CN104567659A - 一种基于涡旋光照明的暗场数字全息显微装置及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于涡旋光照明的暗场数字全息显微装置及其方法。装置包括激光器、分光棱镜I、分光棱镜II、平面反射镜、显微物镜空间滤波器、显微物镜I、傅里叶透镜、光阑、分光棱镜III、空间光调制器、暗场显微物镜、小球样本、显微物镜II、分光棱镜IV和光电耦合器件。实现方法分为三步，首先利用涡旋光入射到暗场显微物镜后形成的环形光锥照明物体，接着，数字全息技术将物体的散射光与参考光的干涉条纹通过光电耦合器件记录到计算机中，最后再利用数字重构技术重构出物体的像。与传统的明场数字全息显微成像方法相比，本发明具有高分辨率和高对比度等优势，适用于实验室中研究涡旋光束的性质、观察微小相位物体等领域。

Description

一种基于涡旋光照明的暗场数字全息显微装置及其方法

技术领域

本发明涉及一种暗场数字全息技术记录涡旋光照明时小球的散射光与球面波参考光的干涉条纹，具体涉及一种基于涡旋光照明的暗场数字全息显微装置及其方法，属于数字全息技术领域。

背景技术

数字全息技术是计算机技术和传统光学全息相结合的产物，采用数字化的记录和再现方法，能够较为方便地获取物体的振幅信息和相位信息，数字全息是用光电传感器件(如CCD或CMOS)代替干板记录全息图，然后将全息图存入计算机，用计算机模拟光学衍射过程来实现被记录物体的全息再现和处理。数字全息与传统光学全息相比具有制作成本低，成像速度快，记录和再现灵活等优点。近年来，随着计算机技术特别是高分辨率CCD制造加工工艺的发展，数字全息技术及其应用受到越来越多的关注，其应用范围已涉及形貌测量、变形测量、粒子场测试、数字显微、防伪、三维图像识别、医学诊断等诸多领域。

人们在数字全息技术的基础上提出了一种暗场数字全息显微成像技术。相对于明场数字全息显微成像技术而言，暗场数字全息显微成像技术不仅可以增强显微成像的对比度，而且还可以提高成像的分辨率。因此，它可以很好地弥补明场显微成像技术的不足。Dubois等人从实验角度验证了暗场数字全息显微成像技术可以提高成像的分辨率。Faridian等人在暗场数字全息显微成像技术中引入了变化的散斑场照明，通过多幅全息再现叠加取均值的方法克服了散斑噪声，增强了显微成像的对比度，同样也提高了成像分辨率。以上几种暗场数字全息显微成像***中均是通过采用制作特定尺寸的圆形掩膜或者利用环形反射镜，将扩束后的高斯光整形成环形光作为物体的照明光，使之匹配暗场显微物镜。然而，高斯光束的能量主要集中在光斑中心区域，上述这些方法均只保留了其边缘环形部分，丢失大部分能量，致使照明光的强度减弱；而且，这些方法产生的照明光在传播过程中衍射产生旁瓣相对较强，容易受到管镜内壁的反射产生杂散光，使得成像时产生背景噪声；同时，在对微小物体成像时产生较强的衍射效应。以上这些因素的存在降低了***成像的对比度和分辨率。

发明内容

为了克服以上现有技术的缺点，本发明提供了一种基于涡旋光照明的暗场数字全息显微装置及其方法，可以有效地提高数字全息***的分辨率，增强再现像的对比度。

本发明的实现分为三步，首先利用涡旋光入射到暗场显微物镜后形成的环形光锥照明物体，接着，数字全息技术将物体的散射光与参考光的干涉条纹通过光电耦合器件(CCD或CMOS)记录到计算机中，最后再利用数字重构技术重构出物体的像。

本发明装置采用的技术方案如下：

一种基于涡旋光照明的暗场数字全息显微装置，包括激光器、分光棱镜I、分光棱镜II、平面反射镜、显微物镜空间滤波器、显微物镜I、傅里叶透镜、光阑、分光棱镜III、空间光调制器、暗场显微物镜、小球样本、显微物镜II、分光棱镜IV和光电耦合器件；其中，激光器出射的激光照射在分光棱镜I上，两者的距离为0.15-0.2m；分光棱镜I、分光棱镜II、分光棱镜III和分光棱镜IV在光学平台上构成一个矩形光路：分光棱镜I与分光棱镜II在同一条水平线上，两者的距离为1.00-1.10m；分光棱镜I与分光棱镜III在同一条垂直线上，分光棱镜III与分光棱镜IV在同一条水平线上，分光棱镜II与分光棱镜IV在同一条垂直线上；

分光棱镜I与分光棱镜III之间依次设有显微物镜空间滤波器、傅里叶透镜和光阑，傅里叶透镜的前焦面位于显微物镜空间滤波器的出瞳位置，显微物镜空间滤波器与分光棱镜I之间的距离为0.15-0.20m，光阑与傅里叶透镜之间的距离为0.05-0.08m，光阑与分光棱镜III之间的距离为0.08-0.15m；所述空间光调制器设置在分光棱镜III的后方，两者之间的距离为0.15-0.20m；

分光棱镜III与分光棱镜IV之间依次设有暗场显微物镜、小球样本和显微物镜II，小球样本位于暗场显微物镜的后焦面上，显微物镜II的前焦面和小球样本平面重合，暗场显微物镜与分光棱镜III之间的距离为0.25-0.30m；所述光电耦合器件设置在分光棱镜IV的后方并与小球样本为物像共轭关系，光电耦合器件与分光棱镜IV之间的距离为0.1-0.2m；

分光棱镜II与分光棱镜IV之间设有显微物镜I，显微物镜I与分光棱镜II之间的距离为0.15-0.20m；所述平面反射镜设置在分光棱镜II的后方，两者的距离为0.15-0.20m。

本发明利用上述装置的方法，包括如下步骤：

A、搭建所述数字全息显微装置，打开激光器、空间光调制器和光电耦合器件的电源；

B、激光器发出的激光通过分光棱镜I后分为水平和垂直两束，水平一路激光依次通过分光棱镜II和平面反射镜反射到显微物镜I中；垂直一路激光由显微物镜空间滤波器扩束滤波后由高斯光束变为球面波，球面波经傅里叶透镜准直变成平面波；

C、由傅里叶透镜射出的平面波光束依次通过光阑、分光棱镜III到达空间光调制器的表面；

D、利用电脑驱动，在空间光调制器上加载一幅叉形光栅，以调制出涡旋光，由空间光调制器调制成的涡旋光经过分光棱镜III的反射，到达暗场显微物镜中；

E、涡旋光经过暗场显微物镜会聚后的环形光锥照明小球样本，得到的小球的散射光被显微物镜II接收成像在光电耦合器件表面，这一路为物光；

F、由显微物镜I发散的球面波经过分光棱镜IV的反射后到达光电耦合器件的表面，这一路为参考光；

G、在光电耦合器件表面，物光和参考光干涉产生干涉条纹，调节分光棱镜IV对参考光束的反射角度，使物光和参考光夹角合适，光电耦合器件表面上出现的干涉条纹均匀稳定，并使用电脑驱动光电耦合器件将干涉条纹记录到磁盘驱动器；

H、将光电耦合器件记录的干涉条纹，即全息图，读入MATLAB软件中，具体流程如下：a)频谱获取：对全息图进行傅里叶变换，得到频域中全息图的正一级或者负一级频谱；b)频谱分离：为了消除零级项和共轭项的干扰，采用频域滤波的方式提取频域中正一级频谱或者负一级频谱；c)数字再现：在MATLAB软件中对提取出来的频谱进行逆傅里叶变换得到物光波的复振幅；d)瑞利判据：根据瑞利判据，判定小球样本中相邻的小球分辨情况，得到能够判定或者不能判定的结论，如果能判定出相邻的两个或多个小球则说明该***分辨率达到或超过小球样本中小球的直径，如果不能判定出相邻的两个或多个小球则说明该***分辨率无法达到小球样本中小球的直径；

I、更换不同尺寸直径的小球样本，重复G-H步骤，测定出该***的最高分辨率。

本发明以数字全息技术手段，利用涡旋光环形照明原理和暗场显微成像原理，采用直径为690nm的聚苯乙烯小球作为实验样品，使用改进型马赫曾德干涉仪获取小球散射光与球面波参考光的干涉图样，然后在计算机中进行数值计算获得小球的再现像；与传统的明场数字全息显微成像方法相比，本发明具有高分辨率和高对比度等优势，适用于实验室中研究涡旋光束的性质、观察微小相位物体等领域。本发明的有益效果在于：

(1)通过本发明的实施，在其他实验器件不足或受限的情况下，可以利用实验室中常见的激光器、分光棱镜、暗场显微物镜、反射镜及光电耦合器件等就可以观察微小相位物体，为进一步观察并研究微小相位物体提供便利；

(2)本发明可以形成暗背景下的亮物体的像，从而提高物体成像的对比度；

(3)由于暗场成像携带信息是物体的高频信息，利用本发明使得物体的成像分辨率得到有效地提高。通过对物体明暗场下数字全息显微再现像的分析对比，证明本发明的方法可以有效地提高数字全息***的分辨率，增强再现像的对比度。

附图说明

图1为本发明的实验装置图；

其中，1-激光器，2-分光棱镜I，3-分光棱镜II，4-平面反射镜，5-显微物镜空间滤波器，6-显微物镜I，7-傅里叶透镜，8-光阑，9-分光棱镜III，10-空间光调制器，11-暗场显微物镜，12-小球样本，13-显微物镜II，14-分光棱镜IV，15-光电耦合器件。

图2为空间光调制器上加载的叉形光栅图样。

图3为涡旋光的光强分布。

图4为暗场显微物镜成像示意图；其中，16-涡旋光，17-散射光。

图5为小球样本数字全息再现结果，其中，图(a)为小球明场全息图；图(b)为(a)中白色框部分中小球明场的全息图放大图；图(c)为白色框部分中小球明场的全息图再现像；图(d)为小球暗场全息图；图(e)为(d)中白色框部分中小球暗场全息图放大图；图(f)白色框部分中小球暗场全息图再现像。

图6为瑞利判据结果，a)为明场小球再现像沿图5(c)中白色虚线方向的强度曲线图，b)为暗场小球再现像沿图5(f)中白色虚线方向的强度曲线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步说明。

如图1所示，本发明的装置包括激光器1、分光棱镜I 2、分光棱镜II 3、平面反射镜4、显微物镜空间滤波器5、显微物镜I 6、傅里叶透镜7、光阑8、分光棱镜III 9、空间光调制器10、暗场显微物镜11、小球样本12、显微物镜II 13、分光棱镜IV 14和光电耦合器件15。

其中，激光器1在水平方向距分光棱镜I 2为0.18m；分光棱镜II 3在水平方向距分光棱镜I 2为1.05m；平面反射镜4在水平方向距分光棱镜II 3为0.18m；显微物镜空间滤波器5在垂直方向距分光棱镜I 2为0.16m；显微物镜I6在垂直方向距分光棱镜II 3为0.17m；傅里叶透镜7的前焦面恰好位于显微物镜空间滤波器5的出瞳位置；光阑8在垂直方向距傅里叶透镜7为0.07m；分光棱镜III 9在垂直方向距光阑8为0.12m；空间光调制器10在垂直方向距分光棱镜III 9为0.18m；平面反射镜4与分光棱镜II 3的距离和空间光调制器10与分光棱镜III 9的距离相等；暗场显微物镜11在水平方向距分光棱镜III 9为0.28m；小球样本12应放置在暗场显微物镜11的后焦面上；显微物镜II 13的前焦面应和小球样本12平面重合；分光棱镜I 2与分光棱镜II 3在同一条水平线上，分光棱镜I 2与分光棱镜III 9在同一条垂直线上，分光棱镜III 9与分光棱镜IV 14在同一条水平线上，分光棱镜II 3与分光棱镜IV 14在同一条垂直线上，分光棱镜I 2、分光棱镜II 3、分光棱镜III 9和分光棱镜IV 14在光学平台上构成一个矩形光路；光电耦合器件15在分光棱镜IV 14水平向右方向为0.15m；光电耦合器件15和小球样本12为物像共轭关系。

其中，本发明的装置的各元件参数为：激光器1的波长532.8nm；显微物镜空间滤波器5的放大倍率20×，针孔尺寸15μm；显微物镜I 6的放大倍率20×，针孔尺寸15μm；暗场显微物镜11的放大倍率20×，N.A.为0.45；显微物镜II 13的放大倍率是20×，N.A.为0.4；傅里叶透镜7的焦距是80mm；分光棱镜的分光比是50：50；空间光调制器10是德国HOLOEYE公司的PLUTO系列；光电耦合器件15是DMK23U445，1280×960Y80030fps，CCD。

在图1中，激光从激光器1出射后经过分光棱镜I 2分为反射光和透射光，分别成为物光和参考光两路。其中，物光一路经过显微物镜空间滤波器5和傅里叶透镜7进行先扩束后准直变成平面波，该平面波经过分光棱镜III 9后到达空间光调制器10表面上再反射回分光棱镜III 9上，分光棱镜III 9将空间光调制器10调制出的涡旋光16反射进入暗场显微物镜11的环形孔径中，形成中空的环形光锥，环形光锥照明物体后，物体被照明后产生的高频散射光17被显微物镜II 13接收(如图4所示)，透射过分光棱镜IV 14成像于光电耦合器件15表面。

利用电脑驱动空间光调制器10，在图1中所示的空间光调制器10中加载一幅叉形光栅图样，该叉形光栅图样可利用螺旋相位板叠加闪耀光栅的方法获得(如图2所示)。

涡旋光束的产生方法有利用螺旋相位板法、特殊设计的合成计算全息光栅法以及利用空间光调制器产生等，如本发明中，通过在空间光调制器10上，加载不同的叉形光栅可以方便地产生不同拓扑电荷数l的涡旋光16。

图3是涡旋光16的光强分布，拉盖尔高斯涡旋光是一种具有螺旋型相位分布和确定光子轨道角动量的光波，它的强度分布为一环形结构，它不仅具有空间光强形状不变特性，而且具有准无衍射特性。一束拉盖尔高斯涡旋光可以看成由无数具有稳定特性的涡旋点组成，这些涡旋点被样品散射后仍保持自身的性质存在于散射光中。

参考光路中使用分光棱镜II 3和平面反射镜4对物光路中分光棱镜III 9到空间光调制器10间的光程进行了相应地补偿；经显微物镜I 6扩束将参考光变为球面波，再通过分光棱镜IV 14和物光在光电耦合器件15表面进行干涉。

此时，本发明装置的两路光束通过分光棱镜IV 14合束后在光电耦合器件15表面产生了干涉条纹，使用CCD将干涉条纹记录到计算机中。

将CCD采集的全息图读入MATLAB软件中，对其做傅里叶变换，取出频谱中的正一级，再对提取出来的信息做逆傅里叶变换得到物光波的复振幅。具体流程如下所示：

1.频谱获取：对全息图进行傅里叶变换，得到频域中全息图的正一级或者负一级频谱；

2.频谱分离：为了消除零级项和共轭项的干扰，采用频域滤波的方式提取频域中正一级(或者负一级)频谱；

3.数字再现：在MATLAB软件中对提取出来的频谱进行逆傅里叶变换得到物光波的复振幅；

4.再现像的对比：通过对小球样本12明暗场下数字全息显微再现像的分析对比，根据瑞利判据，如图6所示，判定小球样本12中相邻的聚苯乙烯小球分辨情况，得到能够判定或者不能判定的结论，如果能判定出相邻的两个或多个小球则说明该***分辨率达到或超过小球样本12中聚苯乙烯小球的直径，如果不能判定出相邻的两个或多个小球则说明该***分辨率无法达到小球样本12中聚苯乙烯小球的直径。证明该方法可以有效地提高数字全息***的分辨率，增强再现像的对比度。

此外，暗场数字全息显微技术使用物体散射光17和参考光建立固定的相位差关系，从而获得稳定的干涉条纹。物体经过暗场显微放大后，像面位于CCD的记录面上，即物光O；利用马赫曾德干涉光路，在参考光路中用一束球面波作为参考光R，与物光O于CCD处干涉，生成暗场像面数字全息图，则全息图的表达为

H＝|O+R|²＝|O|²+|R|²+R^*O+RO^*  (1)

由(1)式可见，前两项是全息图的零级项，第三、四两项则是全息图的正负一级项，而第三项是正比于物光O的实像。

在暗场数字全息再现过程中，由于物光波直接成像聚集在全息记录面上，因此再现时，再现像不需要计算空间衍射传播，而是直接位于全息面上。但为了消除零级项和共轭项的干扰，采用频域滤波的方式提取频域中正一级(或者负一级)频谱，再对其进行逆傅里叶变换得到物光波的复振幅，即表达式如下：

O₁＝FT^-1[FT_fil(H)]  (2)

其中，FT和FT^-1分别代表傅里叶变换和逆傅里叶变换；角标“fil”表示频谱滤波。

涡旋光16是一种具有螺旋型相位分布和确定光子轨道角动量的光波，它的强度分布为一环形结构。利用其特殊的光强结构作为物光部分的照明光源，并根据暗场显微物镜的孔径选择合适的涡旋光16拓扑电荷数。实验中所使用的多为拉盖尔高斯涡旋光，其源平面上的光束表达式为：

其中_，l是拓扑电荷数，σ是高斯光斑大小参数，E₀为常数，ρ₀和θ₀是源平面上的极坐标，z＝0对应于源平面。在传输一段距离z后，拉盖尔高斯涡旋光可表示为

其中，ρ₁和θ₁为观察面上点的极坐标，参数σ'²＝σ²(1+4z²/k²σ⁴)，通过对比(4)式可以看出，参数σ'的意义等同于σ，可以表征观察面上高斯光斑的尺寸。然而，由于涡旋相位奇点的存在，涡旋光16的光强不再是高斯分布，而是呈环带结构，采用传统的光斑半径描述不再适合，因此，将其横截面上最亮的圆周半径定义为涡旋光16的光斑尺寸，则通过涡旋光16光强表达式对ρ₁进行求导，便可得到涡旋光16光斑尺寸表达式：

${\mathrm{\ρ}}_b=\sqrt{\frac{\left|l\right|}{2}}{\mathrm{\σ}}^{\′}=\sqrt{\frac{\left|l\right|}{2}}\sqrt{{\mathrm{\σ}}^2(1+\frac{{4z}^2}{k^2{\mathrm{\σ}}^4})}---\left(5\right)$

由(5)式可知，原始高斯光斑σ一定时，涡旋光16的光斑大小与拓扑电荷数和传播距离有关，会随着传播距离增加而展宽，而展宽比例跟拓扑电荷绝对值的平方根成正比。本发明实验中当衍射距离固定时，改变叉形光栅拓扑电荷数，产生不同尺寸的涡旋光16。

根据暗场显微物镜11的孔径尺寸，选择适当的衍射距离和拓扑电荷数，以保证涡旋光16可以完全进入；涡旋光16入射到暗场显微物镜11中，形成中空的环形光锥，环形光锥照明物体后，携带物体低频信息的环形光锥沿着原先的方向斜射出去，且并未通过显微物镜II 13(显微物镜II 13数值孔径小于暗场显微物镜11数值孔径)，而物体被照明后产生的高频散射光17，被显微物镜II 13接收并用于物体的成像，因此，可以形成暗背景下的亮物体的像，从而提高物体成像的对比度；另外，由于暗场成像携带信息是物体的高频信息，使得物体的成像分辨率得到有效地提高。

Claims (5)

1.一种基于涡旋光照明的暗场数字全息显微装置，其特征在于：所述数字全息显微装置包括激光器(1)、分光棱镜I(2)、分光棱镜II(3)、平面反射镜(4)、显微物镜空间滤波器(5)、显微物镜I(6)、傅里叶透镜(7)、光阑(8)、分光棱镜III(9)、空间光调制器(10)、暗场显微物镜(11)、小球样本(12)、显微物镜II(13)、分光棱镜IV(14)和光电耦合器件(15)；其中，

激光器(1)出射的激光照射在分光棱镜I(2)上，两者的距离为0.15-0.2m；分光棱镜I(2)、分光棱镜II(3)、分光棱镜III(9)和分光棱镜IV(14)在光学平台上构成一个矩形光路：分光棱镜I(2)与分光棱镜II(3)在同一条水平线上，两者的距离为1.00-1.10m；分光棱镜I(2)与分光棱镜III(9)在同一条垂直线上，分光棱镜III(9)与分光棱镜IV(14)在同一条水平线上，分光棱镜II(3)与分光棱镜IV(14)在同一条垂直线上；

分光棱镜I(2)与分光棱镜III(9)之间依次设有显微物镜空间滤波器(5)、傅里叶透镜(7)和光阑(8)，傅里叶透镜(7)的前焦面位于显微物镜空间滤波器(5)的出瞳位置，显微物镜空间滤波器(5)与分光棱镜I(2)之间的距离为0.15-0.20m，光阑(8)与傅里叶透镜(7)之间的距离为0.05-0.08m，光阑(8)与分光棱镜III(9)之间的距离为0.08-0.15m；所述空间光调制器(10)设置在分光棱镜III(9)的后方，两者之间的距离为0.15-0.20m；

分光棱镜III(9)与分光棱镜IV(14)之间依次设有暗场显微物镜(11)、小球样本(12)和显微物镜II(13)，小球样本(12)位于暗场显微物镜(11)的后焦面上，显微物镜II(13)的前焦面和小球样本(12)平面重合，暗场显微物镜(11)与分光棱镜III(9)之间的距离为0.25-0.30m；所述光电耦合器件(15)设置在分光棱镜IV(14)的后方并与小球样本(12)为物像共轭关系，光电耦合器件(15)与分光棱镜IV(14)之间的距离为0.1-0.2m；

分光棱镜II(3)与分光棱镜IV(14)之间设有显微物镜I(6)，显微物镜I(6)与分光棱镜II(3)之间的距离为0.15-0.20m；所述平面反射镜(4)设置在分光棱镜II(3)的后方，两者的距离为0.15-0.20m。

2.如权利要求1所述的一种基于涡旋光照明的暗场数字全息显微装置，其特征在于：所述平面反射镜(4)与分光棱镜II(3)的距离和空间光调制器(10)与分光棱镜III(9)的距离相等。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于涡旋光照明的暗场数字全息显微装置，其特征在于：所述小球样本(12)采用直径为690nm的聚苯乙烯小球。

4.利用如权利要求1所述基于涡旋光照明的暗场数字全息显微装置的方法，其特征在于：该方法具体步骤如下：

A、搭建所述数字全息显微装置，打开激光器(1)、空间光调制器(10)和光电耦合器件(15)的电源；

B、激光器(1)发出的激光通过分光棱镜I(2)后分为水平和垂直两束，水平一路激光依次通过分光棱镜II(3)和平面反射镜(4)反射到达显微物镜I(6)中；垂直一路激光由显微物镜空间滤波器(5)扩束滤波后由高斯光束变为球面波，球面波经傅里叶透镜(7)准直变成平面波；

C、由傅里叶透镜(7)射出的平面波依次通过光阑(8)、分光棱镜III(9)到达空间光调制器(10)的表面；

D、利用电脑驱动，在空间光调制器(10)上加载一幅叉形光栅，以调制出涡旋光(16)，由空间光调制器(10)调制成的涡旋光(16)经过分光棱镜III(9)的反射，到达暗场显微物镜(11)中；

E、涡旋光(16)经过暗场显微物镜(11)会聚后的环形光锥照明小球样本(12)，得到的小球的散射光被显微物镜II(13)接收，成像在光电耦合器件(15)表面，这一路为物光；

F、由显微物镜I(6)射出的球面波光束经过分光棱镜IV(14)的反射后到达光电耦合器件(15)的表面，这一路为参考光；

G、在光电耦合器件(15)表面，物光和参考光发生干涉，产生干涉条纹，调节分光棱镜IV(14)对参考光束的反射角度，使物光和参考光夹角合适，光电耦合器件(15)表面上出现的干涉条纹均匀稳定，并使用电脑驱动光电耦合器件(15)将干涉条纹记录到磁盘驱动器；

H、将光电耦合器件(15)记录的干涉条纹，即全息图，读入MATLAB软件中，具体流程如下：

a)频谱获取：对全息图进行傅里叶变换，得到频域中全息图的正一级或者负一级频谱；b)频谱分离：为了消除零级项和共轭项的干扰，采用频域滤波的方式提取频域中正一级频谱或者负一级频谱；c)数字再现：在MATLAB软件中对提取出来的频谱进行逆傅里叶变换得到物光波的复振幅；d)瑞利判据：根据瑞利判据，判定小球样本(12)中相邻的小球分辨情况，得到能够判定或者不能判定的结论，如果能判定出相邻的两个或多个小球则说明该***分辨率达到或超过小球样本(12)中小球的直径，如果不能判定出相邻的两个或多个小球则说明该***分辨率无法达到小球样本(12)中小球的直径；

I、更换不同尺寸直径的小球样本(12)，重复G-H步骤，测定出该***的最高分辨率。

5.根据权利要求4所述基于涡旋光照明的暗场数字全息显微装置的方法，其特征在于：所述小球样本(12)采用直径为690nm的聚苯乙烯小球。