CN104597027B - 一种基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测的方法 - Google Patents

一种基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测的方法，属于分析化学技术领域。本发明利用DNA介导纳米粒子自组装技术成功组装得到银纳米粒子四面体，利用四面体的特殊空间构型，通过在银纳米粒子四面体中引入三段含有待测物SDM、AFM1、OTA核酸适配体片段的DNA和三种信标分子，成功构建了基于银纳米粒子四面体的拉曼多重检测体系，当存在待测物时，四面体的空间构型发生改变引起拉曼信号的变化，进而进行检测；三种信标分子拉曼信号的变化对应于三种目标物的浓度，从而实现了对三种目标物SDM，AFM1和OTA的同时检测。该方法具有极高的灵敏度与良好的特异性，并且避免了纳米粒子无序聚集对检测结果的影响，更加有利于拉曼传感检测技术在实际中的应用。

Description

一种基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测的方法
技术领域
本发明涉及一种基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术
1928 年，印度科学家拉曼首次发现了拉曼散射现象，即当一个已知能量或波长、频率的光子和一个分子相互作用时，引起分子振动和能量损失的过程。随后拉曼先生发明了第一台拉曼光谱仪，并因此获得诺贝尔物理学奖。但是由于拉曼信号比较弱，该技术一直没有得到广泛的应用。后来随着激光器、CCD 和滤光片的发明使得拉曼光谱仪的性能大大改进，因而才有了后来拉曼光谱仪大范围的普及和应用。表面增强拉曼散射（SERS）是在原有拉曼散射的基础之上，利用贵金属纳米材料（如金、银等）表面的电磁场增强效应，使得吸附在其表面的分子产生拉曼增强效应的现象。一般情况下，SERS 可以将拉曼分子的拉曼信号增强 106 倍，从而实现拉曼光谱的单个分子检测。另外，由于 SERS 检测能很好的保持样品的原有状态、不受样品机制和背地的影响、图谱峰宽较窄、具有独特的分子指纹图谱、可用以高温、高压环境等优点，目前已广泛用于制药、毒品鉴别、生物医学、食品危害因子检测等领域。
磺胺二甲氧嘧啶（SDM）是一类人工合成广谱抑菌剂药物，添加在饲料中可以增肥家畜，预防和治疗细菌性疾病。这种药物容易残留在动物体内并对人体健康造成严重的影响，如损害脑神经***，造成溶血性贫血，过敏反应，引发甲状腺癌等。鉴于此，很多国家对动物源性食品中 SDM 的含量做出规定，中国的限量是 100mg/mL。赭曲霉毒素 A(OTA)是曲霉菌属和青霉菌属的某些产毒菌株的次级代谢产物，在全球范围内对农作物的污染都比较严重，是一种强烈的肾毒素和肝毒素，还具有免疫抑制性，直接危害人类健康，引起 DNA 的损伤，有致畸、致癌和致突变的作用。黄曲霉毒素M1（AFM1）属于黄曲霉毒素一类结构相似的化合物中的一种，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。黄曲霉毒素M1危害主要表现在致癌性和致突变性，对人及动物肝脏组织有破坏作用，可导致肝癌甚至死亡。
发明内容
本发明的目的是构建一种银纳米粒子四面体，并应用于磺胺二甲氧嘧啶（SDM）及黄曲霉毒素M1（AFM1）、赭曲霉毒素A（OTA）等的多重拉曼光谱检测。
本发明的技术方案：一种基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测的方法，利用含有待测物SDM，AFM1，OTA核酸适配体片段的DNA组装得到银纳米粒子四面体，当存在待测物时，四面体的空间构型发生改变引起拉曼信号的变化，进而进行检测；工艺步骤为：
（1）10nm粒径银纳米粒子（AgNP）合成
采用硼氢化钠还原硝酸银法合成粒径为10nm的银纳米粒子。
（2）银纳米粒子修饰DNA
上述合成的银纳米粒子和巯基修饰的 DNA（DNA1，DNA2， DNA3，DNA4） 进行偶联形成AgNP-DNA1，AgNP-DNA2，AgNP-DNA3，AgNP-DNA4复合体。
（3）拉曼信标分子的修饰
将三种拉曼信标分子4-氨基苯硫酚（4-ATP）、4-硝基苯硫醇（NTP）、4-甲氧基苄硫醇（MATT）分别对应修饰到AgNP-DNA1、AgNP-DNA2、AgNP-DNA3表面得到AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT。
（4）银纳米粒子四面体的组装
将上述制备的AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT，AgNP-DNA4混合，利用碱基互补配对杂交得到银纳米粒子四面体。
表1检测目标物核酸适配体的名称和序列
Sequence (5’-3’)
SDM GAG GGC AAC GAG TGT TTA TAG A
AFM1 ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAT
OTA GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA
表2用于构建银纳米粒子四面体的核酸序列。
Sequence (5’-SH- 3’)
DNA1 TTTATTGAGG GCAACGAGTG TTTATAGACT TTCCCTATTA GAAGGTCTCA GGTGCGCGTT TCCAGCCATA CCTTAGGTAC TTCTGCC
DNA2 TTTCGCGCAC CTGAGACCTT CTAATAGGGT TTGCGACAGT CGTTCAACTA GAATGCCCTT TGGGCTGTTC CGGGTGTGGC TCGTCGG
DNA3 TTTACTGCTA GAGATTTTCC ACATGGCTAT TTGATCGGGT GTGGGTGGCG TAAAGGGAGC ATACATTTCC GACGAGCCAC ACCCGGAACA GCCC
DNA4 TTTGTCTATA AACACTCGTT GCCCTCAATT TTTGACGATC TCTAAAAGGT GTACCGATTT TGGGCATTCT AGTTGAACGA CTGTCGC
（5）基于银纳米粒子四面体拉曼传感器的构建与应用
向步骤（4）制备出的银纳米粒子四面体体系中加入一系列不同浓度的SDM、AFM1、OTA标准溶液，分别测定其拉曼信号，根据三种不同信标的拉曼信号强度与待测物浓度建立标准曲线。
具体为：
（1）10nm粒径银纳米粒子（AgNP）合成
取一洁净的锥形瓶置于冰浴中，依次加入20mL超纯水，5mL质量分数为1%的聚乙烯吡咯烷酮和0.6mL 0.01mol/L的硼氢化钠水溶液。然后将5mL质量分数为1%的聚乙烯吡咯烷酮和5mL质量分数为1%的硝酸银水溶液同时以30mL/h的速度加入到锥形瓶中，边加入边搅拌，溶液由无色变成黄色。所得的银纳米粒子直径为10nm。
（2）银纳米粒子修饰DNA
取 30μL 20nM 上述合成的银纳米粒子AgNP于 PCR 管中，加入 1μL 10μM 的DNA1 混匀后，依次向体系中加入 5μL 5×tris- 硼酸缓冲液和 1.25μL 2mol/L NaCl 溶液，室温振摇反应 12h，13000r/min离心 10min，去除上清液，加超纯水至原体积，得AgNP-DNA1。AgNP-DNA2，AgNP-DNA3，AgNP-DNA4复合体的制备方法与AgNP-DNA1类似。
（3）拉曼信标分子的修饰
将三种拉曼信标分子4-氨基苯硫酚（4-ATP）、4-硝基苯硫醇（NTP）、4-甲氧基苄硫醇（MATT）分别对应加入到AgNP-DNA1、AgNP-DNA2、AgNP-DNA3体系中，溶液中拉曼信标分子的终浓度均为 3 μM，信标分子加入到体系中反应过夜，各自以 13000 r/min离心 10 min，去除上清液，再向体系中加入 20 mM Tris-HCl缓冲液恢复到原体积。制备得到AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT复合体。
（4）银纳米粒子四面体的组装
将上述制备的AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT，AgNP-DNA4各取100 μL 于 1.5 mL 离心管中混合均匀，加入 4 μL 5M NaCl 溶液，震荡混匀，90℃水浴 5min，再在水蒸气中缓慢降到室温，即制备得到银纳米粒子四面体。
（5）基于银纳米粒子四面体拉曼传感器的构建与应用
对于 SDM、AFM1、OTA的同时检测，三种物质按照先后顺序逐个加入到体系中，每种物质中间间隔 30 min。SDM的添加浓度依次为 0，0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5 fM；AFM1的添加浓度依次为 0，0.1，0.5，1，5，10，50 fM；OTA的添加浓度依次为 0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5 fM。三种物质全部加入并反应结束后测体系的拉曼光谱，分别根据 4-ATP，NTP 及 MATT 的拉曼信号的强度建立 SDM、AFM1、OTA的浓度标准曲线。拉曼光谱测试时间为 20 s，激发波长为 633 nm。
一种通用型基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测的方法，通过对银纳米粒子四面体制备过程中使用的核酸适配体序列的改变，即可制备得到对应待测物的拉曼多重检测传感器。
本发明的有益效果：首先，银纳米粒子的拉曼增强效果比其他贵金属明显，是很好的拉曼基底材料。其次，检测是基于对纳米粒子四面体空间结构的可控调节，在整个检测过程中没有出现纳米粒子的无规则聚集现象，减少了外界环境的干扰；再次，目标物通过与适配体识别引起四面体结构发生变化，具有很好的特异性；最后，四面体具有六个 DNA 边，可用于多个目标物的同时检测，既可以用于小分子的检测，也可以用于蛋白质等大分子的定量检测。
附图说明
图1本发明基于银纳米粒子四面体拉曼检测的原理图。
图2银纳米粒子四面体的：(A) TEM 图，(B) 冷冻电子三维成像图， (C) 空间构型示意图；加入SDM后的银纳米粒子四面体的：(D) TEM 图，(E) 冷冻电子三维成像图， (F)空间构型示意图。
图3（A）银纳米粒子四面体用于 SDM、AFM1 和 OTA 检测的拉曼指纹图谱；（B）基于银纳米粒子四面体的多重检测体系同时检测SDM、AFM1 和 OTA，其中SDM的浓度依次为0，0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5 fM；AFM1的浓度依次为 0，0.1，0.5，1，5，10，50 fM；OTA的浓度依次为 0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5 fM；（C） 从左到右依次为：SDM浓度与拉曼信号强度的标准曲线，AFM1浓度与拉曼信号强度的标准曲线，OTA浓度与拉曼信号强度的标准曲线。
图4基于银纳米粒子四面体检测牛奶中 SDM 的拉曼光谱。
具体实施方式
实施例1
（1） 10nm粒径银纳米粒子（AgNP）合成
取一洁净的锥形瓶置于冰浴中，依次加入20mL超纯水，5mL质量分数为1%的聚乙烯吡咯烷酮和0.6mL 0.01mol/L的硼氢化钠水溶液。然后将5mL质量分数为1%的聚乙烯吡咯烷酮和5mL质量分数为1%的硝酸银水溶液同时以30mL/h的速度加入到锥形瓶中，边加入边搅拌，溶液由无色变成黄色。所得的银纳米粒子直径为10nm。
（2）银纳米粒子修饰DNA
取 30μL 20nM 上述合成的银纳米粒子AgNP于 PCR 管中，加入 1μL 10μM 的DNA1 混匀后，依次向体系中加入 5μL 5×tris- 硼酸缓冲液和 1.25μL 2mol/L NaCl 溶液，室温振摇反应 12h，13000r/min离心 10min，去除上清液，加超纯水至原体积，得AgNP-DNA1。AgNP-DNA2，AgNP-DNA3，AgNP-DNA4复合体的制备方法与AgNP-DNA1类似。
（3）拉曼信标分子的修饰
将三种拉曼信标分子4-氨基苯硫酚（4-ATP），4-硝基苯硫醇（NTP）和 4-甲氧基苄硫醇（MATT）分别加入到AgNP-DNA1，AgNP-DNA2，AgNP-DNA3体系中，溶液中拉曼信标分子的终浓度均为 3 uM，信标分子加入到体系中反应过夜，各自以 13000 r/min离心 10 min，去除上清液，再向体系中加入 20 mM Tris-HCl缓冲液恢复到原体积。制备得到AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT复合体。
（4）银纳米粒子四面体的组装
将上述制备的AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT，AgNP-DNA4各取100 uL 于 1.5 mL 离心管中混合均匀，加入 4μL 5M NaCl 溶液，震荡混匀，90℃水浴 5min，再在水蒸气中缓慢降到室温，即制备得到银纳米粒子四面体。
（5）基于银纳米粒子四面体拉曼传感器的构建与应用
对于 SDM、AFM1、OTA的同时检测，三种物质按照先后顺序逐个加入到体系中，每种物质中间间隔 30 min。SDM的添加浓度依次为 0，0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5 fM;AFM1的添加浓度依次为 0，0.1，0.5，1，5，10，50 fM; OTA的添加浓度依次为 0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5 fM。三种物质全部加入并反应结束后测体系的拉曼光谱，分别根据 4-ATP，NTP 和 MATT 的拉曼信号的强度建立 SDM、AFM1、OTA的浓度标准曲线。拉曼光谱测试时间为 20 s，激发波长为 633 nm。
DNA1：5’-SH-TTTATTGAGG GCAACGAGTG TTTATAGACT TTCCCTATTA GAAGGTCTCAGGTGCGCGTT TCCAGCCATA CCTTAGGTAC TTCTGCC-3’；
DNA2：5’ -SH -TTTCGCGCAC CTGAGACCTT CTAATAGGGT TTGCGACAGT CGTTCAACTAGAATGCCCTT TGGGCTGTTC CGGGTGTGGC TCGTCGG-3’；
DNA3：5’ -SH -TTTACTGCTA GAGATTTTCC ACATGGCTAT TTGATCGGGT GTGGGTGGCGTAAAGGGAGC ATACATTTCC GACGAGCCAC ACCCGGAACA GCCC-3’；
DNA4：5’ -SH - TTTGTCTATA AACACTCGTT GCCCTCAATT TTTGACGATC TCTAAAAGGTGTACCGATTT TGGGCATTCT AGTTGAACGA CTGTCGC -3’。

Claims (5)

1.一种基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测SDM，AFM1，OTA的方法，首先合成10nm粒径银纳米粒子AgNP；其特征在于利用含有待测物SDM，AFM1，OTA核酸适配体片段的DNA组装得到银纳米粒子四面体，当存在待测物时，四面体的空间构型发生改变引起拉曼信号的变化，进而进行检测；工艺步骤为：
（1）银纳米粒子修饰DNA：
上述合成的银纳米粒子AgNP分别和巯基修饰的 DNA1，DNA2，DNA3，DNA4 进行偶联形成AgNP-DNA1，AgNP-DNA2，AgNP-DNA3，AgNP-DNA4复合体；
构建银纳米粒子四面体的核酸序列：
DNA1：5’-SH-TTTATTGAGG GCAACGAGTG TTTATAGACT TTCCCTATTA GAAGGTCTCAGGTGCGCGTT TCCAGCCATA CCTTAGGTAC TTCTGCC-3’；
DNA2：5’ -SH -TTTCGCGCAC CTGAGACCTT CTAATAGGGT TTGCGACAGT CGTTCAACTAGAATGCCCTT TGGGCTGTTC CGGGTGTGGC TCGTCGG-3’；
DNA3：5’ -SH -TTTACTGCTA GAGATTTTCC ACATGGCTAT TTGATCGGGT GTGGGTGGCGTAAAGGGAGC ATACATTTCC GACGAGCCAC ACCCGGAACA GCCC-3’；
DNA4：5’ -SH - TTTGTCTATA AACACTCGTT GCCCTCAATT TTTGACGATC TCTAAAAGGTGTACCGATTT TGGGCATTCT AGTTGAACGA CTGTCGC -3’：
（2）拉曼信标分子的修饰：
将三种拉曼信标分子4-氨基苯硫酚4-ATP，4-硝基苯硫醇NTP、 4-甲氧基苄硫醇MATT对应修饰到AgNP-DNA1，AgNP-DNA2，AgNP-DNA3表面得到AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT；
（3）银纳米粒子四面体的组装：
将上述制备的AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT，AgNP-DNA4混合，利用碱基互补配对杂交得到银纳米粒子四面体；
（4）基于银纳米粒子四面体拉曼传感器的构建与应用：
向步骤（3）制备出的银纳米粒子四面体体系中加入一系列不同浓度的SDM、AFM1、OTA标准溶液，分别测定其拉曼信号，根据三种不同信标的拉曼信号强度与待测物浓度建立标准曲线。
2.根据权利要求1所述的基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测SDM，AFM1，OTA的方法，其特征在于银纳米粒子修饰DNA：取 30μL 20nM 所述合成的银纳米粒子AgNP于 PCR 管中，加入 1μL 10μM 的 DNA1 混匀后，依次向体系中加入 5μL 5×tris- 硼酸缓冲液和 1.25μL 2mol/L NaCl 溶液，室温振摇反应 12h，13000r/min离心 10min，去除上清液，加超纯水至原体积，得AgNP-DNA1；AgNP-DNA2，AgNP-DNA3，AgNP-DNA4复合体的制备方法与AgNP-DNA1类似。
3.根据权利要求1所述的基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测SDM，AFM1，OTA的方法，其特征在于拉曼信标分子的修饰：将三种拉曼信标分子4-氨基苯硫酚4-ATP、4-硝基苯硫醇NTP、4-甲氧基苄硫醇MATT分别对应加入到AgNP-DNA1、AgNP-DNA2、AgNP-DNA3体系中，溶液中拉曼信标分子的终浓度均为 3μM，信标分子加入到体系中反应过夜，各自以 13000 r/min离心 10 min，去除上清液，再向体系中加入 20 mM Tris-HCl缓冲液恢复到原体积，制备得到AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT复合体。
4.根据权利要求1所述的基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测SDM，AFM1，OTA的方法，其特征在于银纳米粒子四面体的组装：将上述制备的AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT，AgNP-DNA4各取 100 μL 于 1.5 mL 离心管中混合均匀，加入 4 μL 5MNaCl 溶液，震荡混匀，90℃水浴 5 min，再在水蒸气中缓慢降到室温，即制备得到银纳米粒子四面体。
5.根据权利要求1所述的基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测SDM，AFM1，OTA的方法，其特征在于基于银纳米粒子四面体拉曼传感器的构建与应用：对于 SDM、AFM1、OTA的同时检测，三种物质按照先后顺序逐个加入到体系中，每种物质中间间隔 30 min；SDM的添加浓度依次为 0，0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5 fM；AFM1的添加浓度依次为 0，0.1，0.5，1，5，10，50 fM；OTA的添加浓度依次为 0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5 fM；三种物质全部加入并反应结束后测体系的拉曼光谱，分别根据 4-ATP，NTP 及 MATT 的拉曼信号的强度建立SDM、AFM1、OTA的浓度标准曲线；拉曼光谱测试时间为 20 s，激发波长为 633 nm。
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