CN104569100A - 基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列 - Google Patents

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本发明涉及一种基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列。该电化学传感器阵列，包括：电极，及修饰在电极表面的BSA稳定的还原石墨烯探针和小牛胸腺DNA功能化的还原石墨烯探针；所述BSA稳定的还原石墨烯探针的浓度与所述小牛胸腺DNA功能化的还原石墨烯探针的浓度相同。该传感器阵列平台，可实现对不同癌细胞，同一癌细胞不同状态如耐药性乳腺癌细胞及转移性乳腺癌细胞样品的区分。设计传感器识别单元与细胞之间的仿生相互作用并将其与超高灵敏度的电化学方法相结合，显著提高了传感器的检测性能，并且可以实现在100个细胞水平上不同类型细胞的区分，检测精确度可以达到100％，对单一类型的癌细胞的检测限可以达到单细胞水平。

Description

基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列
技术领域
本发明涉及一种电化学传感器，具体涉及一种基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列。
背景技术
尽管全世界对癌症的研究投入了大量精力及科研资金，癌症仍然是引起死亡的主要原因之一，并给社会经济带来巨大损失。过去几十年里，虽然发展了许多先进的癌症治疗方法，但是癌症的早期诊断仍然是癌症治疗的关键。在癌症还没有扩散蔓延之前快速诊断和早期干预能够及时控制疾病的发展，不仅可以降低癌症的死亡率，提高病人的生活质量，同时还能减少医疗花费。癌症的早期检测通常是针对肿瘤标识物的分析，它是评估癌症发生发展及药物治疗效果的指示性化学物质，存在于血液、尿液或者人体组织中，可以是特殊的细胞、小分子、基因、酶或激素等。目前，发展癌症早期生物标识物检测的工作主要集中于以下几个方面：寻找更加有效的早期癌症诊断标识物；寻找液态生物标识物以降低取样对病人的侵害性；结合多种有效诊断指标提高癌症诊断的精确度；发展性价比高、响应迅速、灵敏度和选择性高的检测手段用于检测临床以及潜伏期癌症同时对癌症的发展进行预后等。
在过去的几十年中，该领域的研究取得了重大和实质性的进展。各种各样有价值的检测方法被研发出来，它们主要是对细胞内的一些标识物，如细胞内表达失调的RNA或蛋白、或是细胞表面的标识物(如过表达的抗体)等进行特异性识别检测。这些方法包括聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、表面等离子体共振法、微悬臂梁法、生物成像等。然而，筛选特异性配体(如体外指数富集的配基***进化技术，SELEX)及构建特殊的传感器往往耗时长并且价格昂贵，同时还需要对利用到的特异性生物标识物有一定的了解。由于难以找到一个特定的指标能够区分癌细胞之间的差异或者特定的癌细胞和它们的转移状态癌细胞之间的差异，该领域的发展受到了严重限制。因此，亟需发展一种有效的检测平台以区分不同癌细胞及同一癌细胞不同状态，以便为癌症的早期诊断提供更丰富的诊断信息。
发明内容
本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列，该电化学传感器阵列可实现对不同癌细胞，同一癌细胞不同状态的区分，显著提高了传感器的检测性能。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
一种基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列，包括：
电极；
及修饰在电极表面的BSA稳定的还原石墨烯探针；
及修饰在电极表面的小牛胸腺DNA功能化的还原石墨烯探针；
所述BSA稳定的还原石墨烯探针的浓度与所述小牛胸腺DNA功能化的还原石墨烯探针的浓度相同。
在上述技术方案中，所述电极为玻碳电极、ITO或丝网印刷电极。
在上述技术方案中，所述BSA稳定的还原石墨烯探针的浓度与所述小牛胸腺DNA功能化的还原石墨烯探针的浓度均为50μg/mL。
在上述技术方案中，所述BSA稳定的还原石墨烯探针是由下述方法制备：
50μL浓度为1.0mg/mL的氧化石墨烯，250μL水及200μL浓度为50mg/mL的BSA混合，用浓度为1.0M的NaOH将溶液的pH值迅速调到12，溶液在90℃搅拌24小时，溶液颜色由黄褐色逐渐变为黑色，产物12000rpm离心收集后用纯水清洗三次后重新分散到一定量水中。
在上述技术方案中，所述小牛胸腺DNA功能化的还原石墨烯探针是由下述方法制备：
小牛胸腺DNA先在95℃加热1-2小时得到单链的DNA；
10mL浓度为0.5mg/mL的氧化石墨烯与10mL浓度为2mg/mL的单链的DNA混合，加入8μL 85wt％的水合肼，混合溶液在100℃搅拌1小时，产物离心收集用纯水清洗后再分散到一定量的水中。
本发明的有益效果是：
本发明提供的基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列，该传感器阵列平台，可实现对不同癌细胞，同一癌细胞不同状态如耐药性乳腺癌细胞及转移性乳腺癌细胞样品的区分。设计传感器识别单元(即功能化石墨烯探针)与细胞之间的仿生相互作用并将其与超高灵敏度的电化学方法相结合，显著提高了传感器的检测性能。此外，构建的传感器阵列可以实现在100个细胞水平上不同类型细胞的区分，检测精确度可以达到100％，对单一类型的癌细胞的检测限可以达到单细胞水平。本发明报道的基于功能化石墨烯的电化学检测平台为癌症的临床诊断提供了新的方法和思路。
本发明提供的基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列的优点及效果总结如下：
(1)灵敏度高，对单一类型的癌细胞的检测限可以达到单细胞水平；
(2)该电化学传感器阵列能达到100％的细胞区分精确度，能够提供丰富的诊断信息；
(3)可诊断肿瘤种类多，毒副作用小；
(4)检测周期短，可控性强；
(5)所用仪器简单，结果判定直观。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1是修饰电极BSA/CCG和DNA/CCG的电化学阻抗尼奎斯特谱图。
图2是本发明的电化学传感器阵列对5种正常细胞和癌细胞的区分。
图3是本发明的电化学传感器阵列对5种癌细胞的区分。
图4是本发明的电化学传感器阵列用于MCF-7乳腺癌细胞及其转移性和耐药性细胞的检测。
图5是本发明的电化学传感器阵列对不同浓度癌细胞的检测。
图6是MCF-7细胞浓度与判别因子之间的线性关系。
具体实施方式
本发明的发明思想为：
本发明提供的电化学传感器阵列的设计与合成：细胞膜主要由两亲性的磷脂、蛋白质及糖类组成。不同功能的细胞，其细胞膜表面的磷脂、蛋白及糖的构成比例也会不同。不同类型的细胞膜有其独特的组成，表明细胞膜表面的生理化学性质，如电荷、亲疏水性等也会有所不同。这种生理化学性质的差异可以用“化学鼻子”方法进行区分，因为该方法主要依赖于传感器阵列中的多种识别单元与目标细胞之间的选择性作用而产生不同的响应信号。因此，我们利用两种生物分子功能化的石墨烯构建了一个电化学传感器阵列用于不同类型细胞的区分。制备的探针单元与细胞之间有仿生物体系的相互作用，如蛋白-蛋白和蛋白-核酸之间的相互作用。功能化石墨烯复合纳米材料首先修饰到电极表面作为识别探针。当细胞在修饰好的电极表面孵育时，功能化石墨烯探针会与细胞膜表面的磷脂、蛋白及糖类发生不同程度的静电作用及疏水作用。这些作用力能将细胞固定在电极表面，进而转化成超灵敏的电化学阻抗信号。由于不同石墨烯探针本身的电荷及亲疏水性不同，它们与不同细胞表面作用时存在化学作用力上的差异，其组合构成的传感器阵列可视为针对不同细胞的“选择性”探针。每种类型的细胞与传感器阵列作用后都会产生一个特定的信号指纹图案，能够实现细胞的分类与辨别。
下面结合附图对本发明做以详细说明。
本发明提供的基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列，包括：电极，及修饰在电极表面的BSA稳定的还原石墨烯探针和小牛胸腺DNA功能化的还原石墨烯探针；所述BSA稳定的还原石墨烯探针的浓度与所述小牛胸腺DNA功能化的还原石墨烯探针的浓度相同，优选浓度为50μg/mL；所述电极为玻碳电极、ITO或丝网印刷电极。该电化学传感器阵列由下述方法制备：
(1)BSA稳定的还原石墨烯(BSA/CCG)探针的制备：
50μL浓度为1.0mg/mL的氧化石墨烯，250μL水及200μL浓度为50mg/mL的BSA混合，用浓度为1.0M的NaOH将溶液的pH值迅速调到12，溶液在90℃搅拌24小时，溶液颜色由黄褐色逐渐变为黑色，产物12000rpm离心收集后用纯水清洗三次后重新分散到一定量水中。
(2)小牛胸腺DNA(ctDNA)功能化的还原石墨烯(DNA/CCG)探针的制备：
小牛胸腺DNA先在95℃加热1-2小时得到单链的DNA；
10mL浓度为0.5mg/mL的氧化石墨烯与10mL浓度为2mg/mL的单链的DNA混合，加入8μL 85wt％的水合肼，混合溶液在100℃搅拌1小时，产物离心收集用纯水清洗后再分散到一定量的水中。
图1为修饰电极BSA/CCG和DNA/CCG的电化学阻抗尼奎斯特谱图，该谱图反映电极表面电子传递情况，由于生物分子功能化的石墨烯探针自身有一定的电化学阻抗信号，因此将该信号作为背景信号，从测得的样品信号中扣除。
(3)电化学传感器阵列的制备：
直径为3mm的玻碳电极先分别在粒径为1.0、0.3及0.05μm的氧化铝抛光粉末上打磨，每步打磨后电极均在超纯水中超声清洗3分钟。10μL步骤(1)制备的BSA稳定的还原石墨烯探针和10μL步骤(2)制备的小牛胸腺DNA功能化的还原石墨烯探针分散液滴加到预处理过的电极表面，室温下干燥备用。所述的玻碳电极还可以替换为ITO或丝网印刷电极。
用制备的基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列检测细胞：
(1)细胞培养及处理：
细胞在RPMI 1640培养基中培养，培养基中含10％的胎牛血清、青霉素和链霉素(100μg/mL)在潮湿的5％CO2中37℃孵育。培养72小时后，1000rpm离心5分钟收集细胞，用PBS缓冲液清洗两次。将细胞重悬在PBS(pH 7.2)缓冲溶液中，用Petroff-Hausser细胞计数器对细胞进行计数。
(2)检测细胞：
在基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列表面滴加10μL含有100个左右细胞的溶液，37℃孵育30分钟。缓冲液小心清洗电极后，将电极置于电解液中测量阻抗。采用传统的三电极测试体系：辅助对电极铂丝Pt，参比电极Ag/AgCl及经过修饰的玻碳电极作为工作电极，以含10mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1:1)及1M KCl的100mM磷酸盐缓冲液(PBS)作为支持电解液。阻抗图谱的测试频率范围为10-2-105Hz，施加的正弦波振幅电压为5mV。将有细胞存在时测得的阻抗扣除单独石墨烯修饰电极的阻抗得到电化学响应数据。每种细胞都平行测量5次，所得的数据进行线性判别分析(LDA)。
应用实施例1
区分正常细胞和癌细胞：
我们选用了以下5种细胞系进行实验：鼠成纤维细胞NIH-3T3，鼠肾上嗜铬细胞瘤细胞PC-12、人胚肾细胞HEK-293T、乳腺癌细胞MCF-7以及人肺腺癌细胞。为了证实电化学传感器阵列对这5种细胞确实具有区分效果，我们用石墨烯传感器阵列对不同类型细胞的电化学阻抗进行测定，并将阻抗数据用线性判别分析方法进行处理。这种统计分析方法是将数据进行线性组合达到区分两种或两种以上分析物的目的。在电化学响应得出的散点图中，每个点代表单个细胞对传感器阵列的整体响应，不同的细胞聚集形成5组不重叠的数据点(如图2所示)，说明此由两种功能化石墨烯探针组成的简单电化学传感器阵列能够实现不同类型癌细胞的区分，检测精确度可以达到100％。
应用实施例2
区分不同的癌细胞：
用传感器阵列对5种类型的人癌细胞：A549(肺)、HeLa(子宫颈)、HepG2(肝脏)、K562(白血病)、MCF-7(乳腺)进行了检测区分。五种癌细胞显示出截然不同的电化学阻抗响应信号，线性判别分析得到的两个变化因数分别为68.66％和31.34％，如图3所示。在电化学响应散点图中，不同类型的细胞聚集形成五个互不重叠的数据组，表明本发明的电化学传感器阵列能够根据细胞表面的生理化学性质差异完全区分这五种癌细胞。
应用实施例3
区分乳腺癌细胞、耐药性乳腺癌细胞及转移性乳腺癌细胞：
我们选用了三种人乳腺癌细胞用于考察构建的传感器在区分同一癌细胞不同状态的应用，它们分别是MCF-7乳腺癌细胞、MDA-MB-231转移乳腺癌细胞、MF-7/ADR耐药性乳腺癌细胞。三种癌细胞显示出截然不同的电化学阻抗响应信号，线性判别分析得到的两个变化因数分别为63.63％和36.37％，如图4所示。在电化学响应散点图中，不同类型的细胞聚集形成三个互不重叠的数据组，表明本发明的电化学传感器阵列能够根据细胞表面的生理化学性质差异完全区分三种癌细胞。
应用实施例4
对癌细胞进行定量检测：
临床癌症诊断应用不仅要求对癌细胞进行定性检测，同时还需要定量检测。我们以MCF-7细胞为模型测定了不同浓度的癌细胞的电化学阻抗。结果表明，不同浓度的细胞聚集形成互不重叠的数据组(图5)，判别因子与浓度之间成线性关系(图6)，本发明的电化学传感器阵列可以实现单细胞水平的癌细胞检测。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (5)

1.一种基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列，其特征在于，包括：
电极；
及修饰在电极表面的BSA稳定的还原石墨烯探针；
及修饰在电极表面的小牛胸腺DNA功能化的还原石墨烯探针；
所述BSA稳定的还原石墨烯探针的浓度与所述小牛胸腺DNA功能化的还原石墨烯探针的浓度相同。
2.根据权利要求1所述的基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列，其特征在于，所述电极为玻碳电极、ITO或丝网印刷电极。
3.根据权利要求1所述的基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列，其特征在于，所述BSA稳定的还原石墨烯探针的浓度与所述小牛胸腺DNA功能化的还原石墨烯探针的浓度均为50μg/mL。
4.根据权利要求1所述的基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列，其特征在于，所述BSA稳定的还原石墨烯探针是由下述方法制备：
50μL浓度为1.0mg/mL的氧化石墨烯，250μL水及200μL浓度为50mg/mL的BSA混合，用浓度为1.0M的NaOH将溶液的pH值迅速调到12，溶液在90℃搅拌24小时，溶液颜色由黄褐色逐渐变为黑色，产物12000rpm离心收集后用纯水清洗三次后重新分散到一定量水中。
5.根据权利要求1所述的基于功能化石墨烯的电化学传感器阵列，其特征在于，所述小牛胸腺DNA功能化的还原石墨烯探针是由下述方法制备：
小牛胸腺DNA先在95℃加热1-2小时得到单链的DNA；
10mL浓度为0.5mg/mL的氧化石墨烯与10mL浓度为2mg/mL的单链的DNA混合，加入8μL 85wt％的水合肼，混合溶液在100℃搅拌1小时，产物离心收集用纯水清洗后再分散到一定量的水中。
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