CN104582719A - 灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组合物，其包含在柠檬酸溶液中的灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性细胞制剂。还涉及一种保护动物抵抗钩端螺旋体细菌感染的疫苗，其中所述疫苗包含该组合物，以及涉及通过将柠檬酸溶于载体中，将柠檬酸用于稳定液体载体中的灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性制剂的用途。

Description

灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性组合物
发明领域
本发明涉及一种组合物，其包含灭活钩端螺旋体(Leptospira)细菌的免疫原性细胞制剂，保护动物预防钩端螺旋体细菌感染的疫苗，以及柠檬酸用于稳定灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性制剂的用途。
技术背景
钩端螺旋体病是由钩端螺旋体的许多致病血清变型中的任一种感染引起的世界范围的人畜共患病。所述生物的属是极其易变的，并且包含超过250个血清变型。单个致病性血清变型的发病率因不同地区而异，可能受如气候、当地动物群和农业实践等因素的影响。钩端螺旋体病实际上影响到所有的哺乳动物物种。人类钩端螺旋体病也很重要，并且在热带地方性发生，并且是温带气候中的流行病。然而，与其他物种不同，人类实质上对于疾病的维持并不重要，并且人对人的传播很罕见。
预防钩端螺旋体病的人疫苗接种是研究团体的目标，但是进展一直非常缓慢。鉴于犬钩端螺旋体病是一种重要的疾病，并且犬是钩端螺旋体病的来源，预防该犬疾病的许多疫苗是可得的。商业的犬钩端螺旋体病疫苗传统上包含犬(Canicola)血清组和黄疸出血性(Ictero)血清组的灭活抗原，并且已面市超过五十年。欧洲最近的建议是继续在疫苗中包含Canicola和Ictero血清组的抗原，附加包含流感伤寒(Grippo)血清组和澳大利亚(Australis)血清组的抗原。而在美国，目前可获得具有四种血清组(Canicola、ictero、Grippo和Pomona)的抗原的四种犬疫苗；在欧洲，目前可获得多种传统二价疫苗(Canicola、Ictero)和仅一种三价疫苗(Canicola、Ictero和Grippo)。
即使不是全部如此，大多数可商购的钩端螺旋体病疫苗包括灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性细胞制剂，例如***灭活的全细胞。已知这些疫苗在远低于室温的贮存温度，通常在2℃至8℃之间，非常稳定。然而，特别是考虑到一个事实，即钩体螺旋体病是热带的地方病，在高于室温的温度下具有疫苗稳定性将是一个重要的优点，因为这将允许在环境条件下贮存，而不需要任何冷却设备。在过去，因为存在于这类灭活的全细胞疫苗中的任何蛋白可能是钩端螺旋体抗原不稳定的原因，已经测试了将这些蛋白变性(例如通过施加不影响钩端螺旋体抗原的热激处理)是否会导致稳定性的显著改善。然而，结果是阴性的。
发明目的
需要显著提高包含灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性细胞制剂的组合物的稳定性，特别是获得一种组合物，其即使是在高于室温的温度下贮存至少3个月后，仍然有效引起免疫应答。特别地，需要一种钩端螺旋体病疫苗，即使在将所述疫苗在37℃下贮存3个月后，特别是在该温度下贮存9个月后，其仍然有效，至少帮助防止钩端螺旋体细菌感染。
发明概述
为了满足本发明的目的，已根据前文设计了一种组合物，其中所述灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性细胞制剂存在于柠檬酸溶液中(其中术语“酸”包括所述酸的共轭碱)。已经证明，通过使所述抗原存在于该溶液中，所述抗原的稳定性显著提高。在37℃下贮存至少3个月的根据本发明的疫苗，保留了足以提供预防钩端螺旋体细菌感染的近乎完全保护的抗原质量水平。
定义
本发明意义上的疫苗是一种适合应用于动物(包括人类)的构成，包括一种或多种抗原，通常与药学上可接受的载体组合，例如含有水的液体，任选包含免疫刺激剂(佐剂)、盐、缓冲剂、防腐剂、粘度调节剂等，其在施用于动物后诱导免疫应答，用于治疗疾病或病症，即帮助预防、改善或治疗疾病或病症。
载体是用于携载抗原以使其能够以实用形式存在的工具。典型的载体是水或其它亲水性液体，但也常使用固体颗粒(例如用于通过干粉雾化器施用的抗原)。
灭活细菌的细胞制剂是实质上含有灭活细菌细胞的制剂，任选地被进一步处理(其可包括至少部***解细胞)，例如以获得更稳定的或免疫原性更高的制剂。细胞制剂与包含细菌细胞的提取物(例如提取的表面蛋白和/或多糖)的制剂是相对的。
本发明的具体实施方式
在一个具体实施方式中，所述溶液每升包含20mmol的柠檬酸。
在另一个具体实施方式中，所述溶液被缓冲在5至6之间的pH。
在另一个具体实施方式中，所述钩端螺旋体细菌选自问号钩端螺旋体犬血清组Portland-Vere血清变型(Leptospira interrogans serogroupCanicola serovar Portland-Vere)、问号钩端螺旋体澳大利亚血清组布拉迪斯拉发血清变型(Leptospira interrogans serogroup Australis serovarBratislava)、问号钩端螺旋体黄疸出血性血清组哥本哈根血清变型(Leptospira interrogans serogroup lcterohaemorrhagiae serovar Copenhageni)和科氏钩端螺旋体流感伤寒血清组Dadas血清变型(Leptospira kirschneriserogroup Grippotyphosa serovar Dadas)，特别地，所述钩端螺旋体细菌是问号钩端螺旋体澳大利亚血清组布拉迪斯拉发血清变型。
通过将柠檬酸溶解于载体，使柠檬酸用于稳定液体载体中的灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性制剂的用途，特别具体体现下述用途中，其中所述制剂在高于18℃，特别是在37℃下的3个月贮存期间，保留至少25％的其抗原质量(以ELISA单位计，与在2-8℃的温度下贮存的相同制剂相比时)。
实施例
现将基于下列的实施例进一步解释说明本发明。
实施例1：测定存在于可商购的疫苗中的灭活钩端螺旋体抗原在犬中的效力。
实施例2：测定钩端螺旋体抗原在37℃贮存时的稳定性。
实施例3：测定配制在柠檬酸中的钩端螺旋体抗原在37℃贮存时的稳定性。
实施例1
在该第一个实施例中，测定了存在于可商购的疫苗中的灭活钩端螺旋体抗原在常规犬中的效力，所述抗原根据疫苗的标签配制(100％)，或者稀释4倍(25％)。将存在于可商购的疫苗Nobivac L4(可得自于MSDAnimal Health，Boxmeer，荷兰；另参见欧洲药品管理局在2012年5月21日出版的关于Nobivac L4的CVMP意见概要)中的确定浓度的化学灭活的相同类型和血清变型的钩端螺旋体细菌，即问号钩端螺旋体犬血清组Portland-Vere血清变型(犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)；5300ELISA单位/ml)、问号钩端螺旋体澳大利亚血清组布拉迪斯拉发血清变型(布拉迪斯拉发钩端螺旋体(Leptospira Bratislava)；1000ELISA单位/ml)、问号钩端螺旋体黄疸出血性血清组哥本哈根血清变型(黄疸出血性钩端螺旋体(Leptospira icterohaemorrhagiae)；540ELISA单位/ml)和科氏钩端螺旋体流感伤寒血清组Dadas血清变型(流感伤寒钩端螺旋体(Leptospiragrippothyphosa)；1000ELISA单位/ml)配制在10mM pH为7.2的PBS缓冲液(该缓冲液每升水中含有8.9g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.2g KH2PO4)中。将最终的制剂充入3ml小瓶中，用橡胶塞加盖并用铝卷边盖密封。该疫苗在2-8℃贮存(稳定长达39个月)。在该疫苗后，通过将抗原在相同的PBS缓冲液中稀释，达到包含25％的ELISA单位/mL量的终浓度，从而制备稀释的疫苗。按如下对所述疫苗进行测试。
实验动物的饲养
由商业供应商提供六周龄的常规比格犬，其没有可检测到的针对本文上述各钩端螺旋体血清组的凝集血清抗体。在每个研究中，治疗组(n＝8)由两种性别的幼犬和来自不同窝的幼犬组成，以防止干扰治疗效果的性别和窝效应。选定的犬在入选到这些研究前没有临床异常或疾病。在每个研究中的饲养相同。
疫苗接种
在所有研究中，对犬皮下接种两次，在6和1O周龄接种1ml相应的疫苗。
激发
使用的激发菌株是问号钩端螺旋体犬血清组犬血清变型菌株Moulton、问号钩端螺旋体黄疸出血性血清组哥本哈根血清变型菌株CFl(两个菌株均来自National Leptospirosis Reference Centre，KIT BiomedicalResearch，阿姆斯特丹，荷兰)，科氏钩端螺旋体流感伤寒血清组Bananal/Liangguang血清变型菌株11808和问号钩端螺旋体澳大利亚血清组布拉迪斯拉发血清变型菌株As-05-101(两种来自美国农业部，国家动物疾病中心)。对于四个菌株中的每一个，进行下面的程序。实际的激发材料由贮存在液氮中的培养物制备，并在Johnson和Harris改进的Ellinghausen-McCullough培养基(Faine 1994；Clinical Ieptospirosis inhumans，and clinical Ieptospirosis in animals；Leptospira and Leptospirosis，CRC出版社，1994；第1-13、199-225页)中传代两次。贮存在液氮中的培养物是来自实验感染动物的再分离物：菌株CFl和11808是仓鼠肾脏再分离物，菌株Moulton是犬肾脏再分离物，菌株As-05-101是犬尿液再分离物。在所有的研究中，使用两种激发途径的组合：腹膜内(IP)注射(2ml)和结膜滴注(每只眼的腹侧结膜囊内0.25ml)，在第二次接种三周后进行激发。所述激发材料中的细菌细胞浓度(细胞/ml)通过暗视野显微镜下的直接镜检总数测定，并且在0.5至10×109细胞/ml之间。
检验
在每个实验过程中定期检查犬，包括使用皮下应答机测量激发后的体温。在实验过程中，以规律的间隔通过颈静脉穿刺取血液和血清样本，用于血小板计数、细菌培养、PCR和钩端螺旋体抗体分析。通过镜检凝集试验(MAT)针对血清组Canicola、Ictero、Grippo和Australis对血清样品进行分析(Faine 1994)。镜检凝集滴度表示为诱导50％凝集的最高血清稀释度的倒数。使用Cell-Dyn 3500细胞计数器(Abbott Laboratories，雅培公园，伊利诺伊州，美国)，将使用EDTA作为抗凝剂的血液样品用于评估激发后的血小板计数。
使用EDTA或肝素化血液用于从血液再次分离激发生物体，直到激发后21天。出于相同的目的，以规律的间隔通过膀胱穿刺收集尿样，并且对在激发4周后解剖尸体时获取的肾脏组织进行取样，并如此前描述进行处理(Klaasen HLBM，Molkenboer MJCH，Vrijenhoek MP等.Durationof immunity in dogs vaccinated against Ieptospirosis with a bivalentinactivated vaccine.Vet Microbial 2003；95：121-132)。将血液、尿和肾脏组织匀浆的样品接种到EMJH培养基中，并将培养物培育，并如Klaasen描述进行检验。
使用靶向secY基因的实时PCR，检验来自激发后0、3和7天的血清样品中来自激发生物体的DNA的存在。该PCR是得到确认的测定，并且适合检测来自所有致病性钩端螺旋体属种的DNA(Ahmed A，Engelberts MFM，Boer KR等.Development and validation of a real-timePCR for detection of pathogenic Leptospira species in clinical materials.PLoS ONE 2009；4(9)：e7093)。PCR由WHO/FAO/OIE和位于荷兰阿姆斯特丹的National Leptospirosis Reference Centre，KIT Biomedical Research进行。PCR结果记为阳性、疑似或阴性。
将激发后具有严重临床症状的犬人道安乐死。在这些情况下，进行尸体检验，包括组织病理学检查，并且特别注意间质性肾炎的检测[Klaasen 2003]。
感染阳性的犬被定义为具有在不同日的血液(通过培养)或血清(通过PCR)或尿/肾脏(通过培养)的至少两个阳性样品的犬，或者具有激发诱导的肾炎或钩端螺旋体病的临床或血液学证据(血小板减少症)的犬。肾感染阳性的犬(携带动物、持续发生体)的定义是在从激发后14天起具有尿/肾脏的至少一个阳性样品，或者激发诱导的肾炎(经组织病理学检查证实)的犬。
结果
下面是四种疫苗(未稀释和稀释的)的结果。结果显示，即使在25％的稀释度，所述疫苗仍然有助于保护犬预防感染，并保护几乎所有受激发的动物预防肾感染。
表1：犬型激发菌株
疫苗 阳性感染的犬 阳性肾感染的犬
100％犬型 2/8 0/8
25％犬型 1/8 1/8
对照 8/8 8/8
表2：黄疸出血性激发菌株
疫苗 阳性感染的犬 阳性肾感染的犬
100％黄疸出血性 0/7 0/7
25％黄疸出血性 3/7 0/7
对照 7/7 7/7
表3：流感伤寒型激发菌株
疫苗 阳性感染的犬 阳性肾感染的犬
100％流感伤寒型 0/8 0/8
25％流感伤寒型 0/8 0/8
对照 7/8 6/8
表4：布拉迪斯拉发型激发菌株
疫苗 阳性感染的犬 阳性肾感染的犬
100％布拉迪斯拉发型 0/8 0/8
25％布拉迪斯拉发型 0/8 0/8
对照 6/8 1/8
实施例2
灭活的钩端螺旋体细菌在2-8℃稳定至少39个月(可商购疫苗Nobivac L4的标签)。在该实验中，测定了根据实施例1所示(100％疫苗)配制的四种抗原，在三个月期间于37℃贮存时，是否保持至少25％ELISA单位的水平。结果表示如下。所得的抗原质量(三个不同批次的平均值)计算为在2-8℃下贮存的相同疫苗的所得抗原质量的百分比。
表5：与在2-8℃下贮存相比，在37℃下贮存后的AG质量百分比
Ictero Bratislava Grippo Canicola
98 0 66 80
结果显示，黄疸出血性血清组、犬血清组和流感伤寒血清组的灭活全细胞抗原在37℃下相对稳定，但是澳大利亚血清组，布拉迪斯拉发血清变型的抗原高度不稳定，并且没有达到被设置为疫苗有效性的期望标准的至少25％的水平。尽管在室温下，通常为20-25℃，剩余的抗原质量水平可能更高，但是很显然可以对稳定性，特别是布拉迪斯拉发抗原，以及流感伤寒和犬型抗原的稳定性进行改进。
首先，仅用布拉迪斯拉发抗原进行提高稳定性的进一步试验，预期任何显著的改善也将改善其它抗原的稳定性。
实施例3
通过将柠檬酸钠溶解在具有不同pH的制剂中，用柠檬酸配制确定浓度(1000U/ml)的如实施例1所述相同的布拉迪斯拉发抗原。使用第一缓冲液使得pH为5(每升4.1克脱水柠檬酸钠和1.3克柠檬酸一水合物)，且使用第二种缓冲液使得pH为6(每升5.4克脱水柠檬酸钠和0.33克柠檬酸一水合物)。此外，还将这类柠檬酸钠溶解，得到pH 7。作为对照，将抗原置于实施例1提到的PBS缓冲液(pH 7.2)和20mM醋酸盐缓冲液(pH 5；1.99克醋酸钠三水合物和0.32克醋酸)中。达到如下表6所示的终浓度。将这些制剂灌装到3ml玻璃瓶中，用橡胶塞封盖并用铝卷边盖密封。
表6：用于布拉迪斯拉发抗原的稳定性实验的制剂
制剂 次于1000U/ml灭活全细胞布拉迪斯拉发钩端螺旋体的内容物
1 PBS
2 20mM柠檬酸盐，缓冲至pH 5
3 20mM柠檬酸盐，缓冲至pH 6
4 20mM柠檬酸盐，pH 7
5 20mM醋酸盐缓冲液，pH 5
将一半小瓶在2-8℃下培育，同时将另一半在37℃下培育。在3和9个月后，使用抗原质量ELISA试验分析小瓶的布拉迪斯拉发钩端螺旋体抗原。针对参照标准品的抗原质量来测定抗原质量。结果在下表7显示。所得的抗原质量(三个不同小瓶的平均值)计算为在2-8℃下贮存的相同疫苗的所得抗原质量的百分比。
表7：与在2-8℃下贮存相比，在37℃贮存后的AG质量百分比
制剂 贮存3个月 贮存9个月
1 0 0
2 93 未测定
3 93 86
4 47 未测定
5 13 未测定
结果显示，通过向制剂中添加柠檬酸，澳大利亚血清组，布拉迪斯拉发血清变型的灭活细菌抗原的稳定性显著提高。相对于在标准条件下贮存的疫苗，在37℃贮存3个月(以及甚至显著地更长)期间，至少25％的抗原质量的期望标准在各个pH水平都得到满足，尽管5至6之间的pH看起来产生最好的结果。在没有柠檬酸的情况下，照此使用pH 5，没有产生任何可用的结果(制剂5)。可容易地通过常规实验测定柠檬酸的下限：只要在37℃贮存3个月后的稳定性是25％或更高，就满足期望的稳定性标准。可用相同的方式得到上限，尽管制剂的安全性随后也可能成为一个标准。可将需要的安全性水平为任何期望的水平，并且不干扰本发明本身。
考虑到抗原的高度相似性，可合理地预期通过使用相同的方法(将钩端螺旋体抗原加入柠檬酸溶液)，其它灭活细菌性钩端螺旋体抗原的稳定性也将得到提高。对此进行了试验，并将结果显示于关于实施例4的下文中。
实施例4
使用三种不同的柠檬酸浓度(10、20和50mmol/l)，在pH 6下配制确定浓度的如实施例1所述相同的四种钩端螺旋体抗原。作为对照，将抗原置于PBS缓冲液中。将制剂灌装到3ml玻璃瓶中，用橡胶塞封盖并用铝卷边盖密封。
将一半小瓶在2-8℃下培育，同时将另一半在27℃下培育。在8周和9个月后，使用抗原质量ELISA试验分析小瓶的钩端螺旋体抗原。针对参照标准品的抗原质量来测定抗原质量。不同类型抗原的结果显示在下表8、9、10和11中。所得的抗原质量(三个不同小瓶的平均值)计算为在2-8℃下贮存的相同疫苗的所得抗原质量的百分比。
表8：与在2-8℃下贮存相比，在27℃贮存后的布拉迪斯拉发抗原的AG质量百分比
柠檬酸盐浓度[mM] 贮存8周 贮存9个月
10 100 44
20 100 84
50 97 80
0(对照) 75 0
表9：与在2-8℃下贮存相比，在27℃贮存后流感伤寒型抗原的AG质量百分比
柠檬酸盐浓度[mM] 贮存8周 贮存9个月
10 100 100
20 100 100
50 94 94
0(对照) 100 59
表10：与在2-8℃下贮存相比，在27℃贮存后黄疸出血型抗原的AG质量百分比
柠檬酸盐浓度[mM] 贮存8周 贮存9个月
10 97 100
20 100 100
50 100 100
0(对照) 91 98
表11：与在2-8℃下贮存相比，在27℃贮存后犬型抗原的AG质量百分比
柠檬酸盐浓度[mM] 贮存8周 贮存9个月
10 92 100
20 93 98
50 89 82
0(对照) 74 51
结果显示，通过向制剂中添加柠檬酸，各种类型的灭活细菌性钩端螺旋体抗原的稳定性显著提高，与基于布拉迪斯拉发抗原结果的预期相一致。相对于在标准条件下贮存的疫苗，在27℃贮存3个月(以及甚至显著地更长)期间，至少25％的抗原质量的期望标准在各种柠檬酸溶液都得到满足。

Claims (10)

1.一种组合物，其包含在柠檬酸溶液中的灭活钩端螺旋体(Leptospira)细菌的免疫原性细胞制剂。
2.根据权利要求1的组合物，其特征在于，所述溶液每升包含20mmol柠檬酸。
3.根据前面任一项权利要求的组合物，其特征在于，所述溶液被缓冲在5至6之间的pH。
4.根据前面任一项权利要求的组合物，其特征在于，所述钩端螺旋体细菌选自：问号钩端螺旋体犬血清组Portland-Vere血清变型(Leptospirainterrogans serogroup Canicola serovar Portland-Vere)、问号钩端螺旋体澳大利亚血清组布拉迪斯拉发血清变型(Leptospira interrogans serogroupAustralis serovar Bratislava)、问号钩端螺旋体黄疸出血性血清组哥本哈根血清变型(Leptospira interrogans serogroup lcterohaemorrhagiae serovarCopenhageni)和科氏钩端螺旋体流感伤寒血清组Dadas血清变型(Leptospira kirschneri serogroup Grippotyphosa serovar Dadas)。
5.根据权利要求4的组合物，其特征在于，所述钩端螺旋体细菌是问号钩端螺旋体澳大利亚血清组布拉迪斯拉发血清变型。
6.一种保护动物预防钩端螺旋体细菌感染的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含根据前面任一项权利要求所述的组合物。
7.柠檬酸用于稳定液体载体中的灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性制剂的用途，其通过将所述柠檬酸溶于所述载体中。
8.根据权利要求7的用途，其特征在于，所述制剂在高于18℃的温度下的3个月贮存期间，保留至少25％的其抗原质量。
9.根据权利要求7或8的用途，其特征在于，所述制剂在18℃至37℃的温度下的3个月贮存期间，保留至少25％的其抗原质量。
10.根据权利要求7-9任一项的用途，其特征在于，所述制剂在37℃的3个月贮存期间，保留至少25％的其抗原质量。
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