CN104593389A - 一种重组合胞病毒蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组合胞病毒蛋白rRSV-58，及表达该蛋白的基因rRSV-58，以合胞病毒培养物为模板，以引物P1和P2扩增合胞病毒基因组中第628位到第999位核苷酸片段，以引物P3和P4扩增第1140位到第2312位核苷酸片段；再以第一轮PCR扩增得到的两片段为模板，加入引物P1和P4，扩增rRSV-58片段；得到串联的目的基因重组片段；将重组片段***pET-28a中，转染至大肠杆菌为BL21（DE3），诱导表达，得到了一种重组合胞病毒蛋白，以其为抗原制备的胶体金试剂盒， 检测合胞病毒感染，特异性强、灵敏度高，与国外出口试剂盒测试比较，检测总符合率：（49+206）/260=98.1%。

Description

一种重组合胞病毒蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程、疫苗研制和诊断试剂等领域，具体地涉及一种重组合胞病毒蛋白、表达该蛋白的基因及其应用。

背景技术

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）简称合胞病毒，又称融合病毒，是一种RNA病毒，属副黏病毒科肺炎属。病毒颗粒呈圆形，大小不一，直径为100～300nm。核心为单股RNA，外有核壳，最外一层为带有刺状突起的包膜。因不含血凝素，故无血凝作用。病毒能在人体呼吸道细胞和人肾、猴肾等细胞培养中生长，并产生病变。只有一个血清型,可分4个亚型。抵抗力弱，不耐***、酸、热及冻融，pH3以下和55℃五分钟即可灭活。

流行病学

RSV是婴幼儿呼吸道感染，尤其是毛细支气管炎（简称毛支）的主要病原体。感染后主要表现为毛细支气管炎和肺炎，占2岁以下婴幼儿住院中的45%。越来越多的流行病学资料显示，婴幼儿期的毛细支气管炎是日后儿童哮喘的高危因素。

RSV感染呈世界性分布，最新的研究发现免疫功能缺陷的成年人及老年人也是RSV的易感人群。

RSV感染后不存在保护性免疫，再感染的发生率很高，每年约有100万人死于RSV感染，美国每年约花费22.5亿美元用于治疗RSV感染。

RSV的蛋白组成： 

RSV属副粘病毒科肺炎病毒属，其基因组为不分节的线性负链RNA，约含15 000个核苷酸，共有10个不同的基因，编码1O个病毒蛋白。从3’一5’，其基因的排列顺序为为NS1一NS2一N—P—M—SH-G—F—M2一L。似乎所有蛋白是通过一共同的开放读码框架翻译的。1O个蛋白中8个为结构蛋白，即大糖蛋白G、融合糖蛋白F，与包膜相连的基质蛋白M 和M2(亦称22*103蛋白)、核蛋白N、磷酸化蛋白P、大蛋白L和小疏水蛋白SH(以前称为1A)，另l2个蛋白为非结构蛋白NSl和NS2( 前分别称为1C和11B)．除F、G和SH外．其求均不糖基化．SH有4种形式，分子量分别为4.8×103、7．5×103、15×103和21×103~30×103,后两种形式糖基化。M基因和M2基因中均另有一个开放读码框架，分别编码75个氨基酸和990个氨基酸的蛋白质，因而设想可能存在第l1和第12种病毒蛋白，但至今未分离成功。

相关的临床或实验室诊断方法：

检测呼吸道合胞病毒感染，目前国内外多采用病毒分离培养法、间接免疫荧光法(IF)、直接免疫荧光法、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法(APAAP)、生物素链霉亲和素过氧化物酶法、酶联免疫吸附试验(EusA)、病毒快速检测法、分子生物学法，如多重逆转录聚合酶链反应(mRT-PCR)、巢式PCR及核酸杂交、多重实时PCR、基因芯片技术、悬浮阵列技术等多种检测手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组合胞病毒蛋白及该重组合胞病毒蛋白在制备检测试剂盒中的应用。

一种重组合胞病毒蛋白基因rRSV-58，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

一种重组合胞病毒蛋白基因rRSV-58的制备方法：

以合胞病毒培养物为模板，以引物P1和P2扩增合胞病毒基因组中第628位到第999位核苷酸片段，以引物P3和P4扩增第1140位到第2312位核苷酸片段；再以第一轮PCR扩增得到的两片段为模板，加入引物P1和P4，扩增rRSV-58片段；得到串联的目的基因重组片段rRSV-58；

P1：CGCGGATCCATGGACACACACAATGACACC；

P2： CTTGACTTTGCTAAGAGCCATTGGATTGAGATCATACTTGTATATTATGG；

P3：CCATAATATACAAGTATGATCTCAATCCAATGGCTCTTAGCAAAGTCAAG；

P4: CCGCTCGAGAAGCTCTACATCATTATCTTTTGG。

一种重组合胞病毒蛋白rRSV-58，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

一种重组合胞病毒蛋白的表达载体，它是在表达载体中***了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因rRSV-58；

所述的载体为pET-28a。

一种重组合胞病毒蛋白的工程菌，它是转染了上述的一种合胞病毒蛋白的表达载体的大肠杆菌；

所述的大肠杆菌为BL21（DE3）。

一种重组合胞病毒蛋白的制备方法，将一种重组合胞病毒蛋白的表达载体转染至大肠杆菌为BL21（DE3）中，诱导表达、回收、提纯。

一种重组合胞病毒蛋白中制备检测合胞病毒感染的试剂盒中的应用；

所述的试剂盒为胶体金试剂盒；

所述的胶体金试剂盒包括：一种重组合胞病毒蛋白划线包被浓度为1.0 mg/mL，胶体金结合物喷点量为60.0 μL/cm²，兔抗合胞病毒抗体包被量为1.0 μL/cm，包被浓度为5.0 mg/mL。

以下将更详细的描述本发明的技术方案：

本发明提供了一种编码合胞病毒蛋白的如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，利用该核苷酸序列制备合胞病毒蛋白的方法，由该方法制备的包含SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的合胞病毒蛋白，以及包含该蛋白的组合物和试剂盒，同时还公开了它们在检测合胞病毒感染的应用。

SEQ ID NO.1所示核苷酸序列可以通过本领域常规的方法制备，选择其强抗原表位即合胞病毒RSV基因组（GenBank: U39661.1）中DNA序列为模板，设计两对PCR引物（P1，P2）和（P3，P4）。p1和p2用于扩增合胞病毒基因组中第628位到第999位核苷酸，p3和p4用于扩增第1140位到第2312位核苷酸；引物p1和p4分别带有BamH I和Xho I的酶切位点，引物p2和p3顺序互补；利用P2中的连接引物将中间部分疏水片断去除，并根据大肠杆菌的表达子偏爱性对基因序列进行了部分点突变。

引物序列如下：

P1：CGCGGATCCATGGACACACACAATGACACC

P2： CTTGACTTTGCTAAGAGCCATTGGATTGAGATCATACTTGTATATTATGG

P3：CCATAATATACAAGTATGATCTCAATCCAATGGCTCTTAGCAAAGTCAAG

P4: CCGCTCGAGAAGCTCTACATCATTATCTTTTGG

以合胞病毒培养物为模板，以引物P1和P2扩增合胞病毒基因组中第628位到第999位核苷酸片段，以引物P3和P4扩增第1140位到第2312位核苷酸片段；再以第一轮PCR扩增得到的两片段为模板，加入引物P1和P4，扩增rRSV-58片段；得到串联的目的基因重组片段rRSV-58。

本发明对上述核苷酸序列的核酸分子采用适当载体和宿主细胞表达时可以大大提高表达产率。

本发明还提供应用如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列制备合胞病毒蛋白的方法。根据常规方法，可将含编码合胞病毒蛋白的如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的核酸分子连接到一个表达载体中，然后通过常规方法转化细胞。通常，优选原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本发明的载体构建。例如，大肠杆菌等肠科杆菌。

编码本发明蛋白的核酸与pET-28a形成的杂合质粒具有高度的稳定性，有利于本发明的蛋白的表达。

在本发明的一个实施方案中，制备含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的核酸分子和pET-28a质粒的表达构建体，并将该构建体转化BL21（DE3），经IPTG诱导培养后，收集菌体。可采用常规的纯化方法纯化所得到的蛋白。

本发明还提供用上述方法制备、纯化的合胞病毒蛋白，该蛋白具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。

本发明还提供包含本发明合胞病毒蛋白的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒可制备成检测人合胞病毒感染的试剂或试剂盒形式，在临床上用于方便、快速和准确的检测合胞病毒感染。任何生物学样品，只要它们含有合胞病毒抗体，就可用本发明蛋白，包含该蛋白的组合物或试剂盒来检测。

本文所述“试剂盒”是指利用本发明蛋白完成合胞病毒感染检测而组配制成的成套试剂。该试剂盒用于诊断合胞病毒感染。在用于合胞病毒感染检测的试剂盒中，本发明的合胞病毒蛋白也可以是经过标记的。具体可使用酶、金属螯合物等标记。优选的标记性酶例如，辣根过氧化物酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶等。优选的金属物质有胶体金等。

目前市场上有加拿大HCB(Hermes Criterion Biotechnology)公司生产的“人抗呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒（ELISA法）”是对合胞病毒抗体进行检测的。

而采用本发明提供的重组合胞病毒蛋白制备的诊断试剂盒，与该试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点，很好的满足了合胞病毒感染临床诊断的需要。

附图说明

图1 PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中M表示Marker，1表示扩增产物；

图2 是诱导后菌体12％SDS－PAGE电泳图，其中M表示Marker，1表示目的蛋白。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1 合胞病毒蛋白的制备

1.1  合胞病毒蛋白抗原表位筛选及目的基因克隆

通过计算机分析合胞病毒的全部氨基酸序列筛选出合胞病毒蛋白的强抗原表位，所述的重组蛋白质从N-末端到C-末端依次含有RSV基因组中从N-末端第628位到第999位核苷酸，和第1140位到第2312位核苷酸的515个氨基酸。其中上述重组蛋白质的DNA序列如SEQ ID No.2所示。

根据合胞病毒RSV基因组中目的肽段的cDNA序列和质粒上的酶切位点，设计两对PCR引物（P1，P2）和（P3，P4）。p1和p2用于扩增RSV中第628位到第999位核苷酸，p3和p4用于扩增RSV第1140位到第2312位核苷酸；引物p1和p4分别带有BamH I和Xho I的酶切位点，引物p2和p3部分核苷酸序列互补。

引物序列如下：

P1：CGCGGATCCATGGACACACACAATGACACC

P2：CTTGACTTTGCTAAGAGCCATTGGATTGAGATCATACTTGTATATTATGG

P3：CCATAATATACAAGTATGATCTCAATCCAATGGCTCTTAGCAAAGTCAAG

P4: CCGCTCGAGAAGCTCTACATCATTATCTTTTGG

上述引物由（华美生物技术有限公司）合成。

以合胞病毒培养物（军事医学科学院微生物流行病研究所赠，在辽宁省沈阳市从临床病人中分离, 军事医学科学院微生物流行病研究所,地址：北京市丰台区东大街 20 号联系人：司炳银）为模板，以引物P1和P2扩增RSV第628位到第999位核苷酸片段，以引物P3和P4扩增RSV第1140位到第2312位核苷酸片段；再以第一轮PCR扩增得到的两片段为模板，加入引物P1和P4，扩增rRSV-58片段；得到串联的目的基因重组片段rRSV-58；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示。切割含目的DNA条带的胶块，用DNA快速纯化试剂盒(购自六合通-北京TAKARA公司，产品名称：TAKARA MiniBEST Plasmid purification)回收目的DNA，操作按产品说明书进行。  rRSV-58其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

1.2表达载体pET-28a-rRSV-58的构建及鉴定

pET-28a载体（购自华美生物技术有限公司）与PCR扩增产物目的DNA片段经BamH I和Xho I双酶切，产物纯化（采用TAKARA MiniBEST Plasmid purification试剂盒，购自六合通-北京TAKARA公司）后经T₄ DNA连接酶与载体连接，连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态（购自华美生物技术有限公司），涂布于含卡那霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落，碱裂解法抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳选择可疑重组质粒作为模板进行PCR扩增，对有扩增产物的重组子质粒经内切酶BamH I和 Xho I双酶切、鉴定，其中有3个重组子为阳性重组子。从3个阳性重组子中选一个阳性重组子送赛百胜公司测序鉴定，结果表明该质粒上确实***了目的基因，且***方向正确，将此重组质粒命名为表达质粒pET-28a-rRSV-58。

1.3表达肺炎支原体蛋白的工程菌的构建

将表达质粒pET-28a-rRSV-58用化学转化法（(美)J.萨姆布鲁克(JosephSambrook),(美)D.W.拉塞尔(DavidW.Russell)著,黄培堂等译.分子克隆实验指南.科学出版社,2002.）转入大肠埃希氏菌BL21（DE3）菌株（购自华美生物技术有限公司），涂布于含卡那霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落用含卡那霉素的LB培养基培养，用IPTG诱导表达5小时，诱导后的菌体用12％SDS－PAGE分析（同上文献），结果如附图2所示，确定表达合胞病毒蛋白的菌株即为所需的工程菌株，用甘油冷冻保存。

1.4重组合胞病毒蛋白的表达制备及纯化

诱导培养已构建的表达合胞病毒蛋白的大肠埃希氏菌，用IPTG诱导表达5小时，离心收集菌体，以1:10（W/V）加入菌体裂解液（50 mm pH 8.0 Tris-Cl，50 mm NaCl，50%甘油），加入磁力搅拌转子搅拌30分钟，经超声破菌（冰浴，功率200W，超声3秒，间隔5秒，超声80次）、组氨酸亲和柱（300 mL 200 mm的NiCl₂过柱，流速5 mL/min；500 mL平衡缓冲液洗注，流速10 mL/min；超声离心后的沉淀用200 mL平衡缓冲液稀释后上样，流速3 mL/min，500 mL平衡缓冲液洗注，流速5 mLmin；用分别含咪唑20 mm、50 mm、100 mm、200 mm各100 mL的洗脱缓冲液洗脱，紫外检测仪280 nm检测吸收值，收集洗脱峰；SDS－PAGE电泳检测纯化组分）得到纯化的重组蛋白。

 1.5合胞病毒重组融合蛋白鉴定

1.5.1纯度和分子量的测定：经SDS－PAGE电泳检测（蛋白上样量10 μg），为单一区带，薄层扫描鉴定纯度为95.8%。分子量约为58.2 kDa。

 1.4.2浓度测定：经Folin-酚法测定，以牛血清白蛋白作为标准参比品，抗原蛋白浓度为5.0±0.5 mg/mL。

 1.4.3重组蛋白Western-blot验证

为验证重组rRSV-58型蛋白质与抗RSV抗血清反应性及重组目的基因获得表达并具有抗原性，用Western-blot法进行了测试。阳性血清为：10份兔抗RSV抗体阳性血清（购自北京百安天地医药科技有限公司）和30份人抗RSV抗体阳性血清（经ELISA法检测证实）。阴性血清为：10份对照正常兔血清和30份人抗RSV抗体阴性血清（经ELISA法检测证实）。结果如表1。

  

结果显示，用合胞病毒培养物免疫兔子所得的10份兔抗RSV抗体阳性血清和30份人抗RSV抗体阳性血清全部与表达抗原产生阳性反应，10份对照正常兔血清和30份人抗RSV抗体阴性血清与表达抗原均产生阴性反应。结果提示重组目的基因获得表达，重组rRSV-58蛋白质与全病毒蛋白质有明显的交叉反应性，并具有很强的特异性，具有实际应用意义。

实施例2 合胞病毒抗体胶体金检测试剂盒的制备和性能检定

2.1合胞病毒抗体胶体金检测试剂盒的制备

将以上制得的重组rRSV-58蛋白用作试剂盒标记抗原，用胶体金法测定RSV抗体。该试剂盒的研制和使用如下：

（1）试剂盒原理：本发明根据双抗原夹心法原理，用rRSV-58重组抗原包被硝酸纤维素膜，胶体金标记基因工程重组合胞病毒（rRSV-58）抗原为示踪物。使用时加入待检血清，如样品中含有抗RSV特异性抗体，则可与膜表面的rRSV-58重组抗原结合形成复合物，该复合物与胶体金标记的rRSV-58抗原结合而呈现***条带。

（2）试剂盒性能优化：以阳性和阴性质控品（收集多家医院经临床验证的抗合胞病毒抗体阳性、阴性血清，用加拿大HCB(Hermes Criterion Biotechnology)公司生产的“人抗呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒（ELISA法）”进行复检筛选，得到的抗合胞病毒阳性、阴性血清建立为阳性和阴性质控品）为测试样品，采用交叉配比法确定rRSV-58重组抗原和rRSV-58抗原胶体金（rRSV-58-Ag.G）结合物的最佳工作浓度，结果如表2，由结果得出，若划线包被浓度高于2.0 mg/mL则可能导致假阳性结果，低于2.0 mg/mL则可能导致假阴性结果；若稀释到一倍以上则可能导致假阴性结果。所以，综合考虑后选择rRSV-58重组抗原划线包被浓度为2.0 mg/mL、rRSV-58-Ag.G复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫。

－：阴性反应（无检测线）；±：可疑阳性（检测线隐约可见）；＋：阳性反应（出现检测线）；＋＋：较强阳性反应（检测线清晰）；＋＋＋强阳性反应（检测线颜色深）（以下解释同）

在已确定rRSV-58重组抗原划线包被浓度为2.0 mg/mL、rRSV-58-Ag.G复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫的基础上，以阳性和阴性质控品（来源和标准同上）为测试样品，选择最佳rRSV-58重组抗原划线量。从表3可以看出，当划线量高于1.5 μL/cm则会导致非特异性反应（假阳性），而低于1.0 μL/cm则会导致假阴性结果。所以结合生产成本的考虑，最终选择最佳rRSV-58重组抗原划线量（喷金量为60.0 μL/cm²）为1.0 μL/cm。结果见表3。

－：阴性反应；±：可疑阳性；＋：阳性反应；＋＋：较强阳性反应；＋＋＋强阳性反应

在已确定rRSV-58重组抗原划线浓度为2.0 mg/mL，划线量为1.0 μL/cm和合胞病毒抗原胶体金复合物喷点浓度为浓缩原液到稀释一倍之间的基础上，以阳性和阴性质控品（来源和标准同上）为测试样品，采用方阵滴定选择最佳胶体金结合物喷点量。从表4可以看出，若喷点量低于60.0 μL/cm²则会导致假阴性结果，高于70.0 μL/cm²则导致假阳性结果，所以结合生产成本的考虑，最终选择最佳胶体金结合物喷点量为60.0 μL/cm²。结果见表4。

－：阴性反应；±：可疑阳性；＋：阳性反应；＋＋：较强阳性反应；＋＋＋强阳性反应

在已确定抗原胶体金复合物包被量的基础上来选择质控线兔抗合胞病毒抗体的包被浓度。兔抗合胞病毒抗体包被量为1.0 μL/cm，包被浓度为5.0 mg/mL。结果见表5。

 

±：质控线隐约可见；＋：出现质控线；＋＋：质控线清晰；＋＋＋：质控线清晰粗大

以上显示，兔抗合胞病毒抗体与本试验中所用合胞病毒抗原胶体金复合物有较好的反应性。兔抗合胞病毒抗体包被浓度低，反应强度相对较弱。4.0-5.0 mg/mL浓度包被基本上能够较好地显示质控效果。因而选择5.0 mg/mL浓度作为质控线包被浓度。

rRSV-58重组抗原划线包被后，分别用下述缓冲***进行封闭，比较封闭效果，结果表明含PEG₂₀₀₀₀的封闭***封闭后灵敏度和特异性都有所下降，其他封闭和不封闭的结果没有区别，所以选择不封闭硝酸纤维素膜。结果见表6。

－：阴性反应； ±：可疑阳性；＋：阳性反应；＋＋：较强阳性反应； ＋＋＋强阳性反应

（3）试剂盒的制备

1）取1.0g的HAuCl₄.H₂O溶解于100 mL纯化水中，配成1%氯金酸溶液；取1 mL的1%氯金酸溶液入100 mL沸水中，加入2 mL、1%的柠檬酸三钠，继续煮沸30 min，合成胶体金；取6 mL合成的胶体金溶液，在400-700 nm处进行扫描检验；取合成的约30 nm胶体金406 mL，用0.1 M K₂CO₃调PH至7，量取5 mg/mL 2.65 mL rRSV-58抗原用PH8.2的20 mM Tris-Cl稀释至40 mL，边搅拌边加入胶体金溶液，继续搅拌10 min，量取1% BSA 40mL，边搅拌边加入前述溶液，继续搅拌10 min，3000 r/min 4℃离心10Lmin，去沉淀，上清重新平衡后，12000 r/min 4℃离心45Lmin,去上清，重复2次；用内部质控血清对胶体金复合物进行检验，检验合格后，按前述浓度喷点包被抗原胶体金复合物，然后在37℃、相对湿度30%以下通风干燥16-22小时（过夜）后切割。

2）预切割NC膜，粘贴背板，按前面确定的浓度和划线量包被rRSV-58重组抗原和兔抗合胞病毒抗体划线包被于NC膜上，在37℃、相对湿度30%以下的条件下干燥1.0小时。

3）撕掉包被检测线和质控线的NC膜（带背板）检测线端的纸膜，将抗原胶体金结合物垫粘贴在NC膜的质控线端，交叉约1 mm，压实，将裁好的载样垫粘贴在抗原胶体金结合物垫的下端，压实，将裁好的吸水垫粘贴在NC膜的质控线端，将贴好的检测板两端裁切去掉1 cm，用切条机切成4 mm宽。抽取18条，用内部质控血清检测半成品检测卡。

4）将每个检测卡单独封装，每个独立包装为1人份，20人份封装成1盒。抽样检验。

各缓冲液配方如下：

1）rRSV-58重组抗原包被缓冲液配方：20 mM Tris-Cl缓冲液（pH8.2）见表7。

2） 兔抗合胞病毒抗体包被缓冲液配方：20 mM Tris-Cl缓冲液（pH8.2）见表8。

3） 抗原胶体金复合物包被缓冲液配方：20 mM TBS缓冲液（pH8.2）见表9。

（4）试剂盒使用操作方法：

1）打开检测卡的铝箔袋包装，取出检测卡。

2）将检测卡倾斜成加样孔端低于另一端不少于1.0 cm。

3）取100 μL待检血清加入到圆形样品孔中，室温（15℃～30℃）放置25分钟观察并记录结果。

4）检验结果判定：

阳性：判读窗口出现两条***线条带。

阴性：判读窗口仅质控线位置出现一条***线条带。

无效：判读窗口质控线位置无***线条带。

 2.2试剂盒性能检测实验

（1）特异性（准确性）测定：按前述实验确定的胶体金测定方法，检测几种其他血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试剂盒检测15份阴性血清（临床已确定），符合率为100％；检测50份类风湿因子阳性血清标本、50份合胞病毒阳性血清标本、50份沙眼衣原体阳性血清标本等，无一阳性，表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性，特异性很好。

（2）灵敏度测定：按前述实验确定的胶体金测定方法，检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测15份阳性血清（临床已确定），符合率为100％。

（3）与国内外同类产品的比较试验：本发明试剂盒与加拿大HCB(Hermes Criterion Biotechnology)公司生产的“人抗呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒（ELISA法）”检测260份血清样本的比较实验结果如表10。

表10  与加拿大HCB公司人抗呼吸道RSV抗体检测试剂盒的比较测试结果

检测总符合率：（49+206）/260=98.1%，初步表明本试剂盒达到进口试剂盒的标准。

 <110>   吉林大学

<120>   一种重组合胞病毒蛋白及其应用

 

<160>   2

 

<210>   1

<211>   1545

<212>   DNA

<213>   人工

 

<400>   1

 

atggacacaa cacacaatga caccacacca caaagactga tgatcacaga catgagacca     60

ttgtcacttg agactataat aatatcacta accagagaca tcataacaca cagatttata     120

tacttgataa atcatgaatg tatagtgaga aaacttgatg aaagacaggc cacatttaca     180

ttcctggtca actatgaaat gaaactattg cacaaagtgg gaagcactaa atacaaaaaa     240

tatactgaat acaacacaaa atatggcact tttcctatgc caatatttat caatcatgat     300

gggttcttag aatgcattgg cattaagcct acaaagcaca ctcccataat atacaagtat     360

gatctcaatc caatggctct tagcaaagtc aagttgaatg atacactcaa caaagatcaa     420

cttctgtcat ccagcaaata caccatccaa cggagcacag gagatagtat tgatactcct     480

aattatgatg tgcagaaaca catcaataag ttatgtggca tgttattaat cacagaagat     540

gctaatcata aattcactgg gttaataggt atgttatatg ctatgtctag attaggaaga     600

gaagacacca taaaaatact cagagatgcg ggatatcatg taaaagcaaa tggagtggat     660

gtaacaacac atcgtcaaga tattaatggg aaagaaatga aatttgaagt gttaacattg     720

tcaagcttaa caactgaaat tcaaatcaac attgagatag aatctagaaa atcctacaaa     780

aaaatgctaa aagaaatggg agaggtagct ccagaataca ggcatgactc tcctgattgt     840

gggatgataa tattatgtat agcggcatta gtaataacca aattagcagc aggggataga     900

tctggtctta cagctgtgat taggagggct aataatgtcc taaaaaatga aatgaaacgt     960

tataaaggct tactacccaa ggatatagcc aacagcttct atgaagtgtt tgaaaaatat     1020

cctcacttta tagatgtttt tgttcatttt ggtatagcac aatcttctac cagaggtggc     1080

agtagagttg aagggatttt tgctggattg tttatgaatg cctatggtgc agggcaagtg     1140

atgttacggt ggggggtctt agcaaaatca gttaaaaata ttatgctagg acacgctagt     1200

gtgcaagcag aaatggaaca agttgtggag gtttatgaat atgcccaaaa attgggtgga     1260

gaagcagggt tctaccatat attgaacaac ccaaaagcat cattattgtc tttgactcaa     1320

tttcctcact tctccagtgt agtattaggc aatgctgctg gcctaggcat aatgggagaa     1380

tacagaggta caccaaggaa tcaagatcta tatgatgctg caaaagcata tgctgaacaa     1440

ctcaaagaaa atggtgtgat taactacagt gtattagact tgacagcaga agaactagag     1500

gctatcaaac atcagcttaa tccaaaagat aatgatgtag agctt                     1545

 

<210>   2

<211>   515

<212>   PRT

<213>   人工

 

<400>   2

 

Met Asp Thr Thr His Asn Asp Thr Thr Pro Gln Arg Leu Met Ile Thr

             5                10                15

Asp Met Arg Pro Leu Ser Leu Glu Thr Ile Ile Ile Ser Leu Thr Arg

            20                 25               30

Asp Ile Ile Thr His Arg Phe Ile Tyr Leu Ile Asn His Glu Cys Ile

       35                  40                  45

Val Arg Lys Leu Asp Glu Arg Gln Ala Thr Phe Thr Phe Leu Val Asn

   50                   55                  60

Tyr Glu Met Lys Leu Leu His Lys Val Gly Ser Thr Lys Tyr Lys Lys

65                 70                  75                 80

Tyr Thr Glu Tyr Asn Thr Lys Tyr Gly Thr Phe Pro Met Pro Ile Phe

                85                  90                  95

Ile Asn His Asp Gly Phe Leu Glu Cys Ile Gly Ile Lys Pro Thr Lys

           100                  105               110

His Thr Pro Ile Ile Tyr Lys Tyr Asp Leu Asn Pro Met Ala Leu Ser

       115                  120                125

Lys Val Lys Leu Asn Asp Thr Leu Asn Lys Asp Gln Leu Leu Ser Ser

    130                 135                140

Ser Lys Tyr Thr Ile Gln Arg Ser Thr Gly Asp Ser Ile Asp Thr Pro

145                 150                  155               160

Asn Tyr Asp Val Gln Lys His Ile Asn Lys Leu Cys Gly Met Leu Leu

                165                 170                 175

Ile Thr Glu Asp Ala Asn His Lys Phe Thr Gly Leu Ile Gly Met Leu

            180                185                  190

Tyr Ala Met Ser Arg Leu Gly Arg Glu Asp Thr Ile Lys Ile Leu Arg

        195                  200                205

Asp Ala Gly Tyr His Val Lys Ala Asn Gly Val Asp Val Thr Thr His

   210                  215                220

Arg Gln Asp Ile Asn Gly Lys Glu Met Lys Phe Glu Val Leu Thr Leu

225                230              235                240

Ser Ser Leu Thr Thr Glu Ile Gln Ile Asn Ile Glu Ile Glu Ser Arg

                245                 250                 255

Lys Ser Tyr Lys Lys Met Leu Lys Glu Met Gly Glu Val Ala Pro Glu

           260                 265                 270

Tyr Arg His Asp Ser Pro Asp Cys Gly Met Ile Ile Leu Cys Ile Ala

       275                  280                 285    

Ala Leu Val Ile Thr Lys Leu Ala Ala Gly Asp Arg Ser Gly Leu Thr

    290                 295                 300

Ala Val Ile Arg Arg Ala Asn Asn Val Leu Lys Asn Glu Met Lys Arg

305                310                 315                 320

Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Lys Asp Ile Ala Asn Ser Phe Tyr Glu Val

                325                  330                335

Phe Glu Lys Tyr Pro His Phe Ile Asp Val Phe Val His Phe Gly Ile

           340                 345                350

Ala Gln Ser Ser Thr Arg Gly Gly Ser Arg Val Glu Gly Ile Phe Ala

       355                   360               365

Gly Leu Phe Met Asn Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Val Met Leu Arg Trp

   370                  375                380

Gly Val Leu Ala Lys Ser Val Lys Asn Ile Met Leu Gly His Ala Ser

385                 390                 395                 400

Val Gln Ala Glu Met Glu Gln Val Val Glu Val Tyr Glu Tyr Ala Gln

                405                 410                415

Lys Leu Gly Gly Glu Ala Gly Phe Tyr His Ile Leu Asn Asn Pro Lys

           420                 425                 430

Ala Ser Leu Leu Ser Leu Thr Gln Phe Pro His Phe Ser Ser Val Val

       435                  440                445

Leu Gly Asn Ala Ala Gly Leu Gly Ile Met Gly Glu Tyr Arg Gly Thr

    450                455                460

Pro Arg Asn Gln Asp Leu Tyr Asp Ala Ala Lys Ala Tyr Ala Glu Gln

465               470                 475                   480  

Leu Lys Glu Asn Gly Val Ile Asn Tyr Ser Val Leu Asp Leu Thr Ala

               485                  490                495

Glu Glu Leu Glu Ala Ile Lys His Gln Leu Asn Pro Lys Asp Asn Asp

           500                 505                510       

Val Glu Leu

      515   

 

Claims (10)

1.一种重组合胞病毒蛋白基因rRSV-58，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的一种重组合胞病毒蛋白基因rRSV-58的制备方法：

以合胞病毒培养物为模板，以引物P1和P2扩增合胞病毒基因组中第628位到第999位核苷酸片段，以引物P3和P4扩增第1140位到第2312位核苷酸片段；再以第一轮PCR扩增得到的两片段为模板，加入引物P1和P4，扩增rRSV-58片段；得到串联的目的基因重组片段rRSV-58；

P1：CGCGGATCCATGGACACACACAATGACACC；

P2： CTTGACTTTGCTAAGAGCCATTGGATTGAGATCATACTTGTATATTATGG；

P3：CCATAATATACAAGTATGATCTCAATCCAATGGCTCTTAGCAAAGTCAAG；

P4: CCGCTCGAGAAGCTCTACATCATTATCTTTTGG。

3.一种重组合胞病毒蛋白rRSV-58，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

4.一种重组合胞病毒蛋白的表达载体，它是在表达载体中***了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因rRSV-58。

5.根据权利要求4所述的一种重组合胞病毒蛋白的表达载体，其特征在于：所述的载体为pET-28a。

6.一种重组合胞病毒蛋白的工程菌，它是转染了权利要求4所述的一种合胞病毒蛋白的表达载体的大肠杆菌。

7.根据权利要求6所述的一种重组合胞病毒蛋白的工程菌，其特征在于：所述的大肠杆菌为BL21（DE3）。

8.权利要求3所述的一种重组合胞病毒蛋白中制备检测合胞病毒感染的试剂盒中的应用。

9.权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒为胶体金试剂盒。

10.权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的胶体金试剂盒包括：一种重组合胞病毒蛋白划线包被浓度为1.0 mg/mL，胶体金结合物喷点量为60.0 μL/cm²，兔抗合胞病毒抗体包被量为1.0 μL/cm，包被浓度为5.0 mg/mL。