CN104583229A - 肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本文公开了两亲性肽。还公开了治疗增殖性疾病、细菌感染、病毒感染和真菌感染、内毒素中和的方法,以及去除生物膜的方法。还公开了两亲性肽的应用。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年8月29日递交的新加坡专利申请第201206407-7号的优先权权益,其内容通过引用整体并入本文,用于所有目的。
技术领域
本发明总体上涉及抗微生物肽及其使用方法。
发明背景
尽管在过去100年中生活水平和生物医疗技术得到了显著改善,全球的传染性疾病负荷仍然非常高,并且是公共健康、经济和社会问题的主要诱因。根据世界卫生组织(WHO)统计,传染性疾病和寄生虫病如肺炎、结核病、脑膜炎、腹泻病、HIV和疟疾是全球范围内造成死亡的第二大主要诱因。抗生素在工业化国家的广泛和通常不加选择的使用加剧了这一问题,其促使抗药性病原体快速出现,使得传染性疾病越来越难以利用现有的抗生素类型进行控制。耐抗生素性传染病爆发的危机加上新的小分子抗生素开发的持续缺乏,激励了大量的努力来发现和开发具有膜活性的抗微生物肽(AMP)作为抗微生物剂的替代类型。天然存在的抗微生物肽,也称为“宿主防御肽”,最初被发现是先天免疫的组分,其形成了所有活的生物体中对抗入侵的病原体的第一道防线。不同于抑制特定生物合成途径如细胞壁或蛋白合成的常规抗生素,大部分的阳离子型抗微生物肽通过对带有更多负电荷的微生物膜脂双分子层进行物理破坏,以诱导细胞质成分泄露从而导致细胞死亡来发挥其活性。据信,膜破坏的物理特性能导致更低的抗药性发展可能性,因为微生物以与遭受损伤相同的速率进行突变或修复其膜成分在代谢上“更为昂贵”。
尽管在过去30年中已分离和定征了来自不同来源(包括微生物、植物和动物)的1700多种天然存在的抗微生物肽,当前临床上仅使用非常少的AMP,如多粘菌素和短杆菌肽;由于它们的高***毒性并且主要用于局部制剂。通过使用抗微生物肽作为药物而确定的主要挑战在于,合成长肽序列成本较高、稳定性不好和全身给药后的毒性未知。为了努力增加抗微生物活性并将非特异性毒性减至最小,更多的研究者开始越来越多地使用天然存在的抗微生物肽或蛋白序列作为模板以进行化学修饰,如环化、序列截短和以D-氨基酸、β-氨基酸或氟化的氨基酸进行取代,以用于生成具有更多的针对体内局部或全身感染的广泛应用的新的肽类似物。然而,当前优化天然存在的抗微生物肽序列的方法最多仍然为经验性为主,使得特别难以描绘总体的结构-活性关联,尤其是针对大序列和结构多样性的背景。此外,许多新的肽类似物仍然较长(20个氨基酸或更多),其可诱导显著的免疫原性,并最终增加大规模制备的成本。更重要的是,已表明使用具有与宿主防御抗微生物肽太过接近的序列的抗微生物肽可引起先天AMP耐受的发生,这可能会不可避免地危害对感染的天然防御,造成显著的健康和环境风险。
同时,医院和社区环境中快速出现耐抗生素的细菌和真菌在世界范围内已对医疗保健制度产生了明显的压力。虽然诸如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(Enterococci)(VRE)以及耐多药肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和不动杆菌(Acinetobacter spp.)的耐抗生素病原体的全球发生率已达到了传染病水平,进入临床开发渠道的新抗生素的数目不容乐观;自2000年仅3种新结构类型的抗生素进入市场,包括恶唑烷酮(利奈唑胺)、脂肽(达托霉素)和截短侧耳素(pleuromutilin)(瑞他帕林)。考虑到病原菌如金黄色葡萄球菌、肠杆菌(Enterobacter)和克雷伯氏菌正在发展对万古霉素和碳青霉烯的耐受性(其传统上被保留为作为住院的脆弱患者最终防御底线的强效抗生素),该发展尤其让人担忧。随着小分子抗生素开发的持续缺乏,设计和鉴定具有能有效克服耐药机制的新作用模式的可选类型的抗微生物剂相比以前更为紧迫。
由于大多数的抗微生物肽通过快速和直接的膜溶解机制来发挥其抗微生物活性,其在克服常规的抗生素抗性机制方面具有固有优势,如微生物膜上增加药物外排泵的表达、产生药物降解酶或改变针对靶向特定生物合成途径的小分子抗生素的微生物所获得的药物相互作用位点。然而,限制抗微生物肽的成功临床翻译的重要障障包括高***毒性,这是由于不良的微生物膜选择性、相对高的制造成本(对于长肽序列)和易于被生物液体如血清、伤口渗出液或泪液中存在的蛋白酶降解。
由于上述原因,需要提供可供选择的抗微生物肽。还需要提供可选的治疗微生物感染的方法。
发明概述
在一个方面,提供了两亲性肽。该肽包含(X1Y1X2Y2)n(式I),其中所述肽的C-末端被酰胺化;X1和X2彼此独立地为疏水性氨基酸;Y1和Y2彼此独立地为阳离子型氨基酸,并且其中n至少为1。
在另一方面,提供了本文所述的肽以用作药物。
在另一方面,提供了治疗细菌感染或去除细菌的方法。所述方法包括给予药学有效量的如本文所述的肽。
在另一方面,提供了中和内毒素的方法。所述方法包括给予药学有效量的如本文所述的肽。
在另一方面,提供了治疗基于病毒的传染性疾病的方法。所述方法包括给予药学有效量的如本文所述的肽。
在另一方面,提供了治疗真菌感染或侵扰,或者去除真菌的方法。所述方法包括给予药学有效量的如本文所述的肽。
在另一方面,提供了治疗增殖性疾病的方法。所述方法包括给予药学有效量的如本文所述的肽。
在另一方面,提供了本文所述的肽在制备用于治疗细菌感染,或者去除细菌,或者中和内毒素,或者治疗基于病毒的传染性疾病,或者治疗真菌感染或侵扰,或者去除真菌的药物中的用途。
附图说明
当结合非限制性实例和附图考虑时,参考详细描述将会更好地理解本发明,其中:
图1显示了合成的形成β-折叠的肽的设计特征。A)显示了本公开的示例性肽。B)显示了存在为线性分子的本公开的肽的实例。C)显示了由本公开的肽引起的可能的膜破坏的示意图。简而言之,在水溶液中,由于质子化的Arg和/或Lys残基之间的静电排斥,所述肽存在为单体的无规则卷曲。然而,在微生物细胞膜存在下,所述肽容易组装成β-折叠二级结构,其通过带正电荷的残基与带负电荷的磷脂之间的静电相互作用,然后将其疏水残基***至脂质双分子层中以介导膜破坏来稳定。
图2显示了于去离子水和25mM SDS胶束溶液中的(a)(VRVK)2-NH2(SEQ ID NO:11)、(b)(IRIR)2-NH2(SEQ ID NO:12)、(c)(IKIK)2-NH2(SEQID NO:13)、(d)(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)、(e)(IRVK)2-NH2(SEQ IDNO:14)、(f)(FRFK)2-NH2(SEQ ID NO:15)、(g)(VRVK)3-NH2(SEQ ID NO:20)、(h)(IRIK)3-NH2(SEQ ID NO:21)、(i)(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22)的圆二色谱。图2显示了本公开的肽如何在微生物膜模拟条件下(25mMSDS溶液)容易地自组装成β-折叠二级结构。
图3显示了合成的抗微生物肽的溶血活性。图3显示了本公开的肽针对处于不同的最小抑制浓度(MIC)值的大鼠红细胞诱导的最小溶血或无溶血。
图4显示了以不同浓度(即0、0.5×最小抑制浓度(MIC)、MIC和2×MIC)的代表性肽(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)处理后的存活微生物集落形成单位(CFU)的图示。图4显示本公开的肽处在MIC值和以上具有杀菌活力。
图5显示了以含有10%(体积)的水作为对照的液体培养基,以及用代表性肽(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22)处理2h的(a)大肠杆菌(Escherichia coli)和(b)金黄色葡萄球菌的FE-SEM图像。图5显示本公开的肽可造成大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的膜溶解。
图6显示了使用XTT检测测定的以不同浓度的(IRIK)2-NH2(SEQ IDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22)处理24h的生物膜中金黄色葡萄球菌的细胞活力。*P<0.01相对于(IRVK)3-NH2。图6显示本公开的肽显现出生物膜中存在的金黄色葡萄球菌的剂量依赖性杀伤。
图7显示了通过结晶紫染色测定的以不同浓度的(IRIK)2-NH2(SEQ IDNO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22)处理24h的预先形成的金黄色葡萄球菌生物膜的生物量变化。图7表明本公开的肽可用于去除生物膜。
图8显示了具有(a)2个重复单元(n=2)和(b)3个重复单元(n=3)的本公开的肽对FITC标记的LPS聚集体的稳定性的影响。图8表明本公开的肽可有效破坏脂多糖(LPS)聚集体。
图9显示了本公开的肽对NR8383大鼠巨噬细胞细胞系中LPS刺激的NO产生的抑制作用。图9表明本公开的肽可有效中和LPS的影响。
图10显示了以不同浓度的本公开的肽孵育18h后,NR8383大鼠巨噬细胞系的细胞活力。图10显示本公开的肽的抗炎性独立于其对细胞活力的影响,并且所述肽在抗微生物和抗炎活性所需的浓度下无毒。
图11显示了于微生物膜模拟条件(25mM SDS胶束溶液)下,(a)IK8对映体、(b)IK12对映体、(c)IK8立体异构体和(d)对照肽的圆二色谱。图11显示了本公开的肽容易在微生物膜模拟条件下自组装形成β-折叠二级结构。
图12显示了兔红细胞中(a)IK8立体异构体、(b)IK12对映体和(c)IK8非形成β-折叠的肽对照的溶血活性。图12显示本公开的肽的D-立体异构体在MIC值时显示最小的溶血或无溶血,其对微生物膜具有高选择性。
图13显示了以蛋白酶(a)胰蛋白酶和(b)蛋白酶K处理6h后,IK8-均为L和IK8-均为D针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的抗微生物活性。图13显示本公开的肽的所有D对映体均为耐蛋白酶的。
图14显示了以不同浓度(即,0、0.5×最小抑制浓度(MIC)、MIC和2×MIC)的IK8-均为D处理18h后,(a)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、(b)金黄色葡萄球菌、(c)大肠杆菌、(d)绿脓假单胞菌和(e)白色链珠菌(Candida albicans)的存活集落形成单位(CFU)图。对于每种微生物,所设计的肽在MIC和2×MIC值时实现了集落计数(>99.9%杀伤)的大于3个对数的减少,显示了杀菌作用机制。图14表明类似于L-对映体,本公开的肽的D-对映体具有杀菌机制。
图15显示了以含有10%(体积)HPLC水的125mg L-1的IK8-均为D和MHBII处理2h,(a)金黄色葡萄球菌和(b)绿脓假单胞菌的FE-SEM图。图15表明本公开的肽的D-对映体能造成金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌的膜溶解。
图16显示了暴露于亚最小抑制浓度(MIC)的IK8-均为D和各种临床用抗生素的(a)大肠杆菌和(b)金黄色葡萄球菌的耐药性发展概况。图16表明本公开的肽在测试的时间范围内不诱导任何耐药性发展。
图17显示了感染的小鼠巨噬细胞细胞系RAW264.7(MOI 10)中,由IK8-均为D介导的金黄色葡萄球菌的细胞内杀伤。图17表明本公开的肽针对感染的细胞中存在的细菌具有有效的抗微生物特性。
图18显示了于去离子水中的(a)IK8对映体、(b)IK8立体异构体、(c)IK12对映体和(d)对照肽的圆二色谱。图18表明在去离子水中,本公开的肽的对映体和立体异构体均保留为无规则卷曲,并且未采用任何二级结构。
图19显示了MALDI-TOF质谱,其显示了胰蛋白酶和蛋白酶K对(a)(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)和(b)(irik)2-NH2(SEQ ID NO:18)的蛋白水解活性。箭头指示主要的酶切割位点。图19显示与L-对映体相反,对本公开的D-对映体肽的蛋白酶处理未引起D-对映体肽的降解。
图20显示了以合成的抗微生物肽IK8-均为D处理18h后,(a)耐环丙沙星大肠杆菌和(b)耐庆大霉素大肠杆菌的最小抑制浓度(MIC)的测定。图20表明本公开的肽的D-对映体能够在与野生型(非耐药性)大肠杆菌相同的浓度下,抑制耐庆大霉素大肠杆菌和耐环丙沙星大肠杆菌。
图21显示了针对小鼠肺泡巨噬细胞RAW264.7和人胎儿肺成纤维细胞WI-38细胞系,IK8-均为D的细胞毒性研究。图21表明本公开的肽的D-对映体仅在远高于抗微生物浓度的浓度下有毒。
图22显示本公开的肽选择性杀伤癌细胞(HeLa),并且对非癌性的大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)和人表皮成纤维细胞系毒性更小。
附图说明
表1显示了本公开的肽的定征。
表2显示了本公开的肽的最小抑制浓度(MIC)和选择性指数。
表3显示了本公开的肽的设计和定征。
表4显示了本公开的肽的最小抑制浓度(MIC)和选择性指数。
表5显示了本公开的肽针对临床上分离的耐药性微生物的最小杀菌浓度(MBC)。
表6显示了本公开的肽针对临床上分离的结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)的最小抑制浓度(MIC)。
发明详述
与天然存在的肽序列具有最小相似性的短合成肽的设计和优化是对开发用于临床的安全和有效的抗微生物肽有用的策略。除了具有+2至+9的净电荷的阳离子特性以及由~30-50%的疏水性氨基残基组成外,不同的天然存在的和合成的抗微生物肽的一种共性在于:两亲性肽折叠形成二级结构,通常在与微生物膜接触后形成。在两种主要形式的折叠结构(包括α-螺旋肽(例如,Cathelicidin、天蚕素、蛙皮素)和β-折叠肽(例如,防御素和Protegrin))间,已发现两亲素β-折叠肽溶血性较小,同时具有与其同等电荷和疏水性的α-螺旋等同物相当的抗微生物活性。因此,本公开的目的是提供具有β-折叠结构的短合成肽,其具有抗微生物活性并且溶血性较小。
因此,在一个方面,提供了两亲性肽。在一个实例中,所述肽包含(X1Y1X2Y2)n(式I),其中X1和X2可单独地选自疏水性氨基酸;Y1和Y2可单独地选自阳离子型氨基酸;并且n可至少为1.5。在一个实例中,本公开的发明人基于来自天然存在的β-折叠AMP的几种基本设计原理设计了短合成β-折叠肽(其由短的重复(X1Y1X2Y2)n-NH2序列组成),所述设计原理包括但不限于:1)在跨膜β-折叠中两亲性二联体重复的普遍存在,2)需要疏水性残基(诸如但不限于Val、Ile、Phe和Trp)和阳离子型残基(诸如但不限于Arg和Lys),以与微生物细胞壁和细胞膜相互作用并将之扰乱,以及3)Val、Ile、Phe和Trp较强的β-折叠倾向(图1)。
如本文所用,术语“两亲性肽”是指具有亲水性和亲脂性的肽,所述亲水性和亲脂性由具有与疏水性氨基酸结合的阳离子型氨基酸的肽所赋予。如本文所用,术语“疏水性氨基酸”是指不溶于水的氨基酸残基。在一个实例中,术语“疏水性氨基酸”可包括但不限于:丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、蛋氨酸(M)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、组氨酸(H)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)和甘氨酸(G)。在一个实例中,疏水性氨基酸可为丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、蛋氨酸(M)、色氨酸(W)和半胱氨酸(C)。在一个实例中,疏水性氨基酸可为异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)。
如本文所用,术语“阳离子型氨基酸”是指溶于水的氨基酸残基。在一个实例中,阳离子型氨基酸可包括但不限于:精氨酸(R)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)。
在一个实例中,两亲性肽为分离的肽。如本文所用,术语“分离的”是指无或基本上无蛋白、脂质、核酸(例如,天然下与其结合的)的肽。
在一个实例中,两亲性肽可由(X1Y1X2Y2)n(式I)组成,其中X1和X2可彼此独立地为疏水性氨基酸;Y1和Y2可彼此独立地为阳离子型氨基酸。因此,X1和X2可为相同的或不同的氨基酸,并且Y1和Y2可为相同的或不同的氨基酸。
在本公开中,n可不为1,因为具有本文所述的4个氨基酸(例如X1Y1X2Y2(SEQ ID NO:1))的肽不具有抗微生物活性,并且在微生物膜环境中不形成β-折叠。因此,n可为约1.5-5。在一个实例中,n可为1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5。
在一个实例中,两亲性肽可包括但不限于:X1Y1X2Y2X3Y3(SEQ IDNO:2)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4(SEQ ID NO:3)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5(SEQ ID NO:4)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6(SEQ ID NO:5)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6X7Y7(SEQ ID NO:6)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6X7Y7X8Y8(SEQ ID NO:7)、X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6X7Y7X8Y8X9Y9(SEQ ID NO:8)和X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6X7Y7X8Y8X9Y9X10Y10(SEQ ID NO:9)。在一个实例中,X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7和X8可为相同的或各自不同的氨基酸,并且Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7和Y8可为相同的或各自不同的氨基酸。
在一个实例中,本公开的肽可具有被酰胺化的C-末端。术语“C-末端”根据其在本领域通常已知的定义在本文中使用,即,可与任何下述术语互换使用,如羧基端、羧基-端、C-端尾、C-端或COOH端,其指氨基酸链的末端,末端为游离羧基(-COOH)。如本文中所写的,本文所述的肽在右侧呈现为C-末端,而在左侧呈现为N-末端。因此,如本文所用,短语“C-末端被酰胺化”是指以伯胺或仲胺基团取代本公开的肽的C-末端羟基。在一个实例中,如本文所述的肽可为(X1Y1X2Y2)n,其可为(X1Y1X2Y2)n-NH2。在一个实例中,本公开的肽可通过本领域已知的方法酰胺化。不希望受理论的束缚,据信,C-端酰胺化增加抗微生物活性可能是由于阳离子特性的增强;针对本研究设计的肽在C-端被酰胺化以赋予高净正电荷。
本公开的肽不需要二级结构稳定剂。短语“二级结构稳定剂”是指这样的分子,其能够保持多肽的骨架原子的局部空间排列,而与其侧链的构象无关。如本文所用,二级结构稳定剂可包括但不限于:疏水作用、静电相互作用和化学交联,如多肽链之内和之间的二硫键或金属离子内部交联。在一个实例中,本公开的肽与本领域已知的现有β-折叠肽的不同之处在于,其不需要二硫键或其他共价键约束来稳定二级结构。在水溶液中,由于质子化的Arg和/或Lys残基之间的静电排斥,本公开的肽预期可作为单体存在。在微生物细胞膜存在下,本公开的肽容易折叠成二级β-折叠结构,该结构通过带正电荷的残基与带负电荷的磷脂之间的静电相互作用,然后将其疏水残基***脂质双分子层中来稳定。因此,在一个实例中,所述肽可能能够自组装成β-折叠结构。如本文所用,术语“自组装”是指这样类型的过程,其中预先存在的组分的无序体系在没有外部指导下,由于组分自身之间的特异性局部相互作用而形成有序结构或模式。在本公开中,所述肽在微生物膜环境中可自发形成β-折叠结构。如本文所用,短语“微生物膜环境”是指目标微生物的膜中的微环境。在一个实例中,该环境可通过阴离子型表面活性剂SDS的存在进行模拟。在一个实例中,所述肽在去离子水或水溶液中可能不会自发形成β-折叠结构。
如本文所用,“β-折叠”或“β-折叠片结构”是指肽的有规则的二级结构,其可包含至少一个β链,所述β链为多肽链的延伸,长度通常为3-10氨基酸,骨架为几乎完全延展的形式。在一个实例中,本发明的β-折叠结构由至少一个β-链组成。
此外,在一个实例中,形成β-折叠的序列中的阳离子和疏水性氨基酸的排列可发生改变。如表1和图11d中提供的实例中所示,形成β-折叠的序列中的阳离子和疏水性氨基酸的排列可引起二级结构的丢失。
在一个实例中,本公开的肽可包含:1)阳离子型氨基酸残基的选择(即,Arg相对于Lys,相对于二者的组合),2)疏水侧链的极性和庞大程度,以及3)肽序列的具体长度。在本公开中,***地研究了本公开的肽的各种可能的配置对抗微生物和溶血活性的影响。在一些实例中,发现相比包含Lys的肽,包含Arg的肽具有更强的抗微生物特性。不希望受到理论的束缚,据信,本公开中富含Arg的肽的较强抗微生物特性可能是由于胍基侧链的较大电荷密度。然而,在本领域通常相信,肽序列中多种精氨酸残基的存在与较高程度的溶血和细胞毒性有关。因此,在肽设计中掺入了Arg和Lys,以利用高电荷密度的Arg来改善抗微生物效应,同时使用较小毒性的Lys残基来调整合成肽的毒性。
同时,为了增加本公开的肽在生物液体中的稳定性,本公开的发明人研究了立体化学对合成肽的抗微生物活性的影响。因此,在一个实例中,提供了本公开的肽,其可具有的式I的每个重复单元n,可彼此独立地包含1、或2、或3、或4个D-氨基酸,其余氨基酸为L-氨基酸。在一个实例中,式I的重复单元n可彼此独立地包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个D-氨基酸,其余氨基酸为L-氨基酸。在一个实例中,式I的重复单元n可彼此独立地包含2、或4、或8个D-氨基酸,其余氨基酸为L-氨基酸。如本文所用,“L-氨基酸”和“D-氨基酸”是指可存在于每个氨基酸中的两种异构体。如本文所写,小写有下划线的残基代表D-氨基酸,而大写无下划线的残基代表L-氨基酸。“L-氨基酸”是指在细胞内产生并掺入至蛋白中的氨基酸异构体。“D-氨基酸”是指本公开的肽的氨基酸的异构体修饰。有利地,“D-氨基酸”不可被人和微生物蛋白酶识别。因此,如图13和19中所示,可防止本公开的肽在体内被早熟性蛋白水解降解。然而,如本公开的发明人所发现的,在4个位置的选择性D-氨基酸取代导致二级结构的完全丢失。因此,在一个实例中,式I的每个重复单元n可彼此独立地包含1或2个D-氨基酸,其余氨基酸为L-氨基酸。在一个实例中,在式I的每个重复单元n中D-氨基酸的分布可为相同的或彼此不同。在一个实例中,如本文所述的肽,其中n可为2,并且位置4和6的氨基酸可为D-氨基酸,而其余氨基酸为L-氨基酸。如“实验部分”所示,在位置4、6处的选择性D-氨基酸取代使得能够保留形成二级结构的倾向(参见图11c)。
在一个实例中,如本文所述的肽可包含或由序列(IY1IY2)n-NH2组成。在一个实例中,如本文所述的肽可包含或由序列(IRX2K)n-NH2组成。
在一个实例中,如本文所述的肽当表示为通式X1Y1X2Y2X3Y3(SEQID NO:2)时,可包括但不限于:irikir-NH2(SEQ ID NO:10),其中小写有下划线的残基代表D-氨基酸。在一个实例中,如本文所述的肽当表示为通式X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4(SEQ ID NO:3)时,可包括但不限于:VRVKVRVK-NH2(SEQ ID NO:11)、IRIRIRIR-NH2(SEQ ID NO:12)、IKIKIKIK-NH2(SEQ ID NO:13)、IRVKIRVK-NH2(SEQ ID NO:14)、FRFKFRFK-NH2(SEQ ID NO:15)、WRWKWRWK-NH2(SEQ ID NO:16)、IRIKIRIK-NH2(SEQ ID NO:17)、irikirik-NH2(SEQ ID NO:18)和IRIkIrIK-NH2(SEQ ID NO:19),其中小的有下划线的残基代表D-氨基酸,而大写无下划线的残基代表L-氨基酸。在一个实例中,如本文所述的肽当表示为通式X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5X6Y6(SEQ ID NO:5)时,可包括但不限于:VRVKVRVKVRVK-NH2(SEQ ID NO:20)、IRIKIRIKIRIK-NH2(SEQ ID NO:21)、IRVKIRVKIRVK-NH2(SEQ ID NO:22)和irvkirvkirvk-NH2(SEQ ID NO:23),其中小写有下划线的残基代表D-氨基酸,而大写无下划线的残基代表L-氨基酸。在一个实例中,如本文所述的肽可选自:VRVKVRVK-NH2(SEQ ID NO:11)、VRVKVRVKVRVK-NH2(SEQ ID NO:20)、IRIRIRIR-NH2(SEQ ID NO:12)、IKIKIKIK-NH2(SEQ IDNO:13)、IRVKIRVK-NH2(SEQ ID NO:14)、FRFKFRFK-NH2(SEQ ID NO:15)、WRWKWRWK-NH2(SEQ ID NO:16)、IRIKIRIK-NH2(SEQ ID NO:17)、IRIKIRIKIRIK-NH2(SEQ ID NO:21)、irikir-NH2(SEQ ID NO:10)、irikirik-NH2(SEQ ID NO:18)、IRIkIrIK-NH2(SEQ ID NO:19)、IRVKIRVKIRVK-NH2(SEQ ID NO:22)和irvkirvkirvk-NH2(SEQ ID NO:23),其中小写有下划线的残基代表D-氨基酸,而大写无下划线的残基代表L-氨基酸。
还提供了用作药物的本公开的肽。
在另一方面,提供了治疗微生物感染或去除微生物的方法,包括给予药学有效量的本公开的肽。术语“治疗(treat/treatment)”及其语法变型是指治疗性治疗和预防性或防御性方法,其中目的是防止或减缓(减轻)不期望的生理病况、病症或疾病,或者获得有利的或期望的临床结果。此类有利或期望的临床结果包括但不限于:症状减轻、病况、病症或疾病程度减小;病况、病症或疾病状态稳定(即,不恶化);病况、病症或疾病进展延迟或减缓;病况、病症或疾病状态的改善;缓解(不论是部分的或总体的),不管是可检测的或不可检测的;或者病况、病症或疾病的促进或改善。治疗包括引起临床上显著但无过高水平副作用的细胞反应。治疗还包括,相比不接受治疗时预期的存活,延长存活。
如本文所用,术语“微生物(microbes/microorganism)”以其最广义的含义使用,并因此不限于原核生物范围。相反,术语“微生物(microorganism)”的范围包括细菌、古生菌、病毒、酵母、真菌、原生动物和藻类。在一个实例中,提供了治疗细菌感染或去除细菌的方法,包括给予药学有效量的本公开的肽。
在一个实例中,细菌可为革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。因此,可被治疗的细菌感染包括但不限于由来自以下属的细菌引起的感染:醋酸杆菌(Acetobacter)、不动杆菌(Acinetobacter)、放线菌(Actinomyces)、农杆菌(Agrobacterium spp.)、根瘤菌(Azorhizobium)、固氮菌(Azotobacter)、无形体(Anaplasma spp.)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)、拟杆菌(Bacteroides spp.)、巴尔通体(Bartonella spp.)、博德特氏菌(Bordetella spp.)、包柔氏螺旋体(Borrelia)、布鲁氏菌(Brucella spp.)、伯克霍尔德菌(Burkholderia spp.)、鞘杆菌(Calymmatobacterium)、弯曲杆菌(Campylobacter)、衣原体(Chlamydia spp.)、嗜衣原体(Chlamydophila spp.)、梭菌(Clostridium spp.)、棒状杆菌(Corynebacterium spp.)、柯克斯体(Coxiella)、埃立克体(Ehrlichia)、肠杆菌(Enterobacter)、肠球菌(Enterococcus spp.)、埃希氏菌(Escherichia)、弗朗西斯氏菌(Francisella)、梭杆菌(Fusobacterium)、加德纳菌(Gardnerella)、嗜血杆菌(Haemophilus spp.)、螺杆菌(Helicobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、乳杆菌(Lactobacillus spp.)、乳球菌(Lactococcus)、军团杆菌(Legionella)、李斯特菌(Listeria)、Methanobacterium extroquens、多形微杆菌(Microbacterium multiforme)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、分枝杆菌(Mycobacterium spp.)、支原体(Mycoplasma spp.)、奈瑟菌(Neisseria spp.)、巴氏杆菌(Pasteurella spp.)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、卟啉单胞菌(Porphyromonas)、假单胞菌(Pseudomonas)、根瘤菌(Rhizobium)、立克次氏体(Rickettsia spp.)、罗卡利马体(Rochalimaea spp.)、罗氏菌(Rothia)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、沙雷氏菌(Serratia)、志贺氏菌(Shigella)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、链球菌(Streptococcus spp.)、密螺旋体(Treponema spp.)、弧菌(Vibrio spp.)、沃尔巴克氏体(Wolbachia)和耶尔森氏菌(Yersinia spp)。在一个实例中,细菌可包括但不限于:橙黄醋酸杆菌(Acetobacter aurantius)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、衣氏放线菌(Actinomyces Israelii)、放射状土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)、维氏固氮菌(Azotobacter vinelandii)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、边缘无浆体(Anaplasma marginale)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、纺锤芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、牙龈拟杆菌(Bacteroides gingivalis)、Bacteroides melaminogenicus(Prevotellamelaminogenica)、汉赛巴尔通体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通体(Bartonella Quintana)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)复合体、新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)、肉芽肿荚膜杆菌(Calymmatobacterium granulomatis)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、嗜衣原体(Chlamydophila.)(如肺炎嗜衣原体(C.pneumoniae)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci))、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani))、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、梭形棒状杆菌(Corynebacterium fusiforme)、贝氏柯克斯体(Coxiella bumetii)、查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus galllinarum)、Enterococcus maloratus、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、***加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、百日咳嗜血杆菌(Haemophilus pertussis)、***嗜血杆菌(Haemophilus vaginalis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜肺军团杆菌(Legionella pneumophila)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、Methanobacterium extroquens、多形微杆菌(Microbacterium multiforme)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、白喉分枝杆菌(Mycobacteriumdiphtheriae)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、鼠麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepraemurium)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、耻垢分枝杆茵(Mycobacteriumsmegmatis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、生殖支原体(Mycoplasma genitalium)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、穿通支原体(Mycoplasma penetrans)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、土拉巴斯德氏菌(Pasteurella tularensis)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、放射状根瘤菌(Rhizobium Radiobacter)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、鹦鹉热立克次氏体(Rickettsia psittaci)、五日热立克次氏体(Rickettsia Quintana)、立克次氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)、沙眼立克次体(Rickettsia trachomae)、亨氏罗卡利马氏体(Rochalimaeahenselae)、五日热罗卡利马氏体(Rochalimaea Quintana)、龋齿罗氏菌(Rothia dentocariosa)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、志贺氏痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、鸟链球菌(Streptococcus.Avium)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、仓鼠链球菌(Streptococcus cricetus)、屎链球菌(Streptococcus faceium)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、野鼠链球菌(Streptococcus ferus)、鹑鸡链球菌(Streptococcus gallinarum)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、草绿色链球菌(Streptococcus mitior)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大鼠链球菌(Streptococcus rattus)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、逗号弧菌(Vibriocomma)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、沃尔巴克氏体(Wolbachia)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)和假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)。在一个实例中,细菌可包括但不限于:大肠杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和结核分枝杆菌。
在一个实例中,细菌感染可引起以下病症,诸如但不限于:肺炎、结核病、脑膜炎、腹泻性疾病、生物膜形成、脓毒症、李斯特菌病、肠胃炎、中毒性休克综合症、出血性结肠炎;溶血性尿毒综合症、莱姆病、胃溃疡和十二指肠溃疡、人埃立克体病、伪膜性结肠炎、霍乱、沙门氏菌病、猫抓热、坏死性筋膜炎(GAS)、链球菌中毒性休克综合症、医院和社区相关的感染、动脉粥样硬化、婴儿瘁死综合症(SIDS)、耳部感染、呼吸道感染、***、皮肤及软组织感染、甲床感染、伤口感染、败血症、胃肠疾病、医院获得性心内膜炎和血流感染。在一个实例中,所述细菌可为耐药性细菌。
脓毒症是指全球范围内特护病房中的主要死亡原因,其由从革兰氏阴性细菌的外壁释放脂多糖分子而引起。当前,除了经静脉内给予广谱抗生素外,仅提供支持疗法来预防败血性休克综合症的加剧,而无针对微生物内毒素的有效治疗,所述微生物内毒素为免疫反应的有害调节物。多粘菌素B是内毒素结合及中和的“金”标准,然而,其高细胞毒性否定了其用于***性应用的实用性。因此,需要提供可同时消灭致病微生物并中和内毒素,而对哺乳动物细胞无细胞毒性的替代性抗微生物剂。因此,在一个实例中,本公开的肽可用于预防脓毒症。
脂多糖(LPS)内毒素具有强力的免疫刺激活性,其为革兰氏阴性细菌的外膜片层(leaflet)的完整结构组分。LPS在微生物细胞生长和***期间不断流出,并且在细胞死亡(通常是由于针对细菌感染的抗生素治疗而引起)期间大量释放。在释放至血流中后,LPS聚集体被结合LPS的血浆蛋白(LBPs)解离而形成LPS-LBP复合物,其刺激宿主单核细胞和巨噬细胞分泌不同的细胞因子(例如,TNF-α、IL-6、IL-8)和促炎性介导物(例如,NO和活性氧物质)。该先天免疫***的活化引起级联放大的免疫反应,造成严重的称为败血性休克的临床症状,其可快速地转变为多器官衰竭,或者如果不治疗则死亡。阴离子型两亲性脂质A结构域在多数革兰氏阴性细菌属中为结构保守的,其被认为是LPS的活性部分。本公开的发明人证明,通过阳离子型赖氨酸或精氨酸残基与阴离子型头基的静电相互作用而结合并中和LPS,以及通过LPS的烷基链与非极性氨基酸侧链之间的疏水相互作用而解离LPS聚集体,如本文所述的阳离子型抗微生物肽两亲分子提供了特别有用的候选物。在一个实例中,提供了中和内毒素的方法,包括给予药学有效量的本公开的肽。在一个实例中,内毒素可为细菌内毒素或真菌内毒素。在一个实例中,内毒素可为多糖、脂磷壁酸、脂多糖或脂寡糖。图9表明,本公开的肽可有效降低LPS对巨噬细胞的影响。
细菌可对人造成的另一个问题是形成生物膜。生物膜的形成是涉及各种医学领域和非医学领域的重大问题。在微生物细胞彼此粘合并嵌入表面上的细胞外多聚物(EPS)基质中时发生生物膜形成。微生物在这样的富含生物大分子(例如,多糖、核酸和蛋白)和营养物质的受保护环境中的生长,允许增加的微生物串扰(cross-talk)和增加的毒力。因此,已经广泛地描述了包埋于生物膜中的微生物的生理和表型改变,特别是生长速率和基因转录模式。据信,抗生素不能穿过细胞外聚合物,和/或抗生素被细胞外聚合物的组分失活,是造成常规剂量抗生素对抑制或杀伤生物膜微生物无效的原因。该现象加上耐药性基因的上调,常常导致生物膜中快速发展出抗生素抗性,使得其成功消除成为医疗环境中的巨大挑战。因此,需要提供去除生物膜的方法。
鉴于以上原因,在另一方面,提供了去除生物膜的方法,包括给予药学有效量的本公开的肽。在一个实例中,生物膜可存在于表面上。本文所用的术语“表面”是指任何医学或工业表面,其提供了流体如液体或气体以及固体之间的界面。流体和固体之间的界面可为间歇性的,并且可由流动的或停止的流体、气溶胶或用于经空气的流体暴露的其他方式引起。在一些实例中,表面是指这样的平面,其机械结构与细菌或真菌的粘合相容。在本文所述的肽和方法的上下文中,术语“表面”包括各种一次性的和非一次性的、医疗的和非医疗的仪器和装置的内面和外面。非医疗应用的实例包括:船的船体、造船厂、食物加工器、混合器、机器、容器、水槽、滤水器、纯化***、食品行业中的防腐剂、个人护理用品如洗发水、面霜、润肤膏、洗手液、肥皂等。医疗应用的实例包括医疗器械的整个范围。此类“表面”可包括不同仪器和器械的内面和外面,不管所述仪器和器械为一次性的或用于重复使用。实例包括用于医疗应用的物品的整个范围,包括:解剖刀、针、剪刀和用于侵入性手术、治疗或诊断程序的其他器械;植入式医疗器具,包括人工血管、导管和其他用于至患者的流体去除或递送的器具、人工心脏、人工肾、整形外科针、盘和移植物;导管和其他管(包括泌尿管和胆管、气管内管、外周可***式中心静脉导管、透析管、长期隧道式中心静脉导管、外周静脉导管、短期中心静脉导管、动脉导管、肺导管、气囊漂浮导管、泌尿导管、腹膜导管)、泌尿器具(包括长期泌尿器具、结合组织的泌尿器具、人工泌尿***、泌尿扩张器)、分流器(包括心室或动脉-静脉分流器);假体(包括***填充物、***假体、血管移植物假体、心脏瓣膜、人造关节、人工喉、耳移植物)、血管导管口、伤口引流管、脑积水分流器、起搏器和可植入除颤器、牙种植体、填料、假牙等。其他实例对这些领域的参与者容易显而易见。医疗环境中发现的表面还包括:医疗保健行业人员穿戴或携带的医疗装备零件、医疗装置的内面和外面。这类表面可包括用于医疗程序或准备用于呼吸道治疗的医疗器械、管子和容器的区域中的案台和固定装置,所述呼吸道治疗包括应用氧气、于喷雾器中的溶解的药物和麻醉剂。还包括预期在医疗环境中作为传染性微生物的生物屏障如手套、围裙和面罩的那些表面。常用的用于生物屏障的材料可为基于乳胶的或非基于乳胶的。用于非基于乳胶的生物屏障材料的实例可包括乙烯基塑料。其他的这类表面可包括用于不打算进行灭菌的医疗或牙科设备的手柄和电缆。另外,这类表面可包括管子和其他设备的那些未经灭菌的外表面,所述管子和其他设备发现于其中通常会遇到血液或体液或其他有害生物材料的区域中。在一个实例中,生物膜可包含于导管和医学移植物上。
在另一方面,提供了治疗病毒传染性疾病的方法,包括给予药学有效量的本公开的肽。在一个实例中,病毒传染性疾病可由病毒引起,包括但不限于由以下病毒引起的传染病或传染性疾病:腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、细小病毒、呼肠科病毒、小核糖核酸病毒、囊膜病毒、正粘液病毒、弹状病毒、副粘液病毒、***瘤病毒、逆转录病毒(如人免疫缺陷病毒)和嗜肝病毒。在一个实例中,病毒传染性疾病可包括但不限于:普通感冒、流感、水痘、唇疱疹、埃博拉、AIDS、禽流感、SARS、登革热、疱疹、带状疱疹、麻疹、腮腺炎、风疹、狂犬病、人***瘤病毒、病毒性肝炎、柯萨奇病毒、爱泼斯坦巴尔病毒等。
在另一方面,提供了治疗真菌感染或侵扰,或去除真菌的方法,包括给予药学有效量的本公开的肽。如本文所用,术语“真菌”(及其衍生词,如“真菌感染”)包括但不限于,提及以下属的生物体(或生物体导致的感染):犁头霉菌(Absidia)、阿耶罗菌(Ajellomyces)、节皮菌(Arthroderma)、曲霉菌(Aspergillus)、芽生菌(Blastomyces)、假丝酵母(Candida)、孢瓶霉(Cladophialophora)、球孢子菌(Coccidioides)、隐球菌(Cryptococcus)、小克银汉霉(Cunninghamella)、表皮癣菌(Epidermophyton)、外瓶霉(Exophiala)、线黑粉菌(Filobasidiella)、着色真菌(Fonsecaea)、镰刀菌(Fusarium)、地霉(Geotrichum)、组织胞浆菌(Histoplasma)、Hortaea、Issatschenkia、马杜拉分枝菌(Madurella)、马拉色菌(Malassezia)、小孢子菌(Microsporum)、微孢子虫(Microsporidia)、毛霉菌(Mucor)、丛赤壳菌(Nectria)、拟青霉(Paecilomyces)、副球孢子菌(Paracoccidioides)、青霉菌(Penicillium)、毕赤酵母(Pichia)、肺囊虫(Pneumocystis)、假阿利什菌(Pseudallescheria)、根霉(Rhizopus)、红酵母菌(Rhodotorula)、赛多孢子菌(Scedosporium)、裂褶菌(Schizophyllum)、孢子丝菌(Sporothrix)、毛癣菌(Trichophyton)和毛孢子菌(Trichosporon)。例如,由以下物种造成的真菌感染,诸如但不限于:伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、荚膜阿耶罗菌(Ajellomyces capsulatus)、皮炎芽生菌(Ajellomyces dermatitidis)、苯海姆节皮菌(Arthroderma benhamiae)、粉节皮菌(Arthroderma fulvum)、石膏样节皮菌(Arthroderma gypseum)、内弯节皮菌(Arthroderma incurvatum)、太田节皮菌(Arthroderma otae)和万博节皮菌(Arthroderma vanbreuseghemii)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和黑曲霉(Aspergillus niger)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、吉利蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、克柔假丝酵母(Candida krusei)、***滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和菌膜假丝酵母(Candida pelliculosa)、Cladophialophora carrionii、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和Coccidioides posadasii、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、小克银汉霉(Cunninghamella sp.)、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)、皮炎外瓶霉(Exophiala dermatitidis)、新型线黑粉菌(Filobasidiella neoformans)、裴氏着色真菌(Fonsecaea pedrosoi)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、白地霉(Geotrichum candidum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、威尼克外瓶霉(Hortaea werneckii)、东方伊萨酵母(Issatschenkia orientalis)、灰色马杜拉菌(Madurella grisae)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)、球形马拉色菌(Malassezia globosa)、钝形马拉色菌(Malassezia obtusa)、厚皮马拉色菌(Malassezia pachydermatis)、限制性马拉色菌(Malassezia restricta)、斯洛菲马拉色菌(Malassezia slooffiae)、合轴马拉色菌(Malassezia sympodialis)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、粉小孢子菌(Microsporum fulvum)、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)、微孢子虫(Microsporidia)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、红球丛赤壳(Nectria haematococca)、宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)、耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jiroveci)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、波氏假阿利什菌(Pseudallescheria boydii)、米根霉(Rhizopus oryzae)、深红酵母(Rhodotorula rubra)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)、裂褶菌(Schizophyllum commune)、申克孢子丝菌(Sporothnx schenckii)、须毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)和紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)和阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)、皮毛孢子菌(Trichosporon cutaneum)、墨汁毛孢子菌(Trichosporon inkin)和粘状毛孢子菌(Trichosporon mucoides)。在一个实例中,如本文所述的真菌感染可由白色假丝酵母引起。在一个实例中,真菌感染可由耐药性真菌引起。如本文所述的用于抑制、治疗或去除真菌的肽的示例性应用提供在表2和表4中。
本文中所用的术语“降低”、“减少的”、“减少”、“降低”、“去除”或“抑制”通常是指统计学上显著的量的降低。然而,为了避免歧义,“减少的”、“减少”或“降低”、“去除”或“抑制”是指相比参照水平至少10%的降低,例如降低至少约20%,或至少约30%,或至少约40%,或至少约50%,或至少约60%,或至少约70%,或至少约80%,或至少约90%、或多达并且包括100%的降低(例如,相比参照样品无水平),或者相比参照水平(例如,无本文所述的肽)10-100%间的任何降低。
本公开的发明人还发现如本文所述的肽可诱导癌细胞系的细胞死亡。因此,在另一方面,提供了治疗增殖性疾病的方法,其可包括给予药学有效量的如本文所述的肽。在一个实例中,增殖性疾病可包括但不限于:肿瘤、癌症、恶性肿瘤或以上疾病的组合。在一个实例中,增殖性疾病可包括但不限于:结肠直肠癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、***肉瘤、***-内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、头颈鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、肝转移、胆管癌、绒毛膜癌、***瘤、胚胎性癌、甲状腺癌如甲状腺未分化癌、肾母细胞瘤、***、睾丸肿瘤、肺癌、肺小细胞癌、肺非小细胞癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。如本文所述的用于诱导癌细胞死亡的肽的示例性应用提供在图22中。
在另一方面,提供了本公开的肽在制备用于治疗细菌感染,或去除细菌,或中和内毒素,或治疗基于病毒的传染性疾病,或治疗真菌感染或侵扰,或去除真菌,或治疗增殖性疾病的药物中的用途。在一个实例中,所述用途可进一步包括提供本公开的肽用于给予至有需要的对象。在一个实例中,其中所述药物待给予至有需要的对象。
在一个实例中,所述对象或患者可为动物、哺乳动物、人,包括但不限于动物,可分类为牛、猪、马、犬、狼、猫、鼠、绵羊、鸟、鱼、山羊、乌鸦、acrine或翠雀(delphine)。在一个实例中,患者可为人。
在一个实例中,如本文所述的肽可提供为组合物或药物组合物。如本文所述的组合物可以多种方式给药,这取决于是否需要局部或***的治疗。给药可为局部的、肺部的(例如,通过吸入或吹入粉末或气溶胶,包括通过喷雾器;气管内、鼻内、表皮和透皮)或***的,如经口和/或肠胃外。肠胃外给药包括:静脉内、动脉内、皮下、覆膜内或肌肉内注射或输注;或颅内,例如,鞘内或心室内给药。在一个实例中,给药途径可选自:***性给药、经口给药、静脉内给药和肠胃外给药。
用于经口给药的组合物和制剂,包括粉剂或颗粒、于水或非水介质中的悬浮液或溶液剂、胶囊、小袋或片剂。增稠剂、风味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂,可能是可取的。
用于肠胃外、鞘内或心室内给药的组合物和制剂可包括无菌水溶液,其也可包含缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂,诸如但不限于:渗透促进剂、载体化合物和其他药学可接受的载体或赋形剂。
如本文所述的组合物包括但不限于:溶液、糊剂、药膏、霜剂、水凝胶、乳剂、包含脂质体的制剂和包衣。这些组合物可产生自多种组分,包括但不限于:预成型的液体、自乳化的固体和自乳化的半固体。
可根据制药行业熟知的常规技术制备本文所述的制剂,其可方便地以单位剂量的形式存在。此类技术包括将活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。一般通过如下方式制备所述制剂:均匀且紧密地将将活性成分与液体载体或固体载体粉末或二者结合,然后(如有必要),将产品成型。
可将本文所述的组合物配制成许多可能的剂型中的任一种,包括但不限于:片剂、胶囊、液体糖浆剂、软凝胶、栓剂和灌肠剂。可将本文所述的组合物配制成于水性、非水性或混合介质中的悬浮剂。水性悬浮剂还可包含能增加所述悬浮剂粘度的物质,包括例如,羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡萄糖。所述悬浮剂还可包含稳定剂。
在一个实例中,可将所述药物组合物配制并用作泡沫。药物泡沫包括制剂,诸如但不限于:乳剂、微乳剂、霜剂、凝胶剂和脂质体。虽然在性质上基本类似,这些制剂在组分和最终产品的一致性上不同。
如本文所述的组合物还可包含在药物组合物中常规可见的其他辅助组分。因此,例如,所述组分可包含另外的、兼容的、药学上有活性的物质,例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂,或者可包含用于物理配制本发明的各种剂型的组合物的另外材料,如染料、风味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而,在加入此类材料时,不应当过度干扰本公开的组合物组分的生物活性。所述制剂可为无菌的,并且在需要时,可与不有害地干扰所述制剂的肽的助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、风味剂和/或芳香物质等混合。
如本文所用的术语“药学上有效的量”的含义包括足够但无毒的量的本文所述的化合物,其用于提供所需的效应,即造成微生物数目的至少1.0的对数减少,这意味着10个微生物中留下小于1个。本公开的修饰的肽可提供微生物数目的至少约2.0,或至少约3.0,或至少约4.0,或至少约5.0,或至少约6.0,或至少约7.0的对数减少。所需的准确的量根据对象不同而不同,这取决于诸如治疗的物种、对象的年龄和总体状况、治疗的病况的严重性、给予的具体试剂、给药方式等因素。因此,不可能规定准确的“有效量”。然而,对于任何给定的情况,本领域技术人员仅使用常规实验即可确定合适的“有效量”。
剂量取决于待治疗的疾病状态的严重性和响应性,治疗过程可持续几天至几个月,或者直到产生治愈或实现疾病状态的减轻。可从患者身体中积累的药物的测量来计算最佳的给药方案。给药医生可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复频率。最佳的剂量可基于组合物的相对功效而变化,并且通常可基于在体外和体内动物模型发现有效的EC50或基于本文所述的实例进行估计。一般而言,剂量为0.01μg/kg体重至100g/kg体重,并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次。治疗医生可基于测得的体液或组织中的药物残留时间和浓度,估计给药的重复频率。在成功治疗后,可取的是使对象接受维持治疗以防止疾病状态的复发,其中所述组合物以维持剂量给药,范围为0.01μg/kg体重至100g/kg体重,每天一次或多次至每2年一次。
在一个实例中,所述组合物可以以每kg患者体重约0.01μg、0.05μg、0.1μg、0.5μg、1μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、210μg、220μg、230μg、240μg、250μg、260μg、270μg、280μg、290μg、500μg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg中的任一剂量至约0.01μg、0.05μg、0.1μg、0.5μg、1μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、210μg、220μg、230μg、240μg、250μg、260μg、270μg、280μg、290μg、500μg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、300mg中的任一剂量之间的量给药。
在一个实例中,给予的组合物的浓度为约1mg/kg至约100mg/kg患者体重、约5mg/kg至约100mg/Kg患者体重、约10mg/kg至约100mg/kg患者体重、约20mg/kg至约100mg/Kg患者体重、约30mg/kg至约100mg/kg患者体重、约1mg/kg至约50mg/kg患者体重、约5mg/kg至约50mg/kg患者体重和约10mg/kg至约50mg/kg患者体重。
如本文所用,在制剂的组分的量或浓度的上下文中,术语“约”通常是指+/-5%的所述值,更通常为+/-4%的所述值,更通常为+/-3%的所述值,更通常为+/-2%的所述值,甚至更通常为+/-1%的所述值,并且甚至更通常为+/-0.5%的所述值。
说明性地描述的本文发明可在无本文中未具体公开的任何元素、限制存在下恰当地实施。因此,例如,术语“包含(comprising)”、“包括(including)”、“含有(containing)”等应当广义且无限制地解读。另外,本文所用的术语和表述被用作描述性且非限制性的术语,并且不试图使用这类术语和表述排除本文显示和描述的特征或其部分的任何等同物,但应理解在所要求保护的本发明的范围内的各种修改是可能的。因此,应理解尽管通过优选的实施方案和最佳的特征具体公开了本发明,但本领域技术人员可采用本文公开并体现于其中的本发明的修改和变化,并且此类修改和变化被认为位于本发明的范围内。
如本文所用,术语“基本上由…组成”是指给出的实例所需的那些元素。该术语允许存在另外的元素,其不实质上影响本发明的实例的基本特性和新颖性或功能特性。
如本文所述的术语“由…组成”是指组合物、方法及其各自的组分,其不包括给出的实例中未叙述的任何元素。
在本文中广泛地并且整体上描述了本发明。落入整体公开中的每个较窄的物种和亚属组群也形成了本发明的一部分。这包括本发明的具有从该属中去除任何主题(subject matter)的附带条件或负面(negative)限制的整体描述,而不论所去除的材料在本文中是否有具体描述。
其他实施方案也在所附的权利要求和非限制性实例中。另外,当根据马库什群组(Markush group)来描述本发明的特征或方面时,本领域技术人员应理解本发明也由此根据马库什群组的任何单个成员或成员的亚组来进行描述。
实验部分
实施例1 研究本公开的肽(L-肽)的抗微生物性能
材料
本研究中使用的肽由GL Biochem(中国上海)合成,并使用分析型反相(RP)-HPLC纯化至大于95%。采用α-氰基-4-羟基肉桂酸(4-HCCA)作为基质,使用基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS,Model Autoflex II,Bruker Daltonics Inc.,美国)进一步确认所述肽的分子量。4-HCCA购自Sigma-Aldrich(新加坡),并在重新结晶后于饱和的乙腈/水(1:1体积比)中使用。磷酸盐缓冲盐水(10×PBS)购自1st Base(新加坡),并在使用前稀释至所需浓度。Mueller-Hinton液体培养基II(MHB II)和酵母霉菌液体培养基(YMB)粉末购自BD Diagnostics(新加坡),并根据厂商说明书重新构建。表皮葡萄球菌(ATCCNo.12228)、金黄色葡萄球菌(ATCCNo.29737)、大肠杆菌(ATCCNo.25922)、绿脓假单胞菌(ATCCNo.9027)和酵母白色假丝酵母(ATCCNo.10231)购自ATCC(美国),并根据推荐的方案孵育。来自大肠杆菌0111:B4的脂多糖(LPS)和FITC-缀合的LPS购自Sigma-Aldrich。格里斯(Griess)试剂***购自Promega(美国),并根据厂商的方案使用。
圆二色谱(CD)光谱
首先将每种肽以0.5mg mL-1浓度溶解于单独的去离子(DI)水或含有25mM SDS表面活性剂的去离子水中。使用具有1.0mm光程长的石英小室,在室温下用CD分光偏振计(JASCO Corp.J-810)记录CD光谱。以10nm/min的扫描速率,使用190-240nm的溶剂差减获得CD光谱,并从每个肽样品的5次运行进行平均。使用以下方程式将获得的CD光谱转化为平均残基椭圆率:
其中θM是指平均残基椭圆率(deg·cm2·dmol-1),θobs是在给定波长(mdeg)校正了去离子水的观察椭圆率,MRW是残基分子量(Mw/氨基酸残基数),c是肽浓度(mg·mL-1),并且l是光程长(cm)。
溶血测试
用PBS将新鲜的大鼠红细胞稀释25×,以获得约4%(体积)的悬液来用于本实验。将300μL的红细胞悬液添加至含有等体积(300μL)于PBS中的肽溶液的每个管中。将所述管子在37℃孵育1h,然后在1000×g下离心5min。将小份(100μL)的上清液转移至96孔板的每个孔中,并使用微量板读取仪(TECAN,Switzerland)在576nm下针对血红蛋白释放进行分析。将用PBS孵育的红细胞悬液作为阴性对照。将用0.1%v/v TritonX-100溶解的红细胞的吸光度作为阳性对照,并看作是100%溶血。使用下式计算溶血百分比:溶血(%)=[(处理样品的O.D.576nm-阴性对照的O.D.576nm)/(阳性对照的O.D.576nm-阴性对照的O.D.576nm)]×100。数据表示为4个重复的均值±标准偏差。
最小抑制浓度(MIC)测量
使用液体培养基微量稀释法,针对革兰氏阳性表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性大肠杆菌和绿脓假单胞菌,以及酵母菌白色假丝酵母研究了聚合物的抗微生物活性。于37℃将细菌细胞在MHBII中孵育,并在室温、300rpm的恒定震荡下将酵母细胞培养在YMB中,至达到中期-对数生长期。用合适的液体培养基稀释微生物悬液,并进行调整以在微孔板读取仪(TECAN,Switzerland)上给出600nm波长下约0.07的起始光密度(O.D.)读数,其对应于麦氏(McFarland)比浊标准数1(约3×108CFU mL-1)。将肽溶解于0.2μm过滤的HPLC级水中,并使用合适的液体培养基进行一系列的2倍稀释。将具有3×105CFU mL-1的初始加载水平的100μL微生物悬液添加至等体积(100μL)的肽溶液中,以获得3.9-500mgL-1的终浓度,并且96孔板的每个孔中的水浓度固定在10%(体积)。分别将细菌和酵母在37℃或室温震荡孵育18h或42h后,MIC被视为肉眼观察不到微生物生长,并且从0h起O.D.读数没有变化的最低聚合物浓度。将含有10%(体积)的HPLC级水的液体培养基以及仅纯液体培养基中的微生物细胞用作阴性对照。为了确保无菌处理,在每个实验中都包括含有纯的液体培养基而无微生物的孔。在至少2种独立情形下以6个重复进行每个测试。
杀伤效率的测定
以0.5×MIC、MIC和2×MIC的不同浓度的肽处理微生物18h后,对各个样品进行一系列的10倍稀释,并接种到LB琼脂平板上。然后将平板孵育过夜,并对集落形成单位计数。将包含用10%体积的水处理的微生物的样品作为阴性对照。结果表示为Log(CFU/mL),以及%杀伤=[(对照的细胞计数–聚合物处理的微生物的存活计数)/对照的细胞计数]×100。
场发射-扫描电子显微镜(FE-SEM)成像
用包含20%(体积)水和致死剂量(250mg L-1)的代表性肽的等体积液体培养基,将~3×108CFU ml-1(100μL)的大肠杆菌悬液在96孔板中孵育2h。将每种条件的8个重复合并在微量离心管中,5000×g下离心5min形成团,并用PBS冲洗两次。然后在室温下用4%甲醛将样品固定15min,然后用去离子水冲洗。使用一系列的分级乙醇溶液(35%、50%、75%、90%、95%和100%)进行细胞脱水。将样品进行空气干燥,固定于碳桌(carbontable)上,并用铂进行溅镀以使用FE-SEM设备(JEOL JSM-7400F,日本)进行成像。
生物膜生长抑制和生物量检测
以每孔100μL的体积将稀释至3×106CFU ml-1的过夜培养的金黄色葡萄球菌添加至96孔板的每个孔中,并在37℃、100rpm轻微震荡下使其贴附过夜。然后用100μL的PBS将孔冲洗一次,以去除浮游的细胞和松散贴附的细胞,并补充100μL的新鲜液体培养基。使生物膜形成持续6-8天,在用于实验前每天进行冲洗并更换培养基。为了测定肽处理对生物膜中的金黄色葡萄球菌的活力的影响,100μL的MIC、4×MIC和8×MIC水平的(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22)溶液添加至每个孔中,并将其孵育24h。随后,去除溶液并将120μL的活化XTT溶液添加至每个孔中。孵育4h后,将来自每个孔的100μL的小份转移至新的96孔板中,用于使用微孔板读取仪(TECAN,Switzerland)分别测定在490nm和660nm的测量值和参照波长下的吸光度。相对细胞活力表示为:[(A490-A660)样品/(A490-A660)对照]×100%。数据表示为每个浓度4个重复的均值±标准偏差。
通过结晶紫染色检测估计生物膜的生物量。简而言之,首先按如上所述用所述肽将形成的生物膜处理24h。吸走培养基后,用PBS将生物膜洗涤1次,在室温下用甲醇固定15min,并用100μL的0.1%(体积重量比)结晶紫染色10min。通过用去离子水冲洗孔5次来去除过量的结晶紫染料。使用每孔100μL的33%冰醋酸提取与生物膜结合的染料,并通过使用微孔板读取仪(TECAN,Switzerland)测量570nm波长处的吸光度来进行定量。肽处理后残留的生物量的相对量表示为,以包含10%(体积)水的液体培养基处理的对照的百分比。数据表示为每浓度4个重复的均值±标准偏差。
FITC-LPS结合检测
在具有清澈底部的黑色96孔板的每个孔中,用等体积的肽溶液(50μL)处理于PBS中的50μL的1μg mL-1FITC-LPS。在递增浓度的肽(3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500mg L-1)的存在下,在0h和2h,使用荧光微孔板读取仪(TECAN,Switzerland),通过于480nm处激发FITC-LPS和监测516nm处的FITC发射,研究肽与FITC缀合的LPS的相互作用。包含10%体积的水的100μL PBS被纳入作为空白。于PBS中的100μL FITC-LPS(0.5μg mL-1)的荧光强度用作阴性对照。荧光强度的百分比变化按如下计算:%ΔF(AU)=[((F样品-F空白)/(F对照-F空白))×100]–100。结果表示为4个重复的均值±标准偏差。
细胞培养物
将大鼠巨噬细胞细胞系NR8383维持在补充有10%FBS、100U mL-1青霉素和100mg mL-1链霉素的FK15生长培养基中,并在37℃、5%CO2和95%潮湿空气的气氛下孵育。
内毒素中和检测
将NR8383细胞以4×104个的密度接种,并在96孔板的每个孔中,于肽存在(3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500mg L-1)或不存在下,用来自大肠杆菌0111:B4的LPS(100ng mL-1)于37℃刺激18h。未处理的细胞和仅以LPS刺激的细胞分别用作阳性和阴性对照。根据厂商的方案,使用格里斯试剂(1%磺胺、0.1%N-1-萘基乙二胺二氢氯化物、5%磷酸),通过定量分离的上清液部分(fractions)中稳定的NO代谢物亚硝酸盐的浓度来估计产生的NO的量。测量540nm处的吸光度,并使用从已知浓度的NaNO2溶液制得的标准参考曲线确定亚硝酸盐浓度。
细胞毒性测试
96孔板的每个孔以4×104个细胞的密度接种大鼠巨噬细胞细胞系NR8383,并用递增浓度的肽(3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500mg L-1)于37℃处理18h。随后,将20μL的试剂添加至每个孔中,并将所述板再孵育4h。使用微孔板读取仪在560nm的激发波长和590nm的发射波长处测定孔的荧光强度读数。包含无细胞的肽溶液的对照孔被纳入,以确定背景荧光。%细胞活力=[(F处理的样品–F对应的背景)/(F10% 水对照-F10%水对照背景)]×100。数据表示为4个重复的均值±标准偏差。
结果
在本研究中,通过分离极性表面中的阳离子型赖氨酸和/或精氨酸氨基酸和在相对的非极性表面中的各种疏水性氨基酸,设计了包含8或12个氨基酸残基的短的两亲性肽。通过MALDI-TOF质谱确认了合成的肽的分子量,并且观察到的分子量列出在表1中。可以见到,实验测定的分子量与计算的质量相差很小,表明所述产物对应于设计的序列。
表1.合成的形成β-折叠的肽设计和分子量表征
[a]通过MALDI-TOF MS测得,表观Mw=[Mw+H]+
在去离子水中,每种肽采用了无规则卷曲结构,其特征为,由于质子化的赖氨酸和/或精氨酸残基之间的分子间静电排斥,在水溶液中于~195nm处具有最小值。然而,在模拟微生物膜的疏水环境(使用25mMSDS胶束溶液)中,合成的肽容易自组装成β-折叠二级结构,其特征CD光谱在~200nm处显示最大值,而在~218nm处显示最小值(图2)。
针对临床相关微生物(包括革兰氏阳性表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性大肠杆菌和绿脓假单胞菌,以及酵母菌白色假丝酵母)的代表性集合,测试了合成肽的抗微生物活性。如表2中所示,所设计的肽针对测试的微生物组显示广谱抗微生物活性,其几何平均值(GM)最小抑制浓度(MIC)范围为13.3-162.7mg L-1。总之,所有阳离子残基均为Arg的肽(IRIR)2-NH2(SEQ ID NO:12)显示了最佳的抗微生物活性,其最低GM MIC值为13.3mg L-1。紧随其后的为(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)和(IKIK)2-NH2(SEQ ID NO:13),其GM MIC值分别为23.4和38.3mg L-1。由这些结果可知,具有2个Arg和2个Lys残基的肽产生的抗微生物效应处于其含有4个Arg或4个Lys的相对物之间。被报道为具有高的形成β-折叠倾向的非极性氨基酸,基于增加的疏水性程度和体积而***地变化,同时保留了2个Arg和2个Lys阳离子残基的组合(表1)。在包含Val、Ile、Phe和Trp的肽中,(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)针对所测试的5种微生物的组显示了最有效的抗微生物效应。以Val取代肽重复单元中的第二疏水性Ile残基来给出(IRVK)2-NH2(SEQ ID NO:14),导致了抗微生物活性的轻微降低。该结果有力地证明,Ile残基为观察到的强抗微生物效应所必需。使用包含Val和Ile的序列,研究了具有n=3个重复单元的肽的生物效应。从表2中可见,(VRVK)3-NH2(SEQ ID NO:20)显示了最佳的整体抗微生物效应,其次为(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22)和(IRIK)3-NH2(SEQ IDNO:21)。相比临床上使用的脂肽多粘菌素B,发现几种形成β-折叠的肽(包括(IRIR)2-NH2(SEQ ID NO:12)、(IKIK)2-NH2(SEQ ID NO:13)、(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)和(VRVK)3-NH2(SEQ ID NO:20))具有更广谱的抗微生物活性,这可从其较低的GM MIC值看出(13.3-34.6相对于41.4)。
表2.合成的抗微生物肽的最小抑制浓度(MIC)和治疗指数
[a]测试的5种微生物的MIC值的几何平均值(GM)。
[b]溶血浓度10%(HC10)被确定为诱导≥10%溶血的最低肽浓度。
[c]选择性指数(SI)计算为
[d]计算为2500除以250mg L-1。
对于符合作为合适的治疗候选物的形成β-折叠的肽,其抗微生物活性应当根据其针对微生物细胞膜的选择性加以考虑,以便将对哺乳动物细胞的毒性减至最小。如图3中所示,合成肽在不同MIC值对大鼠红细胞诱导最小的或无溶血作用。所述肽的选择性指数(SI)被进一步评估为,不同的肽序列的安全性和功效的比较(表2)。不同肽的SI被计算为,HC10值(定义为诱导10%或更多溶血的最低肽浓度)与GM(测试的5种微生物菌株的MIC几何平均值)的比率。除了(IRIK)3-NH2(SEQ ID NO:21)外,发现测试的所有肽均具有大于10的高SI,表明它们为适合外部应用和***应用于身体的具有高度吸引力的候选物。特别地,本公开显示在(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)中Arg和Lys残基的组合引起SI的显著改善,单种阳离子型氨基酸肽序列(IRIR)2-NH2(SEQ ID NO:12)和(IKIK)2-NH2(SEQ ID NO:13)的SI值分别从11.3和18.3增加至44.8的值。通过将包含n=2[(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)]和n=3[(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22)]重复单元的代表性肽的溶液经静脉内进行尾静脉注射,在小鼠中进行了急性体内毒性测试。选择前者是因为在具有n=2个重复单元的肽中其具有更好的SI,而选择后者是因为在具有n=3个重复单元的肽中其具有更好的抗微生物活性、选择性和内毒素中和特性(在下文讨论)。发现(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22),分别具有35.2mg/kg的50%致死剂量(LD50;在特定测试时间后杀死50%的小鼠所需的剂量)值。所设计的肽的LD50值有利地与报导的多粘菌素B(5.4mg/kg)和短杆菌肽(1.5mg/kg)的值形成对比。
为了阐明抗微生物机制,在以不同浓度的(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)处理微生物的组后,进行了集落计数实验。对于所测试的5种微生物中的每种,所述肽在各个MIC值实现了接近100%的杀伤效率,因此支持杀菌机制(图4)。在场-发射扫描电子显微镜(FE-SEM)下研究了以(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22)处理后的大肠杆菌的表面形态。如图5中所示,相比用含有10%(体积)水的液体培养基处理的对照样品的相对光滑表面,以所述肽处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的表面看起来较粗糙且不均匀。该观察与文献中报导的各种天然存在和合成的AMP的膜溶解机制一致。相比抑制微生物的生物合成途径中不同靶标的常规抗生素,由于发展为赋予多药耐药性的突变的可能性减少,由所述肽引起的微生物细胞膜的物理破坏预期能在临床环境中提供固有的优势。
抗生物膜能力
接下来研究了合成的抗微生物肽对预先形成的生物膜的抗生物膜能力,这在本质上比防止生物膜形成更具挑战性。如图6中所示,肽(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22)显示对生物膜中存在的金黄色葡萄球菌的剂量依赖性杀伤。在3种浓度测试(P<0.01)中,发现(IRIK)2-NH2诱导显著更高水平的杀伤,在4×MIC水平下细胞活力在24h内大幅下降至小于10%。为了确定以肽处理后残留的生物量的相对量,进行了生物膜的结晶紫染色和溶液化。与金黄色葡萄球菌细胞活力的降低一致,观察到在处理的生物膜中生物量的量以剂量依赖性方式降低(图7)。总之,这些结果为如下提供了直接证明,即8和12个氨基酸长度的肽在杀伤生物膜中微生物方面非常有效,并且能够有效介导生物膜基质的扩散。
LPS和内毒素中和
为了评估合成的肽结合和解离LPS聚集体的能力,将FITC-缀合的LPS与不同的肽缀合,并监测2h内荧光强度的变化。在水溶液中,包含在LPS聚集体中的FITC显示出自淬灭,产生低荧光强度。相反地,当FITC-LPS聚集体解离时,由于去淬灭效应,荧光增加。如图8a中所示,具有n=2的形成β-折叠的肽看起来没有诱导FITC-LPS集物的可识别的破坏,这可从多达500mg L-1的肽浓度缺少荧光强度的变化得到证明。然而,具有3个重复单元的相应肽产生了FITC-LPS荧光强度的强剂量依赖性增加(图8b)。在所述3种肽序列中,(IRIK)3-NH2(SEQ ID NO:21)和(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22)在较低浓度下诱导荧光强度的较大百分比改变,最后为(VRVK)3-NH2(SEQ ID NO:20)。
在将大鼠巨噬细胞细胞系NR8383与100ng mL-1LPS和不同的肽共孵育后,通过定量细胞培养基中存在的稳定NO代谢物亚硝酸盐浓度,通过评估释放的促炎性氧化氮的量来确定合成肽的内毒素中和能力。发现所述肽能有效抑制LPS刺激的NO产生,甚至在15.6mg L-1的低肽浓度,相比非肽处理的对照,亚硝酸盐浓度显著降低(图9)。不同的肽介导的LPS中和程度的顺序为:(IRIK)3-NH2(SEQ ID NO:21)>(IRVK)3-NH2(SEQ IDNO:22)>(VRVK)3-NH2(SEQ ID NO:20),这与先前在FITC-LPS相互作用检测中观察到的趋势相差很小。重要的是,在125mg L-1的(IRIK)3-NH2(SEQ ID NO:21)和(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22)下,亚硝酸盐浓度被降低至对照水平。针对NR8383细胞系进一步评估了所述肽的细胞毒性,并且发现细胞活力超过80%,分别多达62.5、125和125mg L-1浓度的(VRVK)3-NH2(SEQ ID NO:20)、(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22)和(IRIK)3-NH2(SEQ ID NO:21)(图10)。这些结果证实,合成肽的良好抗炎性独立于其对细胞活力的影响,并且所述肽在抗微生物和抗炎剂量下无细胞毒性,表明它们适合用于全身给药。尽管(IRIK)3-NH2(SEQ ID NO:21)在3种肽中具有最有效的抗炎活性,其相对较弱的抗微生物活性(GMMIC值=162.7mg L-1)和较低的选择性指数(SI=3.1)指示,第二好的抗炎肽(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22),其具有47.3的低得多的MIC几何平均值和较高的选择性指数26.4(表2),为用于安全和有效治疗血流感染的更为合适的候选物。
在本公开中,发明人基于天然β-折叠跨膜蛋白中两亲性二联体重复的普遍存在,设计了一系列短的合成的形成β-折叠的肽。所设计的β-折叠肽显示,针对革兰氏阳性表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性大肠杆菌和绿脓假单胞菌以及酵母菌白色假丝酵母具有广谱的抗微生物活性。发现n=2和n=3重复单元,即(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)和(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22)的最佳肽序列,分别具有44.8和26.4的高选择性指数。相比临床上使用的多粘菌素B和短杆菌肽,小鼠中的急性体内毒性测试揭示了最佳合成肽的较高的静脉内LD50值。关于浮游微生物的高效杀伤,还证明了合成的肽为生物膜中细菌生长的有效抑制剂。另外,以不同的肽处理生物膜引起生物量极大减少,表明所述肽能够有效转位通过并引起生物膜基质的扩散。另外,具有3个重复单元的合成肽(包括(VRVK)3-NH2(SEQ ID NO:20)、(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22)和(IRIK)3-NH2(SEQ ID NO:21)),显示了内毒素结合和中和能力,且在功能效应所需的浓度下诱导最小的毒性或无毒性。总之,我们的发现清楚地表明,合理设计的合成的形成β-折叠的肽具有高度选择性,并且具有用作广谱抗微生物剂的潜力,以克服众多基于细菌或真菌的传染性疾病相关的应用中多药耐药性的普遍问题,包括但不限于:预防和消除治疗上有挑战性的在开放性伤口、导管或移植物上的生物膜,以及中和微生物内毒素,以改善血流感染治疗。
实施例2 研究本公开的肽(D-肽)的抗微生物性能
材料
本研究所用的肽由GL Biochem(中国上海)合成,并使用分析型反相(RP)-HPLC纯化至多于95%。使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(4-HCCA)作为基质,用基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS,ModelAutoflex II,Bruker Daltonics Inc.,美国)进一步确认所述肽的分子量。4-HCCA购自Sigma-Aldrich(新加坡),并在重结晶后在饱和乙腈/水(1:1体积比)中使用。磷酸盐缓冲盐水(10×PBS)购自1st Base(新加坡),并在使用前稀释至期望的浓度。调整了阳离子的Mueller-Hinton液体培养基II(MHB II)和酵母霉菌液体培养基(YMB)粉末购自BD Diagnostics(新加坡),并根据厂商的说明书重新构建。表皮葡萄球菌(ATCCNo.12228)、金黄色葡萄球菌(ATCCNo.6538)、大肠杆菌(ATCCNo.25922)、绿脓假单胞菌(ATCCNo.9027)和酵母菌白色念珠菌(ATCCNo.10231)获自ATCC(美国),并根据建议的方案进行培养。环丙沙星、硫酸庆大霉素和青霉素G获自Sigma-Aldrich。
圆二色谱(CD)光谱
首先将每种肽以0.5mg mL-1的浓度溶解在仅去离子(DI)水或包含25mM的SDS表面活性剂的去离子水中。在室温下使用1.0mm光程长度的石英小室,以CD分光偏振计(JASCO Corp.J-810)记录CD光谱。以10nmmin-1的扫描速率,使用190-240nm的溶剂差减获得CD光谱,并从每个肽样品的5次运行进行平均。使用以下方程式将获得的CD光谱转化成平均残基椭圆率:
其中θM是指平均残基椭圆率(deg cm2dmol-1),θobs是在给定波长(mdeg)校正了去离子水的观察椭圆率(mdeg),MRW是残基分子量(Mw·氨基酸残基数-1),c是肽浓度(mg·mL-1),并且l是光程长(cm)。
最小抑制浓度(MIC)测量
使用液体培养基微量稀释法,针对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)、大肠杆菌和绿脓假单胞菌(革兰氏阴性),以及白色假丝酵母(酵母菌),研究了形成β-折叠的肽的抗微生物活性。在实验前,将细菌细胞在37℃下培养于MHB II中,并在室温、300rpm恒定震荡下将酵母细胞培养于YMB中过夜,直至达到中期-对数生长期。以合适的液体培养基稀释微生物悬液,并进行调节以在微孔板读取仪(TECAN,Switzerland)上给出600nm波长下约0.07的起始光密度(O.D.)读数。O.D.读数对应于麦氏标准数1(约3×108CFU mL-1)。将所述肽溶解于HPLC级水中,并使用合适的液体培养基进行一系列的2倍稀释。随后,将具有3×105CFU mL-1的起始加载水平的100μL微生物悬液添加至等体积(100μL)的聚合物溶液中,以获得3.9-500mg L-1的最终聚合物浓度,并将96孔板每个孔中的水含量固定在10%(体积)。37℃或室温下震荡孵育18h后,MIC被视为肉眼观察不到微生物生长并且从0h起O.D.读数无变化的最低聚合物浓度。将在包含10%(体积)水的液体培养基以及仅纯的液体培养基中的微生物细胞用作阴性对照。为了确保无菌处理,将包含纯的液体培养基而无微生物的孔纳入至每个实验中。在至少2种独立情形下,以6个重复进行每个测试。
杀伤效率测试
以不同浓度的肽(0.5×MIC、MIC和2×MIC)处理微生物18h后,对各个样品进行一系列的10倍稀释,并接种在LB琼脂平板上。然后将所述平板孵育过夜,并对集落形成单位计数。将包含以10%(体积)水处理的微生物的样品用作对照。结果表示为Log(CFU/mL)和%杀伤=[(对照细胞计数–肽处理的微生物的存活计数)/对照细胞计数]×100。
场-发射扫描电镜(FE-SEM)显微镜分析
将~3×108CFU mL-1(100μL)的金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌悬液分别用等体积包含终浓度为10%(体积)的HPLC水或125mg L-1的IK8-均为D的液体培养基,在96孔板中孵育2h。将每种条件8个重复合并至微量离心管中,在4000rpm下离心5min形成团,并用PBS冲洗2次。然后将样品在室温下用4%甲醛固定20min,然后用去离子水冲洗。使用一系列的分级乙醇溶液(35%、50%、75%、90%、95%和100%)对细胞进行脱水。将样品固定在铜带上,在空气进行干燥,并用铂进行溅镀,以使用FE-SEM装置(JEOL JSM-7400F,Japan)进行成像。
溶血活性测试
用RPMI1640将新鲜的兔红细胞进行25×稀释,以得到约4%(体积)的悬液用于本实验。将300μL的红细胞悬液添加至包含等体积(300μL)于RPMI1640中的肽溶液的每个管中。将管子在37℃孵育1h,然后在1000×g下离心5min。将小份(100μL)的上清液转移至96孔板的每个孔中,并使用微孔板读取仪(TECAN,Switzerland)在576nm处分析血红蛋白释放。将以RPMI1640孵育的红细胞悬液用作阴性对照。将以0.1%v/v TritonX-100溶解的红细胞的吸光度用作阳性对照,并视为100%溶血。使用下式计算溶血百分比:溶血(%)=[(处理样品的O.D.576nm–阴性对照的O.D.576nm)/(阳性对照的O.D.576nm–阴性对照的O.D.576nm)]×100。数据表示为4个重复的均值±标准偏差。
耐药性研究和针对耐药菌的抗微生物活性
根据先前描述的液体培养基微量稀释法,用不同浓度的肽IK8-均为D和临床上使用的环丙沙星、庆大霉素和青霉素G抗生素,将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(3×105CFU mL-1的起始加载水平)反复处理多达20次传代。在每次传代的18h孵育结束时,对细菌细胞(在特定世代的1/4MIC)进行传代培养,并培养至到达中期-对数生长期,然后将其用于随后的MIC测试。通过记录每个世代的MIC的变化,即标准化为初始世代(MICn/MIC0)MIC的世代n的MIC,可监测耐药性发展。在本检测结束时,以不同浓度的IK8-均为D处理产生的耐环丙沙星和庆大霉素的大肠杆菌培养物,以确定其是否可以有效克服抗生素药物耐受性。
细胞培养物
将小鼠肺泡巨噬细胞细胞系RAW264.7和人胎肺纤维母细胞WI-38细胞分别保持在补充有2mM L-谷氨酰胺、1.5g L-1碳酸氢钠和10%FBS的DMEM和RPMI培养基中,并于37℃在5%CO2和95%湿润空气的气氛下进行培养。
细胞内细菌杀伤
以12孔板的每个孔4×105个的密度接种RAW264.7细胞。过夜孵育后,用13.3μL处理过的细菌(3.0×108CFU mL-1)感染细胞1h,以达到10:1的感染复数。然后将细胞用1×PBS冲洗两次,并用包含50μg mL-1庆大霉素的1mL新鲜培养基孵育45min,以清除细胞外细菌。去除每个孔中的培养基,并将感染的细胞用包含10%(体积)水或各种浓度的IK8-均为D(2、3.9、7.8、15.6和31.3mg L-1)的新鲜培养基孵育多达4和8h。在各个时间点,将感染的细胞进行胰蛋白酶化,用PBS冲洗两次,并用800μL的无菌水溶解,在室温下孵育10min,然后声处理5min。通过将连续稀释的培养物接种到LB琼脂上,并在24h后计数来测定细胞内细菌计数。
细胞毒性测试
分别以96孔板的每孔1.5×104和1×104个细胞的密度接种RAW264.7和WI-38细胞。孵育过夜后,将细胞用1.0-125mg L-1的IK8-均为D处理48h。随后,将每个孔中的孵育培养基替换成100μL的生长培养基和10μL的MTT溶液(5mg·ml-1,于PBS中),并根据厂商的指导将细胞在37℃下孵育4h。在去除生长培养基后,使用150μL的DMSO将产生的在每个孔中形成的甲臜晶体溶解。然后将来自每个孔的100μL小份转移至新的96孔板,以使用微孔板分光光度计测定550nm和690nm波长下的吸光度。相对细胞活力表示为[(A550-A690)样品/(A550-A690)对照]×100%。数据表示为来自以每浓度4个重复进行的两个独立实验的均值±标准偏差。
结果
肽设计和定征
以上的实施例1描述了由天然存在的L-氨基酸组成的短的、合成的形成β-折叠的肽的设计,并显示了其针对临床相关微生物的广谱和高选择性抗微生物活性。在本研究中,使用分别为n=1.5、2或3个重复单元的最佳的形成β-折叠的肽(IRIK)2-NH2(SEQ ID NO:17)(IK8-均为L)和(IRVK)3-NH2(SEQ ID NO:22)(IK12-均为L)进行D-氨基酸的取代,所述肽在之前已针对抗微生物活性、选择性和内毒素中和特性进行了优化。所有设计的肽均在C-端被酰胺化,以赋予高净正电荷来增加抗微生物活性。如表3中所示,使用MALDI-TOF质谱测定的合成肽序列的观察分子量与理论值相差很小,表明产物与所设计的组合物非常接近。
表3.形成β-折叠的肽的设计和定征。
[a]小写有下划线的残基代表D-氨基酸。
[b]通过MALDI-TOF MS测得,表观Mw=[Mw+H]+
在模拟微生物膜的环境中,使用CD光谱研究了所设计的肽的二级结构形成。IK8-均为L和IK12-均为L容易在25mM SDS胶束溶液中自组装形成β-折叠二级结构,这可从特征性的~200nm处的最大值和~218nm处的最小值得到证明(图11a和11b)。相应的对映体IK8-均为D和IK12-均为D为精确镜像,它们的椭圆率相比其L-等同物的椭圆率大致相当但符号相反。有趣的是,在最佳的IK8-均为L序列中位置2、4、6、8(IK8-4D)处的选择性D-氨基酸取代导致二级结构的完全丢失,然而仅位置4、6(IK8-2D)处的取代使得能够保留形成β-折叠的倾向(图11c)。由于β-折叠形成受到给定肽中的侧链官能团之间分子间的氢键结合的控制,在IK8-4D中广泛掺入的D-氨基酸可能影响肽结构中官能团的空间位置,导致邻近肽分子之间的相互作用丢失从而破坏β-折叠形成。形成β-折叠的序列IK8-均为L中阳离子型氨基酸和疏水性氨基酸的重排而产生对照肽(IIRK)2-NH2(对照-均为L;SEQ ID NO:25)、(iirk)2-NH2(对照-均为D;SEQID NO:26)和(IirK)2-NH2(对照-4D;SEQ ID NO:275)(表3),导致二级结构的丢失;尽管所述分子的总电荷和疏水性保持不变,其在测试条件下作为无规则卷曲存在(图11d)。因此,该结果表明,所述氨基酸交替的疏水性和亲水性空间位置为在膜条件下β-折叠形成所必需。如图18中所示,所设计的肽在去离子水中保留为无规则卷曲,因此证明了各种形成β-折叠的肽对两亲性微生物膜模拟物具有特异性。
抗微生物活性和选择性
针对一组临床相关的微生物,包括表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)、大肠杆菌和绿脓假单胞菌(革兰氏阴性菌)以及白色假丝酵母(酵母菌),评估了所设计的肽的抗微生物活性。
表4.合成的抗微生物肽的最小抑制浓度(MIC)和选择性指数
[a]测试的5种微生物的MIC值的几何平均值(GM)。
[b]溶血浓度10%(HC10)定义为诱导≥10%溶血的最低肽浓度。
[c]选择性指数(SI)计算为
[d]所述肽对之具有活性的4种微生物的MIC值的GM。
[e]发生于RPMI1640培养基中从125mg L-1的沉淀。
从表4中可见,相比非形成β-折叠的肽,在微生物膜模拟条件下组装成β-折叠的肽序列显示了强得多且更广范围的针对所有测试的微生物的活性,而不管立体化学如何(表4)。例如,不同的形成β-折叠的肽的最小抑制浓度(MIC)的几何平均值(GM)范围为4.3-113.3mg L-1,而非形成β-折叠的对照肽和IK8-4D不显示或表现为显著减小的抗微生物活性。因此,该观察表明,所设计的AMP自组装形成β-折叠二级结构对其强抗微生物特性至关重要。该发现与文献报导一致,其中AMP的生物活性常常与相对面上的阳离子型和疏水性氨基酸残基在形成二级结构后的分离有关,造成膜脂双分子层的破坏。有趣的是,选择性取代非形成β-折叠的IIRK基序(对照-均为L)的第2位和第3位的D-氨基酸以获得(IirK)2-NH2(对照-4D),部分地修复了针对表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌和白色假丝酵母的抗微生物活性(表4)。具体而言,针对大肠杆菌的MIC值增加至~16倍,从>500至31.3mg L-1。然而,该肽的抗微生物活性仍然小于长度、电荷和疏水性相同的形成β-折叠的肽(即,IK8-均为L或IK8-均为D)。
另外,发现以D-氨基酸取代显著改善了形成β-折叠的肽的抗微生物活性,而不论重复单元的数目(n=2或3)或肽长度如何。该效果对于具有n=2个重复单元的较短的IK8-均为D肽尤其显著,所述肽针对不同细菌的MIC值比其L-对映体低2-16倍。相比之下,相比其相应的L-对映体,IK12-均为D介导了MIC值的2-4倍降低,其具有增加的针对白色假丝酵母的抗真菌活性。在不同的肽中,IK8-均为D显示出最有效的抗微生物活性,其针对不同类型的微生物具有4.3mg L-1的非常低的几何平均MIC值(GM),在相同的测试条件下,其优于获得的临床上使用的脂肽抗生素多粘菌素B的值(41.4mg L-1)。进一步将肽长度减少至6个D-氨基酸(n=1.5)造成抗微生物活性降低,其具有113.3mg L-1的较高的GM MIC值,表明具有n=2个重复单元的形成β-折叠的肽提供了最佳的抗微生物活性结构。
使用4%(体积)的兔血评估了合成的肽的溶血活性。如先前所报导的,包含形成β-折叠的肽的均为L-氨基酸在MIC值下显示最小的溶血或无溶血,其对微生物膜具有高选择性(在图2和表2中也有显示)。在本研究中,发现n=2个重复单元的对映体形式的形成β-折叠的肽之间的溶血活性的差异较小,IK8-均为L和IK8-均为D的高HC10值分别为2000和1750mg L-1(表4)。鉴于对先前观察到的抗微生物活性的极大改善,这些结果清楚地证明了,D-对映体对于阴离子型微生物膜相比两性离子型哺乳动物细胞膜具有更高的选择性,IK8-均为D和IK12-均为D分别产生了407.0和>>9.8mg L-1的非常高的SI(表4)。总之,这些结果表明n=2的合成的形成β-折叠的肽、IK8-均为D的D-对映体,凭借其其广谱的和高选择性的抗微生物活性,可为治疗耐药性微生物感染的有效治疗候选物。
与其较差的抗微生物活性一致,非形成β-折叠的肽、对照-均为L和对照-均为D,在多达2500mg L-1下诱导最小的溶血或无溶血(图12c),显示与红细胞膜类似的弱相互作用。同样地,D-氨基酸取代的非形成β-折叠的肽对照-4D(其显示针对几种微生物某种程度的抗微生物活性)也诱导最小溶血,因此产生>23.3的高选择性指数(SI)(表4)。这些结果表明,在不形成二级结构时,以D-氨基酸取代后获得的改变的肽构象仍然能够允许与某些微生物膜组合物发生中等程度的相互作用,但不影响真核生物膜(图11d)。
对蛋白酶降解的抗性
限制AMP的临床应用的一个主要因素在于其不稳定性,其易于被生物液体和/或微生物分泌的液体中广泛存在的蛋白酶快速降解。为了评估所设计的形成β-折叠的肽的蛋白水解稳定性,将n=2的肽序列的D-同种型和L-同种型(分别为IK8-均为D或IK8-均为L)用广谱丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K处理6h,并评估其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓假单胞菌的抗微生物活性。如在图13中所见,在孵育18h后,未处理的IK8-均为D和IK8-均为L有效抑制所有3种微生物的生长。然而,以蛋白酶处理IK8-均为L导致细菌抑制活性的完全丧失,表明其已被存在的蛋白酶降解。另一方面,IK8-均为D保留了其对不同微生物的抗菌活性。以两种蛋白酶处理后,还使用MALDI-TOF质谱评估了合成的肽的结构完整性。如从MALDI-TOF质谱可见,以两种蛋白酶处理IK8-均为L导致完整肽的降解,产生多个低分子量峰(图19a),因此解释了先前观察到的抗菌活性的丧失。两种酶针对IK8-均为L肽的切割位点显示在图19a中,其中质谱峰被分配给主要的片段。相反地,IK8-均为D在蛋白酶处理后保持完整,未观察到较小分子量的产物(图19b)。该对酶促降解的降低的敏感性,结合先前观察到的优良的抗微生物活性和选择性,强烈地表明IK8-均为D是用于治疗应用的有前景的候选物。
膜溶解活性和耐药性缓解
AMP的主要作用机制在于,对微生物膜的快速扰动和破坏导致细胞质内容物的泄露和最终的细胞死亡。由于微生物修复大量的细胞膜损伤非常困难,该杀菌作用机制被认为能提供预防和克服耐药性机制的非常具吸引力的方式。本研究首次确定,类似于其L-对映体,IK8-均为D介导杀菌作用机制,在本研究中测试的5种微生物中每种的分别的MIC值下,产生存活集落计数的大于3个对数的降低(>99.9%杀伤效率)(图14)。在FE-SEM下,相比以包含10%(体积)水的液体培养基处理的各个对照的平滑表面,在用125mg L-1的IK8-均为D处理短暂的2h后,在革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性的绿脓假单胞菌的表面上,观察到明显的膜损伤和起皱(图15)。
已知将微生物延长地重复暴露于非致死剂量的抗生素能促进耐药性的获得。为了研究IK8-均为D介导的膜破坏是否能够充分地防止耐药性发展,每日将用亚MIC量AMP处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌传代,并用于测定多达20次传代的MIC。将临床上使用的各种抗生素(包括细胞壁合成抑制剂青霉素G、细菌拓扑异构酶抑制剂环丙沙星和蛋白合成抑制剂硫酸庆大霉素)纳入作为本研究的对照。如图16中所示,尽管以低剂量的所设计的AMP重复处理,IK8-均为D针对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值保持在3.9mg L-1(MICn/MIC0=1)不变。以硫酸庆大霉素处理大肠杆菌,最早在第2次传代时诱导耐药性,这可以从MIC值的加倍(MICn/MIC0=2)看出,其随后到第6次传代时增加至原始MIC值的4倍(MICn/MIC0=4)(图16a)。环丙沙星介导稍微延迟的耐药性起始,在随后第4次传代时出现MIC加倍。随后到第7次传代时MIC值增加为4倍,随后在实验结束时MIC值大幅增加为32倍。对于金黄色葡萄球菌也观察到类似的趋势,早期获得耐药性且到第20代时对青霉素G和环丙沙星的MIC分别增加为32倍和4倍(图16b)。总之,这些结果强烈地表明,由不同抗生素介导的不同抗微生物作用机制不同程度地影响它们的耐药性发展特性。显而易见地,以合成的形成β-折叠的肽重复处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,在实验过程中并不诱导任何耐药性发展。
除了能够防止耐药性发展,以IK8-均为D处理来源于本实验的耐庆大霉素和环丙沙星的大肠杆菌还揭示出,所述合成的肽以与在野生型(非耐药性的)细菌中浓度相同的浓度有效抑制细菌生长(即,3.9mg L-1)(图20)。该结果有力地证明,形成β-折叠的肽的膜破坏能力能够有效克服常规抗生素耐受性机制以抑制细菌生长。针对临床上分离的耐药性微生物,进一步研究了所设计的形成β-折叠的肽的活性。如在表5中所示,所设计的AMP显示了针对MRSA、VRE、多药耐药性鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和酵母菌新型隐球菌的广谱抗微生物活性。与先前观察到的结果一致,IK8-均为D诱导更强的抗菌活性,相比其L-对映体,MBC降低了4-8倍。另外,IK8-均为D、IK8-2D和IK12-均为L也显示针对临床上分离的结核分枝杆菌的优异活性,其MIC范围为15.6-125mg L-1(表6)。
表5.合成的抗微生物肽对临床上分离的耐药性微生物的最小杀菌浓度(MBC)。
表6.合成的抗微生物肽对临床上分离的结核分枝杆菌的最小抑制浓度(MIC)。
感染的小鼠巨噬细胞中金黄色葡萄球菌的细胞内杀伤
由于细菌的存活和防止细菌接触许多很少渗入细胞内的细胞外抗生素,由肺泡巨噬细胞吞噬微生物可以潜在地产生持续性感染的来源。金黄色葡萄球菌是可存活于肺泡巨噬细胞中的机会病原体的临床相关实例,并且通常与社区和医院获得的肺病病例有关。因此,接下来研究了合成的AMP清除细胞内金黄色葡萄球菌的能力。用不同剂量的IK8-均为D将感染的RAW264.7小鼠肺泡巨噬细胞处理4和8h。如图17中可见,当相比以包含10%(体积)水(P<0.01)的培养基处理对照所获得的计数时,以IK8-均为D处理4和8h后细胞内的金黄色葡萄球菌集落计数显著降低。例如,当相比对照时,所设计的肽在8h时有效地介导集落计数的1.2-1.5的对数降低(图17)。重要的是,发现由IK8-均为D介导的金黄色葡萄球菌的细胞内杀伤独立于所述肽的细胞毒性,因为在杀菌剂量下观察到多于80%的细胞活力(图21)。还在人胎肺纤维母细胞WI-38细胞系中研究了IK8-均为D的细胞毒性,并且其显示大于77%的细胞活力,多达62.5mg L-1,这远高于其抗微生物浓度。总之,这些结果表明,除了其在细胞外细菌杀伤中的有效活性,所设计的形成β-折叠的肽还可有效进入感染细胞,以降低细胞内细菌负载并产生最小的细胞毒性。
实施例2研究了二级结构形成的重要性和立体化学对抗微生物活性和选择性的影响。这表明,在微生物膜模拟条件下所述合成的肽自组装成β-折叠为其强抗微生物活性所必需。在不同的肽中,IK8-均为D显示最有效的抗微生物活性,其具有407.0的极高选择性指数。在广谱蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K存在下,D-对映体还显示增加的稳定性。另外,IK8-均为D的膜溶解活性提供了有效方式来防止耐药性发展和有效地介导对不同的临床上分离的多药耐药性微生物的杀伤。除了其对细胞外微生物的功效外,所合成的形成β-折叠的肽IK8-均为D还显示对细胞内金黄色葡萄球菌的有效杀伤。总之,这些结果表明,取代了D-氨基酸的形成β-折叠的肽IK8-均为D,以其增加的抗微生物活性和改善的蛋白酶稳定性,可用于在不同的临床应用中对抗耐抗生素微生物。
实施例3 研究本公开的肽的抗增殖性能
细胞培养
分别将人***HeLa细胞系、人表皮纤维母细胞HDF细胞系和大鼠巨噬细胞NR8383细胞系保持在补充有10%FBS、100U mL-1青霉素和100mg mL-1链霉素的RPMI、DMEM和FK15生长培养基中,并在37℃、5%CO2和95%湿润空气的气氛下进行培养。
细胞活力测试
分别以96孔板的每个孔1×104、1×104和4×104个细胞的密度接种HeLa、HDF和NR8383细胞。孵育过夜后,用3.9-500mg L-1的(IRIK)3-NH2(SEQ ID NO:21)和(VRVK)3-NH2(SEQ ID NO:20)将细胞处理24h。对于贴附的HeLa和HDF细胞系,将每个孔中的孵育培养基替换为100μL的生长培养基和10μL的MTT溶液(5mg·ml-1,于PBS中)。根据厂商的指导将细胞在37℃下进一步孵育4h。在去除生长培养基后,使用150μL的DMSO溶解在每个孔中形成的产物甲臜晶体。然后将来自每个孔的100μL小份转移至新的96孔板,以使用微孔板分光光度计测定550nm和690nm处的吸光度。相对细胞活力表示为[(A550-A690)样品/(A550-A690)对照]×100%。数据表示为以每浓度4个重复进行的两个独立实验的均值±标准偏差。
对于半贴附的NR8383细胞,在处理后将20μL的试剂添加至每个孔中,并将所述板再孵育4h。使用微孔板读取仪,在560nm的激发波长和590nm的发射波长下测定孔的荧光强度读数。将包含无细胞的肽溶液的对照孔纳入以测定背景荧光。=[(F处理的样品–F对应背景)/(F10%水对照-F10%水对照背景)]×100。数据表示为4个重复的均值±标准偏差。
结果
如从图22可见,以(IRIK)3-NH2(SEQ ID NO:21)处理HeLa***细胞系导致细胞活力的从先前的125mg/L浓度依赖性地降低至小于70%。另一方面,多于80%的非癌性HDF和NR8383细胞在125mg/L下具有生活力。类似地,以(VRVK)3-NH2(SEQ ID NO:20)处理HeLa细胞导致在250mg/L仅30%的细胞活力,而HDF和NR8383细胞具有大于53%的细胞活力。因此,这些结果表明,相比正常细胞膜,形成β-折叠的肽对具更多负电荷的癌细胞膜具有更大的选择性。
Claims (33)
1.两亲性肽,其中所述肽包含:(X1Y1X2Y2)n(式I),其中
所述肽的C-末端被酰胺化;
X1和X2彼此独立地为疏水性氨基酸,
Y1和Y2彼此独立地为阳离子型氨基酸;并且
n至少为1.5,
其中所述肽能自组装成β-折叠结构。
2.如权利要求1所述的肽,其中n为2、或2.5、或3、或3.5、或4、或4.5、或5。
3.如权利要求1-2中任一项所述的肽,其中(X1Y1X2Y2)n为(X1Y1X2Y2)n-NH2。
4.如权利要求1-3中任一项所述的肽,其中所述疏水性氨基酸选自:丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和半胱氨酸(C)。
5.如权利要求4所述的肽,其中所述疏水性氨基酸为异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的肽,其中所述阳离子型氨基酸选自:赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)。
7.如权利要求1-6中任一项所述的肽,其中式I的每个重复单元n彼此独立地包含1、或2、或3、或4、或6、或8个D-氨基酸,剩余的氨基酸为L-氨基酸。
8.如权利要求1-6中任一项所述的肽,其中式I的每个重复单元n彼此独立地包含2、或4、或6、或8个D-氨基酸,剩余的氨基酸为L-氨基酸。
9.如权利要求7或8所述的肽,其中式I的每个重复单元n中的D-氨基酸的分布彼此相同或不同。
10.如权利要求7-9中任一项所述的肽,其中n为2,并且4位和6位的氨基酸为D-氨基酸,而剩余的氨基酸为L-氨基酸。
11.如权利要求1-10中任一项所述的肽,其包含序列(IY1IY2)n-NH2。
12.如权利要求1-10所述的肽,其包含序列(IRX2K)n-NH2。
13.如权利要求1-12中任一项所述的肽,其中所述肽选自:VRVKVRVK-NH2(SEQ ID NO:11)、VRVKVRVKVRVK-NH2(SEQ ID NO:20)、IRIRIRIR-NH2(SEQ ID NO:12)、IKIKIKIK-NH2(SEQ ID NO:13)、IRVKIRVK-NH2(SEQ ID NO:14)、FRFKFRFK-NH2(SEQ ID NO:15)、WRWKWRWK-NH2(SEQ ID NO:16)、IRIKIRIK-NH2(SEQ ID NO:17)、IRIKIRIKIRIK-NH2(SEQ ID NO:21)、irikir-NH2(SEQ ID NO:10)、irikirik-NH2(SEQ ID NO:18)、IRIkIrIK-NH2(SEQ ID NO:19)、IRVKIRVKIRVK-NH2(SEQ ID NO:22)和irvkirvkirvk-NH2(SEQ ID NO:23),其中小写的有下划线的残基代表D-氨基酸,而大写的无下划线的残基代表L-氨基酸。
14.如权利要求1-13中任一项所述的肽,其被用作药物。
15.治疗细菌感染或去除细菌的方法,包括给予药学有效量的权利要求1-13中任一项所述的肽。
16.如权利要求15所述的方法,其中所述细菌为革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
17.如权利要求15或16所述的方法,其中所述细菌选自以下属,其选自:醋酸杆菌(Acetobacter)、不动杆菌(Acinetobacter)、放线菌(Actinomyces)、农杆菌(Agrobacterium spp.)、根瘤菌(Azorhizobium)、固氮菌(Azotobacter)、无形体(Anaplasma spp.)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)、拟杆菌(Bacteroides spp.)、巴尔通体(Bartonella spp.)、博德特氏菌(Bordetella spp.)、包柔氏螺旋体(Borrelia)、布鲁氏菌(Brucella spp.)、伯克霍尔德菌(Burkholderia spp.)、鞘杆菌(Calymmatobacterium)、弯曲杆菌(Campylobacter)、衣原体(Chlamydia spp.)、嗜衣原体(Chlamydophila spp.)、梭菌(Clostridium spp.)、棒状杆菌(Corynebacterium spp.)、柯克斯体(Coxiella)、埃立克体(Ehrlichia)、肠杆菌(Enterobacter)、肠球菌(Enterococcus spp.)、埃希氏菌(Escherichia)、弗朗西斯氏菌(Francisella)、梭杆菌(Fusobacterium)、加德纳菌(Gardnerella)、嗜血杆菌(Haemophilus spp.)、螺杆菌(Helicobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、乳杆菌(Lactobacillus spp.)、乳球菌(Lactococcus)、军团杆菌(Legionella)、李斯特菌(Listeria)、Methanobacterium extroquens、多形微杆菌(Microbacterium multiforme)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、分枝杆菌(Mycobacterium spp.)、支原体(Mycoplasma spp.)、奈瑟菌(Neisseria spp.)、巴氏杆菌(Pasteurella spp.)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、卟啉单胞菌(Porphyromonas)、假单胞菌(Pseudomonas)、根瘤菌(Rhizobium)、立克次氏体(Rickettsia spp.)、罗卡利马体(Rochalimaea spp.)、罗氏菌(Rothia)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、沙雷氏菌(Serratia)、志贺氏菌(Shigella)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、链球菌(Streptococcus spp.)、密螺旋体(Treponema spp.)、弧菌(Vibrio spp.)、沃尔巴克氏体(Wolbachia)和耶尔森氏菌(Yersinia spp)。
18.如权利要求17所述的方法,其中所述细菌选自:橙黄醋酸杆菌(Acetobacter aurantius)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、衣氏放线菌(Actinomyces Israelii)、放射状土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)、维氏固氮菌(Azotobacter vinelandii)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、边缘无浆体(Anaplasma marginale)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、纺锤芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、牙龈拟杆菌(Bacteroides gingivalis)、Bacteroides melaminogenicus(Prevotellamelaminogenica)、汉赛巴尔通体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通体(Bartonella Quintana)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)复合体、新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)、肉芽肿荚膜杆菌(Calymmatobacterium granulomatis)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、嗜衣原体(Chlamydophila.)(如肺炎嗜衣原体(C.pneumoniae)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani))、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、梭形棒状杆菌(Corynebacterium fusiforme)、贝氏柯克斯体(Coxiella bumetii)、查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus galllinarum)、Enterococcus maloratus、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、***加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、百日咳嗜血杆菌(Haemophilus pertussis)、***嗜血杆菌(Haemophilus vaginalis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜肺军团杆菌(Legionella pneumophila)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、Methanobacterium extroquens、多形微杆菌(Microbacterium multiforme)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、白喉分枝杆菌(Mycobacteriumdiphtheriae)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、鼠麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepraemurium)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、耻垢分枝杆茵(Mycobacteriumsmegmatis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、生殖支原体(Mycoplasma genitalium)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、穿通支原体(Mycoplasma penetrans)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、土拉巴斯德氏菌(Pasteurella tularensis)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、放射状根瘤菌(Rhizobium Radiobacter)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、鹦鹉热立克次氏体(Rickettsia psittaci)、五日热立克次氏体(Rickettsia Quintana)、立克次氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)、沙眼立克次体(Rickettsia trachomae)、亨氏罗卡利马氏体(Rochalimaeahenselae)、五日热罗卡利马氏体(Rochalimaea Quintana)、龋齿罗氏菌(Rothia dentocariosa)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、志贺氏痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、鸟链球菌(Streptococcus.Avium)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、仓鼠链球菌(Streptococcus cricetus)、屎链球菌(Streptococcus faceium)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、野鼠链球菌(Streptococcus ferus)、鹑鸡链球菌(Streptococcus gallinarum)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、草绿色链球菌(Streptococcus mitior)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大鼠链球菌(Streptococcus rattus)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、逗号弧菌(Vibriocomma)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、沃尔巴克氏体(Wolbachia)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)和假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)。
19.如权利要求16-18中任一项所述的方法,其中所述细菌感染选自:肺炎、结核病、脑膜炎、腹泻性疾病、生物膜形成、脓毒症、李斯特菌病、肠胃炎、中毒性休克综合症、出血性结肠炎;溶血性尿毒综合症、莱姆病、胃溃疡和十二指肠溃疡、人埃立克体病、伪膜性结肠炎、霍乱、沙门氏菌病、猫抓热、坏死性筋膜炎(GAS)、链球菌中毒性休克综合症、医院和社区相关的感染、动脉粥样硬化、婴儿瘁死综合症(SIDS)、耳部感染、呼吸道感染、***、皮肤及软组织感染、甲床感染、伤口感染、败血症、胃肠疾病、医院获得性心内膜炎和血流感染。
20.中和内毒素的方法,包括给予药学有效量的权利要求1-13中任一项所述的肽。
21.如权利要求20所述的方法,其中所述内毒素为细菌内毒素或真菌内毒素。
22.治疗基于病毒的传染性疾病的方法,包括给予药学有效量的权利要求1-13中任一项所述的肽。
23.如权利要求22所述的方法,其中所述病毒传染性疾病选自:普通感冒、流感、水痘、唇疱疹、埃博拉、AIDS、禽流感、SARS、登革热、疱疹、带状疱疹、麻疹、腮腺炎、风疹、狂犬病、人***瘤病毒、性传播疾病、病毒性脑膜炎、病毒性肝炎、柯萨奇病毒和爱泼斯坦巴尔病毒。
24.治疗真菌感染或侵扰、或者去除真菌的方法,包括给予药学有效量的权利要求1-13中任一项所述的肽。
25.如权利要求24所述的方法,其中所述真菌选自以下属:犁头霉菌(Absidia)、阿耶罗菌(Ajellomyces)、节皮菌(Arthroderma)、曲霉菌(Aspergillus)、芽生菌(Blastomyces)、假丝酵母(Candida)、孢瓶霉(Cladophialophora)、球孢子菌(Coccidioides)、隐球菌(Cryptococcus)、小克银汉霉(Cunninghamella)、表皮癣菌(Epidermophyton)、外瓶霉(Exophiala)、线黑粉菌(Filobasidiella)、着色真菌(Fonsecaea)、镰刀菌(Fusarium)、地霉(Geotrichum)、组织胞浆菌(Histoplasma)、Hortaea、Issatschenkia、马杜拉分枝菌(Madurella)、马拉色菌(Malassezia)、小孢子菌(Microsporum)、微孢子虫(Microsporidia)、毛霉菌(Mucor)、丛赤壳菌(Nectria)、拟青霉(Paecilomyces)、副球孢子菌(Paracoccidioides)、青霉菌(Penicillium)、毕赤酵母(Pichia)、肺囊虫(Pneumocystis)、假阿利什菌(Pseudallescheria)、根霉(Rhizopus)、红酵母菌(Rhodotorula)、赛多孢子菌(Scedosporium)、裂褶菌(Schizophyllum)、孢子丝菌(Sporothrix)、毛癣菌(Trichophyton)和毛孢子菌(Trichosporon)。
26.如权利要求25所述的方法,其中所述真菌选自:伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、荚膜阿耶罗菌(Ajellomyces capsulatus)、皮炎芽生菌(Ajellomyces dermatitidis)、苯海姆节皮菌(Arthroderma benhamiae)、粉节皮菌(Arthroderma fulvum)、石膏样节皮菌(Arthroderma gypseum)、内弯节皮菌(Arthroderma incurvatum)、太田节皮菌(Arthroderma otae)和万博节皮菌(Arthroderma vanbreuseghemii)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和黑曲霉(Aspergillus niger)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、吉利蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、克柔假丝酵母(Candida krusei)、***滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和菌膜假丝酵母(Candida pelliculosa)、Cladophialophora carrionii、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和Coccidioides posadasii、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、小克银汉霉(Cunninghamella sp.)、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)、皮炎外瓶霉(Exophiala dermatitidis)、新型线黑粉菌(Filobasidiella neoformans)、裴氏着色真菌(Fonsecaea pedrosoi)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、白地霉(Geotrichum candidum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、威尼克外瓶霉(Hortaea werneckii)、东方伊萨酵母(Issatschenkia orientalis)、灰色马杜拉菌(Madurella grisae)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)、球形马拉色菌(Malassezia globosa)、钝形马拉色菌(Malassezia obtusa)、厚皮马拉色菌(Malassezia pachydermatis)、限制性马拉色菌(Malassezia restricta)、斯洛菲马拉色菌(Malassezia slooffiae)、合轴马拉色菌(Malasseziasympodialis)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、粉小孢子菌(Microsporumfulvum)、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)、微孢子虫(Microsporidia)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、红球丛赤壳(Nectria haematococca)、宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、异常毕赤酵母(Pichiaanomala)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jiroveci)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、波氏假阿利什菌(Pseudallescheria boydii)、米根霉(Rhizopus oryzae)、深红酵母(Rhodotorula rubra)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)、裂褶菌(Schizophyllum commune)、申克孢子丝菌(Sporothnx schenckii)、须毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)、紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)、阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)、皮毛孢子菌(Trichosporon cutaneum)、墨汁毛孢子菌(Trichosporon inkin)和粘状毛孢子菌(Trichosporon mucoides)。
27.去除生物膜的方法,包括给予有效量的权利要求1-13中任一项所述的肽。
28.如权利要求27所述的方法,其中所述生物膜存在于表面上。
29.如权利要求28所述的方法,其中所述表面选自:船、造船厂、食物加工器、混合器、机器、容器、水槽、滤水器、纯化***、食品行业中的防腐剂、个人护理用品、解剖刀、针、剪刀和其他用于侵入性的手术、治疗或诊断过程的器械;植入式医疗器械,包括人工血管、导管和其他用于将流体从患者去除或递送至患者的器械、人工心脏、人工肾、整形外科针、盘和移植物、导管、泌尿管和胆管、气管内导管、外周可***式中心静脉导管、透析管、长期隧道式中心静脉导管、外周静脉导管、短期中心静脉导管、动脉导管、肺导管、气囊漂浮导管、泌尿导管、腹膜导管、长期泌尿设备、结合组织的泌尿设备、人工泌尿***、泌尿扩张器、心室或动脉-静脉分流器;***填充物、***假体、血管移植物假体、心脏瓣膜、人造关节、人工喉、耳移植物、血管导管口、伤口引流管、脑积水分流器、起搏器和可植入除颤器、牙种植体、填料、假牙、医疗器材、医疗护理专业人员穿戴或携带的医疗装备、用于医疗程序或用于准备医疗设备的区域中的案台和固定装置、用于呼吸道治疗的管和罐、喷雾器、美化剂、手套、围裙和面罩。
30.治疗增殖性疾病的方法,包括给予药学有效量的权利要求1-13中任一项所述的肽。
31.如权利要求30所述的方法,其中所述增殖性疾病选自:肿瘤、癌症、恶性肿瘤或以上疾病的组合。
32.如权利要求31所述的方法,其中所述增殖性疾病选自:结肠直肠癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、***肉瘤、***-内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、头颈鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、肝转移、胆管癌、绒毛膜癌、***瘤、胚胎性癌、甲状腺癌如甲状腺未分化癌、肾母细胞瘤、***、睾丸肿瘤、肺癌、肺小细胞癌、肺非小细胞癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
33.如权利要求1-13中任一项所述的肽在制备用于治疗癌症、细菌感染,或者去除细菌,或者中和内毒素,或者治疗基于病毒的传染性疾病,或者治疗真菌感染或侵扰,或者去除真菌,或者治疗增殖性疾病的药物中的用途。
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