、组织和种子的方法。因而在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：诱变植物种子(例如EMS诱变)、汇集植物个体或DNA、PCR扩增目的区域、异源双链体形成和高通量检测、鉴定突变植物、突变PCR产物的测序。可以理解，其他诱变方法和选择方法可以同等地用来产生此类突变植物。
可以通过本领域已知的方法鉴定天然(自发)突变等位基因，而不是在ROD1等位基因中诱导突变。例如，ECOTILLING可以用来(Henikoff等人2004,Plant Physiology 135(2):630-6)对多个植物或植物部分筛选天然突变rod1等位基因的存在。就上述的诱变技术而言，优选地筛选包含A和/或C基因组的芸苔属物种，从而鉴定的rod1等位基因可以随后通过杂交(种间或种内杂交)和选择引入其他芸苔属物种如欧洲油菜。在ECOTILLING中，通过上文所述的TILLING方法学筛选繁育系或相关物种中的天然多态性，其中将植物个体或汇集物用于PCR扩增rod1靶、异源双链体形成和高通量分析。随后可以选择具有所需突变的单个植物，其中所述植物随后可以用于育种计划中以掺入想要的突变等位基因。
鉴定的突变等位基因可以随后进行测序并且序列可以与野生型等位基因比较以鉴定突变。任选地可以如上文所示检验功能。使用这种方法，可以鉴定多个突变rod1等位基因(和包含这些等位基因中一个或多个等位基因的芸苔属植物)。想要的突变等位基因可以随后通过如下文进一步描述的杂交方法和选择方法与想要的野生型等位基因组合。最后，产生了包含想要数目的突变rod1和想要数目的野生型ROD1等位基因的单株植物。
适合作为PCR引物或特异性探针用于检测特定突变ROD1等位基因的寡核苷酸也可以用来开发多种方法以确定特定突变ROD1等位基因的接合性状态。
为了确定特定突变ROD1等位基因的接合性状态，可以开发基于核酸扩增的测定法以确定突变ROD1特异性等位基因和/或相应野生型ROD1特异性等位基因的存在。
为了确定特定突变ROD1等位基因的接合性状态，可以如此设计特异性识别野生型ROD1等位基因的两条引物，从而它们彼此相对并具有位于所述引物之间的突变区。这些引物可以是分别特异性识别5’和3’侧翼序列的引物。这套引物允许同时诊断性地扩增该突变体以及相应的野生型ROD1等位基因。
备选地，为了确定特定突变ROD1等位基因的接合性状态，可以如此设计特异性识别野生型ROD1等位基因的两种引物，从而它们彼此相对并且其中一者特异性识别突变区。这些引物可以是分别特异性识别野生型ROD1等位基因的5’或3’侧翼区及突变区序列的引物。这套引物，连同特异性识别突变ROD1等位基因中突变区序列的第三引物一起，允许同时诊断性扩增突变ROD1基因以及野生型ROD1基因。
备选地，为了确定特定突变ROD1等位基因的接合性状态，可以如此设计特异性识别野生型ROD1等位基因的两种引物，从而它们彼此相对并且其中一者特异性识别5’或3’侧翼区和突变区之间的连接区。这些引物可以是分别特异性识别5’或3’侧翼序列和野生型ROD1等位基因的突变区和3’或5’侧翼区之间连接区的引物。这套引物，连同分别识别突变ROD1等位基因的突变区和3’或5’侧翼区之间连接区的第三引物，允许同时诊断性地扩增突变ROD1基因以及野生型ROD1基因。
备选地，可以通过使用特异性识别突变及野生型ROD1等位基因的备选性引物组，确定某个特定突变ROD1等位基因的接合性状态。
如果该植物对突变ROD1基因或相应野生型ROD1基因为纯合，则上文所述的诊断性扩增测定法将产生对突变或野生型ROD1等位基因为典型、优选在长度方面为典型的单一扩增产物。如果该植物对这种突变ROD1等位基因为杂合，则两种特异性扩增产物将出现，反映为突变及野生型ROD1等位基因的同时扩增。
可以通过以下方式鉴定野生型及突变ROD1特异性扩增产物，例如通过凝胶电泳或毛细管电泳后估计大小(例如，针对包含许多***或缺失的核苷酸的突变ROD1等位基因，其中所述***或缺失的核苷酸在扩增自野生型及突变ROD1等位基因的片段之间造成大小差异，从而所述片段可以在凝胶上可视地分开)；通过凝胶电泳或毛细管电泳后评价这两个不同片段的存在或不存在，因而诊断性扩增突变ROD1等位基因可以任选地与诊断性扩增野生型ROD1等位基因分别进行；通过扩增片段的直接测序或通过基于荧光的检测方法。
在实施例中描述了合适确定特定突变ROD1等位基因接合性的引物的例子。
备选地，为了确定特定突变ROD1等位基因的接合性状态，可以开发基于杂交的测定法以确定突变ROD1特异性等位基因和/或相应野生型ROD1特异性等位基因的存在。
为了确定特定突变ROD1等位基因的接合性状态，可以按如此方式设计识别野生型ROD1等位基因的两个特异性探针，从而每个探针特异性识别ROD1野生型等位基因内部的序列并且突变区位于探针识别的序列之间。这些探针可以是分别特异性识别5’和3’侧翼序列的探针。使用这些探针之一、优选地使用这两个探针允许同时诊断性杂交突变ROD1等位基因以及相应的野生型ROD1等位基因。
备选地，为了确定特定突变ROD1等位基因的接合性状态，可以按如此方式设计识别野生型ROD1等位基因的两个特异性探针，从而这两个探针之一特异性识别ROD1野生型等位基因内部突变区上游或下游的序列、优选地突变区上游的序列并且这两个探针之一特异性识别突变区。这些探针可以是分别特异性识别野生型ROD1等位基因的5’或3’侧翼区(优选地5'侧翼区)序列和突变区序列的探针。使用这些探针之一、优选地使用这两个探针，任选地连同特异性识别突变ROD1等位基因中突变区序列的第三探针一起，允许同时诊断性杂交突变体和野生型ROD1基因。
备选地，为了确定特定突变ROD1等位基因的接合性状态，可以如此设计识别野生型ROD1等位基因的特异性探针，从而所述探针特异性识别野生型ROD1等位基因的5’或3’侧翼区(优选地5'侧翼区)和突变区之间的连接区。这种探针，任选地连同特异性识别突变ROD1等位基因的5’或3’侧翼区(优选地5'侧翼区)和突变区之间连接区的第二探针，允许诊断性地杂交所述突变体以及野生型ROD1基因。
备选地，可以通过使用特异性识别突变及野生型ROD1等位基因的备选性探针组，确定特定突变ROD1等位基因的接合性状态。
如果该植物对突变ROD1基因或相应野生型ROD1基因为纯合，则上文所述的诊断性杂交测定法将产生对突变ROD1基因或野生型ROD1等位基因为典型、优选地在长度方面为典型的单一特异性杂交产物，如一个或多个杂交DNA(限制性)片段。如果该植物对这种突变ROD1等位基因为杂合，则两种特异性杂交产物将出现，反映为突变及野生型ROD1等位基因均杂交。
可以通过以下方式鉴定野生型及突变ROD1特异性杂交产物，例如通过凝胶电泳或毛细管电泳后估计大小(例如，针对包含许多***或缺失的核苷酸的突变ROD1等位基因，其中所述***或缺失的核苷酸在来自野生型及突变ROD1等位基因的DNA(限制性)片段之间造成大小差异，从而所述片段可以在凝胶上可视地分开)；通过凝胶电泳或毛细管电泳后评价这两个不同特异性杂交产物的存在或不存在，因而诊断性杂交突变ROD1等位基因可以任选地与诊断性杂交野生型ROD1等位基因无分别进行；通过杂交DNA(限制性)片段的直接测序或通过基于荧光的检测方法。
另外，还可以使用本文中提供的特定突变ROD1等位基因的具体序列信息，开发专用于特定突变ROD1等位基因的检测方法，所述检测方法不同于基于PCR或基于杂交的扩增方法。这类备选性检测方法包括基于侵入性切割特定核酸结构的线性信号扩增检测方法，也称作InvaderTM技术(如在通过引用方式并入本文的例如美国专利5,985,557“核酸的侵入性切割”、美国专利6,001,567“通过入侵者指导的切割作用检测核酸序列”中描述)、基于RT-PCR的检测方法(如Taqman)或其他检测方法，如SNPlex。简而言之，在InvaderTM技术中，靶突变序列可以例如与包含突变序列的核苷酸序列的经标记的第一核酸寡核苷酸或跨越5'侧翼区和突变区之间连接区的序列杂交并且与包含紧邻突变序列下游并与之毗邻的3'侧翼序列的第二核酸寡核苷酸杂交，其中第一和第二寡核苷酸重叠至少一个核苷酸。通过这种杂交产生的双链体或三链体结构允许用酶进行选择性探针切割，靶序列保持完整。随后检测切割的经标记探针，可能借助导致进一步信号放大的中间步骤检测。
如本文中所用，“试剂盒”指一组试剂，所述试剂的目的在于实施本发明的方法、更具体地鉴定生物样品中的特定突变ROD1等位基因或确定包含特定突变ROD1等位基因的植物材料的接合性状态。更具体地，本发明试剂盒的优选实施方案包含如上所述的用于鉴定特定突变ROD1等位基因的至少两种特异性引物或用于确定接合性状态的至少两种或三种特异性引物。任选地，该试剂盒可以还包含PCR鉴定方案中本文所述的任何其他试剂。备选地，根据本发明的另一个实施方案，该试剂盒可以包含用于鉴定特定突变ROD1等位基因的至少一种特异性探针，所述特异性探针与生物样品的核酸特异性杂交以鉴定如上文所述的特定突变ROD1等位基因的存在，或用于确定接合性状态的至少两种或三种特异性探针。任选地，该试剂盒还可以包含使用所述特异性探针鉴定生物样品中特定突变ROD1等位基因的任何其他试剂(如但不限于杂交缓冲液、标记物)。
本发明的试剂盒可以用于以下目的，并且其组分可以针对以下目的专门调整：质量控制(例如，种子批的纯度)、检测特定突变ROD1等位基因在植物材料或者包含或衍生自植物材料的材料(如但不限于食品或饲料产品)中的存在或不存在。
如本文中所用的术语“引物”包括能够在模板依赖的过程如PCR中引发新生核酸合成的任意核酸。一般而言，引物是具有10个至30个核苷酸的寡核苷酸，但是可以使用更长序列。引物可以按双链形式提供，不过优选单链形式。探针可以作为引物使用，不过将探针设计为与靶DNA或RNA结合并且不需要用于扩增过程中。
当谈及特异性引物时，如本文中所用的术语“识别”指以下事实：特异性引物在本发明方法中所述的条件(如PCR鉴定方案条件)下与特定突变ROD1等位基因中的核酸序列特异性杂交，因而特异性由阳性对照和阴性对照的存在决定。
当谈及特异性探针时，如本文中所用的术语“杂交”指以下事实：该探针在标准严格性条件下与特定突变ROD1等位基因的核酸序列中的特定区域结合。如本文中所用，标准严格性条件指用于本文中所述的杂交的条件或指如Sambrook等人,19891989(Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbour Laboratory Press,NY)所述的常规杂交条件，所述常规杂交条件例如可以包括以下步骤：1)将植物基因组DNA片段或BAC文库DNA固定在滤膜上，2)将所述滤膜在65℃于6×SSC、5×Denhardt试剂、0.5％SDS和20μg/ml变性载体DNA中预杂交1至2小时，3)添加已经标记的杂交探针，4)温育6至24小时，5)将滤膜在68℃于6×SSC,0.1％SDS中洗涤1次30分钟，6)将滤膜在68℃于2×SSC，0.1％SDS中洗涤3次(在30ml中洗涤2次持续30分钟和在500ml中洗涤1次持续10分钟)，并且7)使该滤膜在-70℃暴露于X射线4至48小时。
如本文中所用，“生物样品”是植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品。术语“植物”意在包括处于任何成熟阶段的植物组织以及取自或衍生自任意这种植物的任何细胞、组织或器官，包括而不限于任何种子、叶、茎、花、根、单个细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。如本文中所用，“植物材料”指从植物获得或衍生的材料。包含植物材料的产品涉及使用植物材料产生或可以被植物材料污染的食品、饲料或其他产品。在本发明的上下文中，可以理解对此类生物学样品检测对特定突变ROD1等位基因特异的核酸的存在，所述存在暗示样品中存在核酸。因而本文中提及的用于鉴定生物样品中特定突变ROD1等位基因的方法涉及鉴定生物样品中包含所述特定突变ROD1等位基因的核酸。
另一个实施方案提供包含以下有效相连的元件的嵌合基因：植物可表达的启动子；转录时产生抑制至少一种ROD1基因的RNA分子的DNA区域；和任选地在植物细胞中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化区。
在又一个实施方案中，提供ROD1基因的敲除等位基因，其中敲除的ROD1等位基因是选自以下的天然ROD1基因的突变形式：包含与SEQ IDNo.1、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.10、SEQ ID No.13、SEQ ID No.16、SEQ ID No.19、SEQ ID No.22、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.31、SEQ ID No.34、SEQ ID No.84、SEQ ID No.86、SEQ ID No.88或SEQ ID No.90至少90％序列同一性的核酸分子；或编码下述氨基酸序列的核酸分子，所述氨基酸序列包含与SEQ ID No.3、SEQID No.6、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21、SEQ ID No.24、SEQ ID No.27、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.36、SEQ ID No.85、SEQ ID No.87、SEQ ID No.89或SEQ ID No.91至少90％序列同一性，其中与有功能的ROD1基因中相应的野生型DNA区域相比，所述突变rod1等位基因包含由一个或多个***、缺失或取代的核苷酸组成的突变的DNA区域并且其中所述突变rod1等位基因不编码有功能的ROD1蛋白或编码活性减少的ROD1蛋白。
本发明的嵌合基因可以用来产生种子中C18:1水平升高的植物，如芸苔属植物，或种子中C18:2或SATS水平降低的植物，或用来产生C18:1水平升高或C18:2或SATS水平降低的种子油。
在又一个实施方案中，提供一种用于产生油的方法，所述方法包括从本发明的植物(即，包含敲除的ROD1基因或抑制ROD1基因的RNA的植物)收获种子并从所述种子提取油。在又一个实施方案中，提供一种产生食物或饲料如油、饼粕、籽粒、淀粉、面粉或蛋白质、或工业品如生物燃料、纤维、工业化学品、药物或保健食品的方法，所述方法包括获得本发明的植物或其部分，并且从该植物或其部分制备食物、饲料或工业品。
本发明的植物，如包含至少一种敲除的ROD1基因的植物或包含对至少一种ROD1基因抑制的RNA分子的植物，还可以用来产生种子，如C18:1水平升高的种子或C18:2或SATS水平降低的种子，或用来产生C18:1水平升高或C18:2或SATS水平降低的种子油。
本发明植物可以另外含有赋予除草剂抗性的内源基因或转基因，如赋予草铵膦(glufosinate ammonium)(或)抗性的bar或pat基因[EP 0242236和EP 0242246通过引用的方式并入]；或者任何修饰的EPSPS基因，如来自玉米的2m EPSPS基因[通过引用方式并入的EP 0508909和EP 0507698]，或者赋予草甘膦抗性的草甘膦乙酰转移酶、或草甘膦氧化还原酶，或者赋予溴苯腈抗性的溴苯腈腈水解酶，或赋予针对磺酰脲类、咪唑啉酮类、磺酰氨基羰基***啉酮类、***并嘧啶类或嘧啶基(氧代/硫代)苯甲酸类的抗性的任何修饰的AHAS基因，如目前作为卡诺拉油菜销售的耐受咪唑啉酮的菜籽油菜突变体PM1和PM2。另外，本发明的植物可以另外含有内源基因或转基因，所述内源基因或转基因赋予增加的含油量或改进的油组成，如12:0ACP硫酯酶增加以获得高月桂酸酯，其赋予授粉控制，如在花药特异性启动子控制下的barnase以获得雄性不育，或在花药特异性启动子控制下的barstar以引起恢复的雄性不育，或如Ogura胞质雄性不育和能育性的核恢复子。
本发明的植物和种子可以用化学化合物进一步处理，如选自以下名单的化学化合物：
除草剂：烯草酮(Clethodim)、二氯吡啶酸(Clopyralid)、氯甲草(Diclofop)、胺苯磺隆(Ethametsulfuron)、吡氟禾草灵(Fluazifop)、草铵膦(Glufosinate)、草甘膦、吡草胺(Metazachlor)、喹草酸(Quinmerac)、喹禾灵(Quizalofop)、醌肟草(Tepraloxydim)、氟乐灵(Trifluralin)。
杀真菌剂/PGR：腈嘧菌酯(Azoxystrobin)、N-[9-(二氯亚甲基)-1,2,3,4-四氢-1,4-亚甲基萘-5-基]-3-(二氟甲基)-1-曱基-1H-吡唑-4-甲酰胺(Benzovindiflupyr、Benzodiflupyr)、Bixafen、啶酰菌胺(Boscalid)、多菌灵(Carbendazim)、萎锈灵(Carboxin)、氯化矮壮素(Chlormequat-chloride)、盾壳霉(Coniothryrium minitans)、环丙唑醇(Cyproconazole)、环丙嘧啶(Cyprodinil)、醚唑(Difenoconazole)、烯酰吗啉(Dimethomorph)、醚菌胺(Dimoxystrobin)、氧唑菌(Epoxiconazole)、唑酮菌(Famoxadone)、氟啶胺(Fluazinam)、咯菌腈(Fludioxonil)、氟吡菌胺(Fluopicolide)、氟吡菌酰胺(Fluopyram)、氟嘧菌酯(Fluoxastrobin)、氟喹唑(Fluquinconazole)、氟硅唑(Flusilazole)、Fluthianil、粉唑醇(Flutriafol)、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、异菌脲(Iprodione)、吡唑萘菌胺(Isopyrazam)、精甲霜灵(Mefenoxam)、缩节胺(Mepiquat-chloride)、甲霜灵(Metalaxyl)、叶菌唑(Metconazole)、叉氨苯酰胺(Metominostrobin)、多效唑(Paclobutrazole)、戊苯吡菌胺(Penflufen)、吡噻菌胺(Penthiopyrad)、啶氧菌酯(Picoxystrobin)、丙氯灵(Prochloraz)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、唑菌胺酯(Pyraclostrobin)、氟唑环菌胺(Sedaxane)、戊唑醇(Tebuconazole)、氟醚唑(Tetraconazole)、甲基托布津(Thiophanate-methyl)、塞仑(Thiram)、***醇(Triadimenol)、布洛芬(Trifloxystrobin)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)菌株I-1582、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713、短小芽孢杆菌(Bacillus pumulis)、短小芽孢杆菌菌株GB34。
杀虫剂：啶虫脒(Acetamiprid)、涕灭威(Aldicarb)、印楝素(Azadirachtin)、虫螨威(carbofuran)、氯虫苯甲酰胺(Chlorantraniliprole)(Rynaxypyr)、可尼丁(clothianidin)、氰虫酰胺(Cyantraniliprole)(Cyazypyr)、(β-)氟氯氰菊酯((beta-)Cyfluthrin)、γ-氯氟氰菊酯(γ-Cyhalothrin)、λ-氟氯氰菊酯(λ-Cyhalothrin)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、乐果(Dimethoate)、呋虫胺(Dinetofuran)、乙虫腈(Ethiprole)、氟啶虫酰胺(Flonicamid)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、氟噻虫砜(Fluensulfone)、氟吡菌酰胺(Fluopyram)、Flupyradifurone、氟胺氰菊酯(tau-fluvalinate)、Imicyafos、吡虫啉(imidacloprid)、氰氟虫腙(Metaflumizone)、甲硫威(Methiocarb)、吡蚜酮(Pymetrozine)、吡氟喹腙(Pyrifluquinazon)、乙基多杀菌素(Spinetoram)、艾克敌(Spinosad)、螺虫乙酯(Spirotetramate)、氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor)、噻虫啉(Thiacloprid)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-曱基-6-(甲基氨甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1H-四唑-1-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-{2-氟-4-甲基-5-[(2,2,2-三氟乙基)亚磺酰]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1,2,4-***-5-胺、(1E)-N-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-N'-氰基-N-(2,2-二氟乙基)乙脒、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)F52。
在一些实施方案中，本发明的植物细胞，即包含敲除的rod1基因或对ROD1基因抑制的RNA的植物细胞，以及根据本发明的方法产生的植物细胞可以是非繁殖的细胞。
根据本发明获得的植物可以在常规育种方案中用来产生具有相同特征的更多植物，或用来在相同或相关植物物种的其它品种中或在杂交植物中引入本发明的特征。获得的植物还可以用于产生繁殖材料。本发明的植物还可以用来产生配子、种子(包括碾碎的种子和种籽饼)、种子油、合子或体细胞胚、子代，或用来产生食品或饲料、如油、饼粕、籽粒、淀粉、面粉或蛋白质或工业品，如生物燃料、纤维、工业化学品、药物或保健食品，或用来产生通过本发明方法获得的植物的杂种。
本文中提及或援引的全部专利、专利申请和出版物或公开披露(包括互联网上的出版物)通过引用的方式完整并入。
名为“BCS12-2010-US1_ST25.txt”的文件中所含的序列表在此通过电子提交方式提交并且通过引用的方式并入本文，序列表为216千字节(大小如Microsoft中所测量)，含有91个序列SEQ ID NO:1至SEQID NO:91并且在2012年7月2日创建。
在说明书和实施例中参考以下序列：
序列
SEQ ID No.1：来自欧洲油菜的ROD1-A1的基因组DNA序列。
SEQ ID No.2：来自欧洲油菜的ROD1-A1的cDNA序列。
SEQ ID No.3：来自欧洲油菜的ROD1-A1的蛋白质序列。
SEQ ID No.4：来自欧洲油菜的ROD1-C1的基因组DNA序列。
SEQ ID No.5：来自欧洲油菜的ROD1-C1的cDNA序列。
SEQ ID No.6：来自欧洲油菜的ROD1-C1的蛋白质序列。
SEQ ID No.7：来自欧洲油菜的ROD1-A2的基因组序列。
SEQ ID No.8：来自欧洲油菜的ROD1-A2的cDNA序列。
SEQ ID No.9：来自欧洲油菜的ROD1-A2的蛋白质序列。
SEQ ID No.10：来自欧洲油菜的ROD1-C2的基因组DNA序列。
SEQ ID No.11：来自欧洲油菜的ROD1-C2的cDNA序列。
SEQ ID No.12：来自欧洲油菜的ROD1-C2的蛋白质序列。
SEQ ID No.13：来自芜青的ROD1-1的基因组DNA序列。
SEQ ID No.14：来自芜青的ROD1-1的cDNA序列。
SEQ ID No.15：来自芜青的ROD1-1的蛋白质序列。
SEQ ID No.16：来自芜青的ROD1-2的基因组DNA序列。
SEQ ID No.17：来自芜青的ROD1-2的cDNA序列。
SEQ ID No.18：来自芜青的ROD1-2的蛋白质序列。
SEQ ID No.19：来自芜青的ROD1-3的基因组DNA序列。
SEQ ID No.20：来自芜青的ROD1-3的cDNA序列。
SEQ ID No.21：来自芜青的ROD1-3的蛋白质序列。
SEQ ID No.22：来自芜青的ROD1-4的基因组DNA序列。
SEQ ID No.23：来自芜青的ROD1-4的cDNA序列。
SEQ ID No.24：来自芜青的ROD1-4的蛋白质序列。
SEQ ID No.25：来自甘蓝的ROD1-1的基因组DNA序列。
SEQ ID No.26：来自甘蓝的ROD1-1的cDNA序列。
SEQ ID No.27：来自甘蓝的ROD1-1的蛋白质序列。
SEQ ID No.28：来自甘蓝的ROD1-2的基因组DNA序列。
SEQ ID No.29：来自甘蓝的ROD1-2的cDNA序列。
SEQ ID No.30：来自甘蓝的ROD1-2的蛋白质序列。
SEQ ID No.31：来自甘蓝的ROD1-3的基因组DNA序列。
SEQ ID No.32：来自甘蓝的ROD1-3的cDNA序列。
SEQ ID No.33：来自甘蓝的ROD1-3的蛋白质序列。
SEQ ID No.34：来自甘蓝的ROD1-4的基因组DNA序列。
SEQ ID No.35：来自甘蓝的ROD1-4的cDNA序列。
SEQ ID No.36：来自甘蓝的ROD1-4的蛋白质序列。
SEQ ID No.37:引物BnROD1_A1/C1Forward。
SEQ ID No.38:引物BnROD1_A1/C1Reverse。
SEQ ID No.39:引物BnROD1_A2Forward。
SEQ ID No.40:引物BnROD1_A2Reverse。
SEQ ID No.41:引物BnROD1_C2Forward。
SEQ ID No.42:引物BnROD1_C2Reverse。
SEQ ID No.43:引物BnROD1F1。
SEQ ID No.44:引物BnROD1R1。
SEQ ID No.45:引物BnROD1F2。
SEQ ID No.46:引物BnROD1R2。
SEQ ID No.47：pTCO363的ROD1-Bn1发夹的表达盒。
SEQ ID No.48：pTCO364的ROD1-Bn2发夹的表达盒。
SEQ ID No.49:FAM引物HIOL302。
SEQ ID No.50:VIC引物HIOL302。
SEQ ID No.51:反向引物HIOL302。
SEQ ID No.52:FAM引物HIOL303。
SEQ ID No.53:VIC引物HIOL303。
SEQ ID No.54:反向引物HIOL303。
SEQ ID No.55:FAM引物HIOL304。
SEQ ID No.56:VIC引物HIOL304。
SEQ ID No.57:反向引物HIOL304。
SEQ ID No.58:FAM引物HIOL306。
SEQ ID No.59:VIC引物HIOL306。
SEQ ID No.60:反向引物HIOL306。
SEQ ID No.61:FAM引物HIOL307。
SEQ ID No.62:VIC引物HIOL307。
SEQ ID No.63:反向引物HIOL307。
SEQ ID No.64:FAM引物HIOL308。
SEQ ID No.65:VIC引物HIOL308。
SEQ ID No.66:反向引物HIOL308。
SEQ ID No.67:FAM引物HIOL309。
SEQ ID No.68:VIC引物HIOL309。
SEQ ID No.69:反向引物HIOL309。
SEQ ID No.70:FAM引物HIOL310。
SEQ ID No.71:VIC引物HIOL310。
SEQ ID No.72:反向引物HIOL310。
SEQ ID No.73:FAM引物HIOL311。
SEQ ID No.74:VIC引物HIOL311。
SEQ ID No.75:FAM引物HIOL313。
SEQ ID No.76:VIC引物HIOL313。
SEQ ID No.77:FAM引物HIOL315。
SEQ ID No.78:VIC引物HIOL315。
SEQ ID No.79:反向引物HIOL315。
SEQ ID No.80:FAM引物HIOL316。
SEQ ID No.81:VIC引物HIOL316。
SEQ ID No.82:FAM引物HIOL318-319。
SEQ ID No.83:VIC引物HIOL318-319。
SEQ ID No.84：来自欧洲油菜的ROD1-A3的cDNA序列。
SEQ ID No.85：来自欧洲油菜的ROD1-A3的蛋白质序列。
SEQ ID No.86：来自欧洲油菜的ROD1-C3的cDNA序列。
SEQ ID No.87：来自欧洲油菜的ROD1-C3的蛋白质序列。
SEQ ID No.88：来自欧洲油菜的ROD1-A4的cDNA序列。
SEQ ID No.89：来自欧洲油菜的ROD1-A4的蛋白质序列。
SEQ ID No.90：来自欧洲油菜的ROD1-C4的cDNA序列。
SEQ ID No.91：来自欧洲油菜的ROD1-C4的蛋白质序列。
实施例
除非在实施例中另外指出，否则全部重组DNA技术按照Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,NY中、Ausubel等人(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology,Current Protocols,USA第1和第2卷中和Volumes I and II of Brown(1998)Molecular Biology LabFax,第2版,Academic Press(UK)的第1和第2卷中所述的标准方案实施。在BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications,UK联合出版的Plant Molecular Biology Labfax(1993)(R.D.D.Croy)中描述了用于植物分子操作的标准材料和方法。用于聚合酶链反应的标准材料和方法可以在Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press中并在McPherson等人(2000)PCR-Basics:From Background to Bench,第1版,德国SpringerVerlag中找到。在Vos等人(1995,NAR 23:4407-4414)和在公开的EP专利申请EP 534858中描述了AFLP分析的标准流程。
实施例1–分离芸苔属植物ROD1基因的DNA序列
使用拟南芥(A.thaliana)ROD1基因序列(At3g15280)作为查询对象的TBLASTN同源性检索导致从欧洲油菜EST数据库鉴定到作为拟南芥ROD1同源物的单一基因序列Bna.6194。随后，将Bna.6194作为查询对象用于BLAST同源性检索芜青编码序列和甘蓝编码序列的自有数据库中。通过利用软件包SOAPdenovo装配短序列读出结果，获得这些数据库中的重叠群。BLAST分析导致分别鉴定芜青的4个ROD1基因同源物(BrROD1-1(SEQ ID No.13)、BrROD1-2(SEQ ID No.16)、BrROD1-3(SEQID No.19)和BrROD1-4(SEQ ID No.22))以及甘蓝的4个ROD1基因同源物(BoROD1-1(SEQ ID No.25)、BoROD1-2(SEQ ID No.28)、BoROD1-3(SEQ ID No.31)以及BoROD1-4(SEQ ID No.34))。使用FgeneSH软件预测与这些序列相对应的cDNA，并且所述cDNA分别在SEQ ID No.14、SEQ ID No.17、SEQ ID No.20、SEQ ID No.23、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.29、SEQ ID No.32和SEQ ID No.35中描述。使用芜青BrROD1基因序列对含有欧洲油菜mRNA序列的自有数据库的BLAST同源性检索导致鉴定欧洲油菜cDNA序列BnROD1-A1(SEQ ID No.2)、BnROD1-A2(SEQID No.8)、BnROD1-A3(SEQ ID No.84)和BnROD1-A4(SEQ ID No.88)。基于基因结构预测，使用Fgenesh软件或mRNA衍生的测序读出丰度，鉴定相应的编码序列。类似地，使用甘蓝BoROD1基因序列作为查询对象对含有欧洲油菜mRNA序列的自有数据库的BLAST同源性检索导致鉴定以下cDNA序列：BnROD1-C1(SEQ ID No.5)、BnROD1-C2(SEQ ID No.11)、BnROD1-C3(SEQ ID No.86)和BnROD1-C4(SEQ ID No.90)。遵循上文提到的基因结构预测方法，获得相应的编码序列。
为了获取欧洲油菜ROD1基因序列，筛选BAC文库。对阳性文库克隆进行标准GS-FLX测序并使用454装配软件Newbler进行从头重叠群装配后，鉴定了BnROD1-A1(SEQ ID No.1)、BnROD1-A2(SEQ ID No.7)、BnROD1-C1(SEQ ID No.4)和BnROD1-C2(SEQ ID No.10)的基因序列。
实施例2–欧洲油菜ROD1基因的表达分析
通过分析对多种组织和发育阶段获得的Illuminam RNAseq衍生的转录组数据库，测定芸苔属物种ROD1基因的相对基因表达水平。考虑每个数据库的用于测序深度(数据库中靶读数/百万读数)和用于靶基因长度(数据库中每千碱基读数/百万读数[RPKM；Mortazavi A,Williams BA,McCue K,Schaeffer L,Wold B:Mapping and quantifying mammaliantranscriptomes by RNA-Seq.Nature Methods(2008),5(7):621-628]的归一化步骤，计算基因表达水平。
图1中显示表达分析的结果。从这张图中可以见到BnROD1-A1和BnROD1-C1具有最高表达水平，并且表达在花芽中最高。另外，从受精后第21-25日直至受精后约第42日种子中存在BnROD1-A1和BnROD1-C1的某种表达。
实施例3–欧洲油菜突变rod1等位基因的产生和分离
产生实施例1中鉴定的来自欧洲油菜的ROD1基因中的突变并且如下鉴定：
-将来自优良春油菜繁育系的30,000粒种子(M0种子)在湿滤纸上去离子水或蒸馏水中预吸胀2小时。使一半种子暴露于0.8％EMS并且使另一半种子暴露于1％EMS(Sigma：M0880)并温育4小时。
-将诱变的种子(M1种子)淋洗3次并且在通风柜中干燥过夜。将30,000个M1植株在土壤中种植并自交以产生M2种子。对每个M1独立植株，收获M2种子。
-两次种植从不同M1植株衍生的4800个M2植株并且根据CTAB方法从每个独立M2植株的叶样品制备DNA样品(Doyle和Doyle，11987,Phytochemistry Bulletin 19:11-15)。
-通过采用标准测序技术直接测序并且使用NovoSNP软件分析序列中点突变的存在，对DNA样品筛选ROD1基因中点突变的存在，其中所述点突变造成在ROD1基因的蛋白质编码区中引入终止密码子、氨基酸取代或破坏ROD1mRNA中的剪接位点。
从而鉴定以下突变rod1等位基因：
表2a：BnROD1-A1中的突变
表2b：BnROD1-C1中的突变
脚注*：包含了含有纯合态HIOL306突变或纯合态HIOL307突变的突变BnROD1-A1等位基因的种子已经在2012年6月28日分别按检索号NCIMB 41995和NCIMB 42000保藏于NCIMB(NCIMB Ltd，FergusonBuilding，(NCIMB Ltd,Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB219YA,Scotland,UK)。包含了含有纯合态HIOL310突变、纯合态HIOL313突变、纯合态HIOL316突变、纯合态HIOL318突变或纯合态HIOL319突变的突变BnROD1-C1等位基因的种子已经在2012年6月28日分别按检索号NCIMB 41996、NCIMB 42001、NCIMB 41997、NCIMB 41998和NCIMB 41999保藏于NCIMB(NCIMB Ltd,FergusonBuilding,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB219YA,Scotland,UK)。
实施例4–BnROD1等位基因在酵母中的活性
在酵母中检验欧洲油菜ROD1-A1、ROD1-A2、ROD1-C1和ROD1-C2等位基因的活性以及BnROD1-A1和BnROD1-C1的突变等位基因的活性。
在酵母表达载体中克隆ROD1等位基因
使用产生5’BamHI和3’EcoRI限制性位点的引物，通过KOD DNA聚合酶(Toyobo Life Science Department,http://www.toyobo-global.com)扩增BnROD1-A1、BnROD1-C1、BnROD1-A2和BnROD1-C2和它们的突变等位基因。
BnROD1-A1和BnROD1-C1和它们的突变等位基因用引物BnROD1_A1/C1Forward(SEQ ID No.37)和BnROD1_A1/C1Reverse(SEQ ID No.38)扩增。BnROD1-A2(具有针对酵母优化的密码子选择)用引物BnROD1_A2Forward(SEQ ID No.39)和BnROD1_A2Reverse(SEQID No.40)扩增，并且BnROD1-A2(具有针对酵母优化的密码子选择)用引物BnROD1_C2Forward(SEQ ID No.41)和BnROD1_C2Reverse(SEQID No.42)扩增。在BamHI和EcoRI双重消化后，将每种产物连接入p424GPD载体(ATCC，http://www.atcc.org/)，该载体中cDNA在组成型甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子控制下表达，并且随后转化入大肠杆菌感受态细胞(TOP，Invitrogen)。将通过测序证实具有正确***片段的质粒转化入酵母HJ091细胞(cpt1::LEU2ept1-)，并且通过遗失亮氨酸和色氨酸的合成的基本培养基(SD基)(DO-Leu/-Trp)(Clontech，http://www.clontech.com)选择转化体。
酵母中ROD1等位基因的活性检验
ROD1活性测定法基于Lu等人2009(PNAS,2009,106(44):18837-18842.,S1材料和方法)中的补充信息修改。接种来自过夜培养物的酵母细胞并将它们在30℃在液体培养基SD/-Leu/-Trp中培育至对数中期(OD600＝0.5–1.5)。为了制备总膜级分，通过在1500g离心5分钟收获100ml酵母细胞。将每份细胞沉淀物用无菌水洗涤1次并且随后重悬于冰冷的葡萄糖-Tris-EDTA(GTE)缓冲液[20％甘油，50mM葡萄糖，25mMTris-HC1，pH 7.4，10mM EDTA]中。随后将细胞涡旋混合30秒x8次，冰上间隔30秒。将所得到的匀浆在4℃以2,500g离心10分钟以沉淀细胞残片。将上清液在4℃以100,000g离心1小时并且将膜沉淀物重悬于200μL GTE缓冲液中。通过Bradford分析法测定蛋白质浓度。
将使用p424GPD(对照)或p424BnROD1和突变等位基因转化的HJ091细胞的膜制备物中的PDCT活性测定为从1,2-二油酰-消旋-甘油[14C(U)]([14C-甘油]二油精)产生的[14C]二油酰-PC的量。将底物1.8nmol(200,000cpm)[14C-甘油]二油精(American Radiolabeled Chemicals,Inc.(http://www.arcinc.com)和0.1μmol二油酰-PC在氮气下干燥并通过在槽式超声破碎器中超声处理2分钟重悬于50μL 4x反应缓冲液[终浓度：50mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)/NaOH(pH 7.5)，20mM MgCl2，0.45％Triton X-100]中。通过添加悬浮于GTE缓冲液中的50ng微粒体蛋白，启动反应(200μL)。将分析物在15℃温育15分钟并通过添加3mL氯仿/乙醇(2:1，vol./vol.)随后添加1.5mL 0.9％KCl来终止。通过涡旋混合混合各管，并且通过在2,000g离心2分钟促进相分离。吸出水相，并将有机相用1.5mL 40％(vol./vol.)乙醇洗涤两次。在WhatmanK6硅凝胶20x 20cm玻璃板(Whatman,http://www.whatman.com)上在溶剂体系氯仿/甲醇/水(65:25:4，以体积计)中通过TLC分析样品，随后进行感光成像分析(磷光成像仪445SI，Lab Extreme,Inc,http://www.labextreme.com)。刮下相应的条带，并且在液体闪烁计数分析仪(PackardInstrument Company)上通过闪烁计数测定放射性。
图2a、b和c和表3中显示ROD1等位基因的活性分析结果。从实验I的图2a和表3可以看出BnROD1-A1和BnROD1-C1具有活性，而不能检测到BnROD1-A2和BnROD1-C2的活性。这些结果表明BnROD1-A1和BnROD1-C1是欧洲油菜中拟南芥ROD1的唯一有功能同源物。由于BnROD1-A3、BnROD1-C3、BnROD1-A4和BnROD1-C4与BnROD1-A1和BnROD1-C1具有甚至更低的序列同一性，因此这些副本还可能代表ROD1的无功能同源物。因此，可设想的是，BrROD1-1(其为BnROD1-A1的芜青直向同源物)和BoROD1-1(其为BnROD1-C1的甘蓝直向同源物)分别是芜青和甘蓝中拟南芥ROD1的有功能同源物。
从实验II的图2b和表3可以看出，BnROD1-A1HIOL306、HOIL307和HIOL302的突变体没有可检测的活性，而与BnROD1-A1相比，BnROD1-A1突变体HIOL305具有减少的活性。实验III的图2c和表3显示，BnROD1-C1HIOL311和HIOL309的突变体具有与野生型BnROD1-C1可比较的活性，HIOL315具有减少的活性，并且HIOL310、HIOL314和HIOL313没有可检测的活性。
表3：芸苔属植物ROD1野生型和突变等位基因的相对活性。值代表PC中每分钟的计数(cpm)。AtROD1＝来自拟南芥的ROD1。BnROD1＝来自欧洲油菜的ROD1。DAG＝二酰甘油；PC＝磷脂酰胆碱
实施例5–欧洲油菜中下调BnROD1
使用ROD1的发夹构建体，在欧洲油菜中下调芸苔属植物ROD1基因。
ROD1发夹构建体的构建
宿主大肠杆菌菌株是TOP(具有Gateway进入克隆和表达克隆)或DB3.1(具有pHELLSGATE12目的载体；Invitrogen)。将细菌培养物在37℃于具有适宜抗生素的Luria培养基中培育。
BnROD1hpRNA抑制构建体的产生：
为了特异性敲减BnROD1-A1和BnROD1-C1的表达，产生了含有在BnROD1-A1或C1和其他BnROD1同源物之间不超过20bp相同的发夹构建体(ROD1-Bn1)。因此，使用引物caccGTCGCAGATCTAACGGATATCACAC(正向)(SEQ ID No.43)和BnROD1R1(276-300):AATATCGAACGGCTCAGACTTCGCC(反向)(SEQ ID No.44)，通过PCR扩增从BnROD1第29至第300位的278bp片段。为了敲减全部BnROD1成员，产生发夹构建体ROD1-Bn2。因此，使用引物：BnROD1F2(289-311)：caccCCGTTCGATATTGGGTTTGTG(SEQ ID No.45)和BnROD1R2(827-849)：TTAATTGACTAGCGAGTCTTTAG(SEQ ID No.46)，通过PCR扩增BnROD1从第289至第849位的561bp片段。
在作为模板的BnROD1-A1DNA上通过PCR扩增每个DNA片段：PCR反应(50μl)含有0.3μM每种引物、2ng/μL模板DNA、0.2mM dNTP混合物、0.02单位/μL KOD DNA聚合酶(Toyobo)、5μl 10X PCR缓冲液和1.5mM MgSO4。编程的循环如下：在95℃2分钟初始变性步骤；40次循环：在95℃20秒变性，在55℃15秒复性，在70℃20秒延伸。将PCR产物用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化和连接入pENTRTM/D-TOPO克隆载体(Invitrogen)以根据手册说明产生进入克隆。为了产生发夹构建体，将100ng BnROD1进入克隆和150ngpHELLSGATE12目的载体混合，并且遵循手册说明(Invitrogen)，使用LR ClonaseTM酶，实施LR重组反应。在转化入TOP感受态细胞后中，通过限制性分析筛选克隆以鉴定具有正确方向的预期***片段的质粒，并且随后通过测序验证。
通过从以上发夹构建体提取发夹区域并且将该盒置入含有在花椰菜花叶病毒35S启动子控制下的bar作为选择标记的转化载体中，获得转化载体。所产生的载体pTCO363含有ROD1-Bn1发夹构建体(以特异性敲减BnROD1-A1和BnROD1-C1的表达)，并且所产生的载体pTCO364含有ROD1-Bn2发夹构建体(以敲减全部欧洲油菜ROD1成员)。
在SEQ ID No.47中给出pTCO363的ROD1-Bn1发夹的表达盒的序列，并且在SEQ ID No.48中给出pTCO364的ROD1-Bn2发夹的表达盒的序列。
通过从以上发夹构建体提取发夹区域并且将该盒置入在种子特异性油质蛋白启动子控制下的含有bar作为选择标记的转化载体中，获得额外的转化载体。
用ROD1发夹构建体转化欧洲油菜
使用基本上如De Block等人,(1989),Plant Physiol.91:694)所描述下胚轴转化方案，将上文提到的载体pTCO363和pTCO364用于转化欧洲油菜。
将再生的单拷贝欧洲油菜转化事件与欧洲油菜(优良)品系回交。在2轮自交后，收获来自纯合转化事件和野生型分离子的种子用于后续种子油分析。
在来自用ROD1发夹构建体转化的欧洲油菜的种子中的油组成
如WO 09/007091中所述，通过从种子提取脂酰化物并借助毛细管气相-液相色谱分析它们在种子油中的相对水平，确定纯合转化事件和相应野生型分离子的独立子代芸苔属植物的种子油以及温室中培育的非转化参比株系的种子油的脂肪酸组成。
图3a显示在含有纯合、半合子种子和野生型分离子(二者均相对ROD1-Bn1(专用)和ROD1-Bn2(通用)发夹构建体而言)的混合物的T1S1代种子中，大部分植株在它们的种子中具有显著增加的C18:1水平。在含有ROD1-Bn1(专用)和ROD1-Bn2(通用)发夹构建体的大部分植物的种子中，饱和脂肪酸水平(SATS；C16:0、C18:0、C20:0、C22:0、C24:0)降低(图3b)。当C18:2水平对不同植株的C18:1水平作图时，显而易见在C18:1水平和C18:2水平之间存在负相关：C18:1水平越高，C18:2水平越低(图3c)。
在T1S2代种子中，其中全部种子均对发夹构建体纯合，两种发夹构建体的使用产生了与野生型分离子或参比株系相比种子脂质中C18:1水平升高的转化事件。然而，令人惊讶地，用ROD1-Bn1(专用)发夹构建体转化产生了种子C18:1水平超过用ROD1-Bn1(通用)获得的任何事件中的那些C18:1水平的事件(图4a和表4)。
进一步，在T1S2代种子中，一些含有ROD1-Bn1(专用)的植株的种子中和一些含有ROD1-Bn2(通用)发夹构建体的植株中的SATS水平降低(图4b和表4)。
这些结果显示BnROD1-A1和/或BnROD1-C1等位基因的下调显著有助于种子脂质级分中C18:1水平的增加，而下调欧洲油菜的其他ROD1等位基因不导致C18:1水平进一步增加。支持这一点的是，与其中仅ROD1-A1和ROD1-C1等位基因下调的纯合种子相比，在其中全部欧洲油菜ROD1等位基因均下调的纯合种子中观察到C18:1水平不增加。
表4a：在用ROD1发夹构建体转化的温室纯合植物(HH)和野生型分离子(WTS)中按种子脂肪酸总重量的重量百分比(Wt％)计的C18:1、C18:2和SATS水平
表4b：相对于野生型分离子(％对野生型分离子水平)，用ROD1发夹构建体转化的纯合植物中C18:1，C18:2和SATS水平的变化
实施例6–来自温室培育的包含BnROD1-A1和BnROD1-C1敲除等位
基因的欧洲油菜的种子中的油组成
将包含突变ROD1-A1和ROD1-C1等位基因的芸苔属植物杂交。在2轮自交后，基于分子标记物的植物选择，从ROD1-A1和ROD1-C1突变纯合、ROD1-A1突变纯合、ROD1-C1突变或野生型分离子(即不包含将影响ROD1蛋白正常功能的任何突变ROD1等位基因)纯合的植株获得种子(见下文)。
确定具有突变BnROD1-A1、BnROD1-C1及其组合的芸苔属植物系的F1S2种子中的脂肪酸组成，所述F1S2种子来自如上文所述在温室中培育的植物。对于每种突变体组合，在BnROD1-A1和BnROD1-C1中不包含相应突变的野生型分离子中、在对突变BnROD1-A1纯合或对突变BnROD1-C1等位基因纯合的株系中和在对突变BnROD1-A1和突变BnROD1-C1同时纯合的株系中确定油组成。
图5a显示突变株系和野生型株系中的C18:1水平(还参见表5a和表4b)。可以看出在具有纯合单突变体的几个株系中，与野生型分离子相比，在BnROD1-A1中和在BnROD1-C1中，C18:1水平均显著增加。另外，该图显示在全部双突变株系中，除一个之外(HIOL306/HIOL318)，C18:1水平与野生型相比显著增加。在包含HIOL307/HIOL313突变体的株系中观察到最高C18:1水平：71.6％。
图5b显示不同突变株系和野生型株系中的C18:1水平(还参见表5a和表5b)。在一些突变体株系中，与野生型相比观察到SATS显著减少。
表5a：温室中培育的具有BnROD1-A1和BnROD1-C1及其组合的EMS突变体的F1S2种子中C18:1、C18:2和SATS的水平。全部水平均按重量百分比计。(--/--)指野生型分离子；(--/C1C1)指纯合单突变体，仅C1；(A1A1/--)指纯合单突变体，仅A1；(A1A1/C1C1)指双纯合突变体A1和C1。
表5b：温室中培育的具有BnROD1-A1和BnROD1-C1及其组合的EMS突变体的F1S2种子中，相对于野生型分离子，ROD1突变体中C18:1、C18:2和SATS的水平的改变。(--/C1C1)指纯合单突变体，仅C1；(A1A1/--)指纯合单突变体，仅A1；(A1A1/C1C1)指双纯合突变体A1和C1。变化表述为相对于野生型分离子的％。
总之，数据显示通过下调欧洲油菜ROD1-A1和ROD1-C1基因的表达，或通过敲除欧洲油菜ROD1-A1基因、欧洲油菜ROD1-C1基因或这两者，可以在芸苔属植物种子中增加C18:1水平，并且可以降低SATS水平。
实施例7–来自田间培育的包含BnROD1-A1和BnROD1-C1敲除等位
基因的欧洲油菜的种子中的油组成
确定具有突变BnROD1-A1、BnROD1-C1及其组合的芸苔属植物系的种子中的脂肪酸组成，所述种子来自如上文所述在田间培育的植物。对于每种突变体组合，在BnROD1-A1和BnROD1-C1中不包含相应突变的野生型分离子中、在对突变BnROD1-A1纯合或对突变BnROD1-C1等位基因纯合的株系中和在对突变BnROD1-A1和突变BnROD1-C1都纯合的株系中确定油组成。在3个不同地理位置检验突变基因型。每个位置产生三个重复。通过GC分析获得种子品质参数。为统计分析，进行ANOVA检验。突变株系之间相对于相应无效分离子的差异接受显著性检验。为了统计分析关键参数油酸(C18:1)，采用位置之间具有异质性方差的混合模型。对照指不接受EMS处理的参比欧洲油菜基因型。
表6a显示突变株系和野生型株系中的C18:1水平。表6b显示相对于相应的野生型分离子，欧洲油菜突变株系中C18:1含量的差异(全部位置和地块的平均数)。
表6a：来自田间培育的植物的基因型效应的C18:1水平(全部位置和地块的平均数)。(--/--)指野生型分离子；(--/C1C1)指纯合单突变体，仅C1；(A1A1/--)指纯合单突变体，仅A1；(A1A1/C1C1)指双纯合突变体A1和C1。
表6b：相对于相应的野生型分离子，来自田间培育的欧洲油菜突变株系中C18:1含量的差异(全部位置和地块的平均数)。
田间获得的数据证实了温室中获得的数据：突变等位基因BnROD1-A1和BnROD1-C1的存在可以增加C18:1水平。BnROD1-A1等位基因HIOL307与BnROD1-C1突变等位基因的组合甚至对种子油中的C18:1水平具有协同效应。在具有HIOL307突变和HIOL316突变组合的株系中观察到C18:1水平最高的增加(增加5.90％)，并且在具有HIOL307突变和HIOL318突变组合的株系中观察到C18:1水平最高的增加(增加5.74％)。
实施例8–突变ROD1等位基因的检测和/或转移至(优良)芸苔属植物品
系中
通过以下方法将突变ROD1基因转移至(优良)芸苔属植物繁育系中：含有突变ROD1基因(供体植物)的植物与(优良)芸苔属植物品系(优良亲本/回归亲本)或缺少突变ROD1基因的品种杂交。使用以下种质渗入方案(突变ROD1等位基因缩写成rod1，而野生型称作ROD1)：
BC1杂交：rod1/rod1(供体植物)X ROD1/ROD1(优良亲本)
F1植物：ROD1/rod1
BC2杂交：ROD1/rod1 X ROD1/ROD1(回归亲本)
BC2植物：50％ROD1/rod1和50％ROD1/ROD1
使用针对突变ROD1等位基因(rod1)的分子标记物(例如AFLP、PCR、InvaderTM、KASP测定法等；还参见下文)，选择50％ROD1/rod1。
BC3杂交：ROD1/rod1(BC1植物)X ROD1/ROD1(回归亲本)
BC3植物：50％ROD1/rod1和50％ROD1/ROD1
使用针对突变ROD1等位基因(rod1)的分子标记物选择50％ROD1/rod1。
重复回交直至BC4至BC7。
BC4-7植物：50％ROD1/rod1和50％ROD1/ROD1
使用针对突变ROD1等位基因(rod1)的分子标记物选择50％ROD1/rod1。为减少回交次数(例如直至BC4而非BC7)，可以使用对优良亲本的遗传背景特异的分子标记物。
BC4-7S1杂交：ROD1/rod1 X ROD1/rod1
BC4-7S1植物：25％ROD1/ROD1和50％ROD1/rod1和25％rod1/rod1
使用针对突变ROD1等位基因(rod1)的分子标记物选择含有rod1的植物。使用针对突变体和野生型ROD1等位基因的分子标记物，选择对突变ROD1等位基因纯合(rod1/rod1)的个体BC4-7S1或BC4-7S2植物。这些植物随后用于产生种子。
为了选择在ROD1等位基因中包含点突变的植物，可以使用借助本领域已知标准测序技术的直接测序。
备选地，InvaderTM技术(Third Wave Agbio)可以用来区分在ROD1等位基因中包含特异性点突变的植物与不包含该特异性点突变的植物。因此开发区分性InvaderTM探针以基于突变等位基因和野生型等位基因之间的单核苷酸差异，检测实施例3中所鉴定的突变等位基因的存在或不存在及其接合性状态。简而言之，开发了对突变靶ROD1基或相应野生型靶ROD1基因特异的探针和可以与它们组合使用的“侵入”探针。通常，每个探针组由一个对突变靶基因或野生型靶基因特异的探针(所谓“初始探针”)(其“5’副翼”序列后首个核苷酸与核苷酸差异匹配)和一个对该核苷酸差异上游的核苷酸特异的探针(所谓“oligo”)组成。后一种引物的最末核苷酸可以与突变体中的核苷酸差异匹配，但是也可以使用其他核苷酸作为这个最末核苷酸，只要与靶DNA杂交时，初始探针和oligo仍然能够形成单碱基重叠以产生酶(Third Wave Agbio)识别的特定侵入结构。如制造商(Third Wave Agbio)所述那样进行InvaderTM分析流程和解读。简而言之，5'“副翼”核苷酸序列(flap1用于突变等位基因并且flap2用于野生型等位基因)在InvaderTM测定法的初始期从初始探针切下并且分别与FRETTM盒1和盒2中的序列互补，并且不与靶突变序列或野生型序列互补。如果初始探针在初始期中被切割并且flap1-探针和/或flap2-探针在二次期分别与FRETTM盒1和盒2杂交，则生成分别表示样品存在突变靶ROD1基因或相应野生型靶ROD1基因的信号。
备选地，KASP测定法(KBioscience)可以用来区分在ROD1等位基因中包含特异性点突变的植物与不包含该特异性点突变的植物。开发区分性引物以检测实施例3鉴定的突变等位基因、尤其HIOL302、HIOL303、HIOL304、HIOL306、HIOL307、HIOL308、HIOL309、HIOL310、HIOL311、HIOL313、HIOL315与HIOL316、HIOL318和HIOL319的存在或不存在及其接合性状态。简而言之，开发了对突变靶ROD1基因或相应野生型靶ROD1基因特异的正向引物和可以与它们组合使用的反向引物。在正向引物3'末端的核苷酸对应于在突变等位基因和相应野生型等位基因之间不同的核苷酸。引物可以根据如制造商(KBioscience)所描述的方案，与荧光染料如FAM和VIC组合使用。
表7中显示检测突变ROD1等位基因的存在或不存在及其接合性状态的引物。
表7：检测突变ROD1等位基因和相应野生型等位基因的正向引物(Fw)和反向引物(Rv)。FAM探针：野生型等位基因，VIC探针：突变等位基因
实施例9–芜青突变ROD1等位基因的产生和分离
如上文对欧洲油菜描述那样产生并且鉴定在实施例1中鉴定的来自芜青的ROD1基因中的突变。
通过采用标准测序技术直接测序并且使用NovoSNP软件分析序列中点突变的存在，对DNA样品筛查ROD1基因中点突变的存在，其中所述点突变造成在BrROD1-1基因的蛋白质编码区中引入终止密码子、氨基酸取代或破坏BrROD1-1mRNA中的剪接位点。
鉴定BrROD1-1的突变等位基因。
确定具有突变BrROD1-1的芜青品系的种子中的油组成。与野生型的那些C18:1水平相比，突变芜青品系的种子中的C18:1水平升高，而C18:2和SATS的水平降低。
实施例10–甘蓝突变ROD1等位基因的产生和分离
如上文对欧洲油菜描述那样产生并且鉴定在实施例1中鉴定的来自甘蓝的ROD1基因中的突变。
通过采用标准测序技术直接测序并且使用NovoSNP软件分析序列中点突变的存在，对DNA样品筛查ROD1基因中点突变的存在，其中所述点突变造成在BoROD1-1基因的蛋白质编码区中引入终止密码子、氨基酸取代或破坏BoROD1-1mRNA中的剪接位点。
鉴定BoROD1-1的突变等位基因。
确定具有突变BoROD1-1的甘蓝品系的种子中的油组成。与野生型的那些C18:1水平相比，突变甘蓝品系的种子中的C18:1水平升高，而C18:2和SATS的水平降低。
PCT/RO/134表
Claims (24)
1.包含至少一种ROD1基因的芸苔属植物或其细胞、部分、种子或子代，其特征在于所述至少一种ROD1基因是敲除的rod1基因。
2.根据权利要求1所述的芸苔属植物或其细胞、部分、种子或子代，所述芸苔属植物是芜青(Brassica rapa)，并且其中所述敲除的rod1基因是编码与SEQ ID No.15、与SEQ ID No.18、与SEQ ID No.21或与SEQ IDNo.24具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因的敲除等位基因。
3.根据权利要求1所述的芸苔属植物或其细胞、部分、种子或子代，所述芸苔属植物是甘蓝，并且其中所述敲除的rod1基因是编码与SEQ IDNo.27、与SEQ ID No.30、与SEQ ID No.33或与SEQ ID No.36具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因的敲除等位基因。
4.根据权利要求1所述的芸苔属植物或其细胞、部分、种子或子代，所述芸苔属植物是欧洲油菜(Brassica napus)，并且其中所述敲除的rod1基因是编码与SEQ ID No.3或SEQ ID No.6具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因的敲除等位基因。
5.根据权利要求4所述的芸苔属植物或其细胞、部分、种子或子代，其中至少两种ROD1基因是敲除的rod1基因，其中敲除的rod1基因之一是编码与SEQ ID No.3具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因的敲除等位基因并且其中敲除的rod1基因之一是编码与SEQ ID No.6具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因的敲除等位基因。
6.根据权利要求4或5所述的欧洲油菜植物或其细胞、部分、种子或子代，其可从选自以下a)-g)组成的组的种子获得：
a)已经按检索号NCIMB 41995保藏在NCIMB的包含HIOL306的种子，
b)已经按检索号NCIMB 42000保藏在NCIMB的包含HIOL307的种子，
c)已经按检索号NCIMB 41996保藏在NCIMB的包含HIOL310的种子，
d)已经按检索号NCIMB 42001保藏在NCIMB的包含HIOL313的种子，
e)已经按检索号NCIMB 41997保藏在NCIMB的包含HIOL316的种子，
f)已经按检索号NCIMB 41998保藏在NCIMB的包含HIOL318的种子，和
g)已经按检索号NCIMB 41999保藏在NCIMB的包含HIOL319的种子。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的植物，其对敲除ROD1基因是纯合的。
8.转基因芸苔属植物或其细胞、部分、种子或子代，其包含嵌合基因，所述嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段：
a)植物可表达的启动子；
b)DNA区域，其在转录时产生抑制至少一种ROD1基因的RNA分子；和任选地
c)在植物细胞中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化区。
9.根据权利要求8所述的转基因芸苔属植物或其细胞、部分、种子或子代，所述转基因芸苔属植物是欧洲油菜并且其中所述RNA分子抑制编码与SEQ ID No.3具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因并抑制编码与SEQ ID No.6具有至少90％序列同一性的蛋白质的ROD1基因。
10.种子，来自根据权利要求1-9中任一项所述的植物。
11.油，来自根据权利要求10所述的种子。
12.一种用于提高种子油中C18:1水平和/或降低种子油中饱和脂肪酸水平的方法，其包括调节ROD1基因的表达。
13.根据权利要求12所述的方法，其包括步骤：
a)将嵌合基因引入或提供给芸苔属植物细胞，以产生转基因细胞，所述嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段：
■植物可表达的启动子，
■DNA区域，其在转录时产生抑制至少一种ROD1基因的RNA分子；和任选地
■在植物细胞中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化区；和
b)从所述转基因细胞再生转基因植物。
14.根据权利要求12所述的方法，包括步骤：
a)用诱变性化学物质或用电离辐射处理种子或植物材料；
b)鉴定具有突变的ROD1基因的植物，其中ROD1基因，在经突变之前，编码与SEQ ID No.3、与SEQ ID No.6、与SEQ ID No.15或与SEQID No.27具有至少90％序列同一性的多肽；和
c)选择与其中ROD1基因未被突变的植物相比，种子中C18:1水平升高的植物。
15.一种用于获得种子中具有升高的C18:1水平和/或降低的饱和脂肪酸水平的芸苔属植物的方法，包括步骤：在所述芸苔属植物中引入ROD1基因的敲除等位基因，并且通过分析来自所述植物的基因组DNA中至少一种分子标记物的存在，选择种子中具有升高的C18:1水平的所述芸苔属植物中ROD1基因的所述敲除等位基因的存在，其中所述至少一种分子标记物与所述ROD1基因的敲除等位基因连锁。
16.一种确定ROD1基因的敲除等位基因在生物样品中存在或不存在的方法，包括提供来自所述生物样品的基因组DNA，并且对所述DNA分析至少一种分子标记物的存在，其中所述至少一种分子标记物与所述ROD1基因的敲除等位基因连锁。
17.一种用于检测芸苔属DNA样品中ROD1基因的敲除等位基因的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多种PCR引物对，所述PCR引物对能够扩增与所述ROD1基因的敲除等位基因连锁的DNA标记物。
18.一种确定植物或其细胞、部分、种子或子代中突变ROD1等位基因的接合性状态的方法，包括确定所述植物或其细胞、部分、种子或子代的基因组DNA中突变体和/或相应野生型ROD1特异性区域的存在。
19.一种用于转移来自一个植物的至少一种敲除的ROD1等位基因至另一个植物的方法，包括步骤：
(a)鉴定包含至少一种敲除的ROD1等位基因的第一植物，
(b)将第一植物与不包含所述至少一种敲除的ROD1等位基因的第二植物杂交并从杂种收集F1杂交种子，
(c)任选地，鉴定包含所述至少一种敲除的ROD1等位基因的F1植物，
(d)将包含所述至少一种敲除的ROD1等位基因的F1植物与不包含所述至少一种敲除的ROD1等位基因的第二植物回交至少一个世代(x)并且从杂种收集BCx种子，
(e)通过分析所述BCx植物的基因组DNA中至少一种分子标记物的存在，鉴定在每个世代中包含至少一种敲除的ROD1等位基因的BCx植物，其中所述至少一种分子标记物与所述敲除的ROD1等位基因连锁。
20.嵌合基因，其包含以下有效相连的元件：
a)植物可表达的启动子；
b)DNA区域，其在转录时产生抑制至少一种ROD1基因的RNA分子；和任选地
c)在植物细胞中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化区。
21.ROD1基因的敲除等位基因，其中所述敲除的ROD1等位基因是选自以下(a)和(b)的天然ROD1基因的突变形式：
(a)包含与SEQ ID No.1、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.10、SEQ ID No.13、SEQ ID No.16、SEQ ID No.19、SEQ ID No.22、SEQID No.25、SEQ ID No.28、SEQ ID No.31、SEQ ID No.34、SEQ ID No.84、SEQ ID No.86、SEQ ID No.88或SEQ ID No.90有至少90％序列同一性的核酸分子；
(b)编码下述氨基酸序列的核酸分子，所述氨基酸序列包含与SEQ IDNo.3、SEQ ID No.6、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21、SEQ ID No.24、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.36、SEQ ID No.85、SEQ ID NO.87、SEQ ID No.89或SEQ ID No.91至少90％的序列同一性；
其中与有功能的ROD1基因中相应的野生型DNA区域相比，所述突变rod1等位基因包含由一个或多个***、缺失或取代的核苷酸组成的突变的DNA区域并且其中所述突变rod1等位基因不编码有功能的ROD1蛋白或编码活性减少的ROD1蛋白。
22.产生油的方法，其包括从根据权利要求1-9中任一项所述的植物收获种子并从所述种子提取油。
23.一种产生食品、饲料或工业品的方法，包括
(a)获得根据权利要求1-9中任一项所述的植物或其部分；和
(b)从所述植物或其部分制备所述食品、饲料或工业品。
24.权利要求23所述的方法，其中
(a)所述食品或饲料是油、饼粕、籽粒、淀粉、面粉或蛋白质；或
(b)所述工业品是生物燃料、纤维、工业化学品、药物或保健食品。
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