CN104561162A - 一种发酵制备赖氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵制备赖氨酸的方法，该方法包括：将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵以生成赖氨酸，所述发酵过程包括菌种生长阶段和菌种产酸阶段，在菌种生长阶段的发酵温度为30-38℃，在菌种产酸阶段的发酵温度为32-42℃，且在菌种生长阶段的发酵温度低于在菌种产酸阶段的发酵温度。采用上述技术方案来生产赖氨酸，有效地提高了产赖氨酸浓度和发酵转化率，并且缩短了发酵周期、降低了能耗。

Description

一种发酵制备赖氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵制备赖氨酸的方法，具体地，涉及一种在发酵过程中分阶段控制发酵温度的发酵制备赖氨酸的方法。

背景技术

赖氨酸又称2，6-二氨基己酸，分子式为C₆H₁₄O₂N₂，是白色或近白色自由流动的结晶性粉末，易溶于水，几乎无臭。通常性质稳定，高温下易结块，碱性条件下加热易分解。赖氨酸还是人体必需的八种基本氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。赖氨酸分为L型（左旋）和D型（右旋），只有L型能被生物利用。目前，赖氨酸已成为全球第二大氨基酸工业，主要作为营养强化剂、鲜味剂、甜味剂、氨基酸衍生物，氨基酸盐等用于饲料行业、食品行业和医药行业。其中，90%的L-赖氨酸的用于饲料工业，10%用于食品和医药行业。

1950年以前，由于赖氨酸生物合成途径没有充分被阐明，赖氨酸的生产大多采用抽提法、化学合成法和酶法。1960年日本的木下祝郎等学者用紫外线照射谷氨酸棒杆菌得到一株营养缺陷性变异株，从此工业上开始使用发酵法生产赖氨酸。随后，其它生产赖氨酸的方法逐渐被发酵法所替代。目前，全世界90%以上企业采用发酵法生产赖氨酸。

CN102533891A公开了一种赖氨酸的生产方法，该方法将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵培养，在发酵培养15小时后，向发酵液中流加氯化钾、硫酸镁和硫酸锰等营养盐。CN102533890A公开了一种赖氨酸的生产方法，该方法将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氮源的条件下进行发酵培养，在发酵培养30小时后至发酵培养48小时内，向发酵液中补加赖氨酸发酵菌种。CN1928104公开了一种赖氨酸发酵液的二次发酵技术，该技术通过将发酵结束的赖氨酸发酵液调至适当的pH，然后向其中添加培养好的酵母，进行二次发酵，结果降低了残糖，改善了发酵液粘度，同时改善了赖氨酸结晶粒度和色泽。CN101104863公开了一种赖氨酸发酵方法，该方法包括如下步骤：将菌种从斜面试管到大种子瓶培养9-11小时后移到二级种子罐，种量为0.2-0.3%，培养温度为38-40℃，培养时间为15-17小时；然后移入三级种子罐，种量5-6%，培养9-11小时后移入发酵罐中进行发酵。

但上述发酵制备赖氨酸的方法，产赖氨酸浓度和发酵转化率均较低，并且能耗较高。

发明内容

本发明的目的在于克服采用现有技术产赖氨酸浓度和发酵转化率均较低，以及能耗高的缺点，提供一种发酵制备赖氨酸的方法，以提高产赖氨酸浓度和发酵转化率，并降低能耗。

本发明的发明人发现，采用现有技术发酵制备赖氨酸，产赖氨酸浓度和发酵转化率均较低，以及能耗高的原因在于，现有技术在整个发酵过程中均是在相同的温度下进行，或是将发酵温度控制在一定的范围内，或是在发酵前期的温度控制在比发酵后期较高的水平上，例如，经典的赖氨酸发酵工艺。

本发明的发明人却意外地发现，将赖氨酸发酵过程中发酵菌种前期的生长阶段的温度先控制在较低的水平，然后再在后期的产酸阶段将温度控制在较高的水平，这样虽然不能使发酵菌种在发酵前期进行大量生长，但本发明的发明人却惊奇的发现，这种状态下的发酵菌种在进入产酸期后其发酵水平却得到了显著的提高。这主要是：一方面，菌种的快速生长在一定程度上得到了抑制，而会在正常水平上进行生长，使其进入产酸期后更倾向于产酸，从而使得其用于自身生长的营养物质减少，使得用于产酸的营养物质得到了提高，因此，能够提高糖酸转化率；另一方面，在进入大量产酸阶段后适当提高发酵温度，在保证溶氧量的前提下，更有利于用于产酸的酶***发挥作用，从而使得产酸量增加。

基于以上发现，本发明提供了一种发酵制备赖氨酸的方法，该方法包括，将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵以生成赖氨酸，所述发酵过程包括菌种生长阶段和菌种产酸阶段，在菌种生长阶段的发酵温度为30-38℃，在菌种产酸阶段的发酵温度为32-42℃，且在菌种生长阶段的发酵温度低于在菌种产酸阶段的发酵温度。

优选地，在菌种生长阶段的发酵温度比在菌种产酸阶段的发酵温度低0.5-5℃。

优选的，该方法还包括，在所述发酵的过程中向发酵培养基中加入碱性物质的步骤。

采用上述技术方案来生产赖氨酸，有效地提高了产赖氨酸浓度和发酵转化率，并且降低了能耗。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种发酵制备赖氨酸的方法，该方法包括，一种发酵制备赖氨酸的方法，该方法包括，将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵以生成赖氨酸，所述发酵过程包括菌种生长阶段和菌种产酸阶段，在菌种生长阶段的发酵温度为30-38℃，在菌种产酸阶段的发酵温度为32-42℃，且在菌种生长阶段的发酵温度低于在菌种产酸阶段的发酵温度。

本发明中，术语“菌种生长阶段”是指将赖氨酸发酵菌种接种至发酵培养基中开始至赖氨酸的生成速率达到5g/L/h时的发酵时间段，“菌种产酸阶段”是指赖氨酸的生成速率大于5g/L/h时至发酵结束时的发酵时间段。根据本发明的发明人的实际经验，当将赖氨酸发酵菌种接种至发酵培养基中开始至发酵12小时时，赖氨酸的生成速率可达到5g/L/h，因此，在实际的操作过程中，还可以以此时间点作为菌种生长阶段和产酸阶段的分界点，对发酵过程中的温度进行如上的分阶段式控制。

根据本发明，将菌种生长阶段的温度先控制在30-38℃，当发酵菌种进入产酸阶段后再将温度控制在32-42℃，同时保证在菌种生长阶段的发酵温度低于菌种产酸阶段的发酵温度。这样在菌种生长阶段可以在一定程度上抑制发酵菌种的快速生长，使其更倾向于向产酸阶段发展，从而使得发酵菌种用于自身生长的营养物质减少，使得糖酸转化率提高。当发酵菌种进入产酸阶段，由于菌种已经进入了生长的稳定期，开始大量合成发酵产物，发酵菌种也难以再向其大量生长的方向发展，此时提高发酵温度有利于赖氨酸合成途径中的各种酶发挥作用，从而，可以提高发酵水平。

优选地，当菌种生长阶段的发酵温度为32-36℃，菌种产酸阶段的发酵温度为35-39℃时，更有利于发酵水平的提高，并进一步降低能耗。

本发明的发明人惊奇的发现，当菌种生长阶段的发酵温度比菌种产酸阶段的发酵温度低0.5-5℃，优选2-3.5℃时，在发酵过程中当发酵温度改变时，发酵菌种受发酵温度变化的影响较小，从而能够更快的适应菌种产酸阶段的环境。

根据本发明，对发酵过程中的温度进行控制的方法可以采用本领域公知的任意方法，例如，可以通过电极加热和/或冷却水循环的方法进行控制。

本发明中，以接种后且流加碳源和流加氮源之前发酵罐中的培养液为基准，赖氨酸发酵菌种的接种量为5-20体积%，优选为10-15体积%。

其中，流加碳源的量使培养液中还原性糖的浓度控制在2-12克/升，优选5-10克/升，流加氮源的量使培养液中氮的浓度控制在0.35-1.2克/升，优选0.5-1克/升。此处“流加碳源的量使培养液中还原性糖的浓度控制在2-12克/升，优选5-10克/升，流加氮源的量使培养液中氮的浓度控制在0.35-1.2克/升，优选0.5-1克/升”是指通过控制流加碳源和流加氮源的速度来使在整个发酵培养过程中培养液中还原性糖的浓度维持在2-12克/升，优选5-10克/升，使培养液中氮的浓度维持在0.35-1.2克/升，优选0.5-1克/升。

根据本发明，在发酵过程中流加的碳源可以为本领域中常规的用于赖氨酸发酵流加的碳源，例如，所述碳源可以为淀粉类原料的糖化液和/或纤维素类原料的糖化液。其中，所述淀粉类原料可以选自玉米、小麦、高粱、水稻中的一种或几种；所述纤维素类原料可以选自玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、甘蔗秸秆、高梁秸秆、棉花秸秆、豆秸和水葫芦中的一种或多种。

本发明中，所述碳源优选为淀粉质原料糖化清液。淀粉质原料糖化清液既可以采用干法制糖工艺制备，也可以采用湿法制糖工艺制备。从工艺简单、设备投资少，生产成本较低的方面考虑，优选通过干法制糖工艺制备。干法制糖工艺是指不经浸泡直接进行破碎和酶解。

以淀粉质原料的糖化清液制备为例，所述干法制糖工艺可以包括：将原料粉碎，将粉碎后的产物调浆，并加入淀粉酶对淀粉进行第一次水解；对第一次水解产物进行固液分离，并在得到的液相组分中加入糖化酶进行第二次水解，得到淀粉质原料糖化清液。优选地，粉碎使淀粉质原料过30目筛的通过率大于75%，更优选过30目筛的通过率为100%。调浆的方法为本领域技术人员所熟知，但优选地，调浆的方法可以包括将淀粉质原料粉碎后的产物加入到水中混合均匀，水的加入量使得到的浆液的波美度可以为9-17Bé°。术语“波美度”是表示溶液浓度的一种方法，是通过波美比重计检测溶液得到的度数。

根据本发明，在第一次水解中，以每克粉碎后的产物的干重计，淀粉酶的用量可以为10-30酶活力单位，酶解的温度可以为88-110℃，酶解的时间可以为90-120分钟，酶解的pH值可以为5.5-6.5。固液分离的条件没有特别的限定，优选地，固液分离的条件使得到的液相组分中的固含量为19-22重量%，更优选为20-21重量%。

根据本发明，在第二次水解中，以每克液相组分计，糖化酶的用量可以为50-100酶活力单位，酶解的温度可以为55-65℃，酶解的时间可以为50-80小时，酶解的pH值可以为4-5。

本发明酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原性糖所需的酶量为一个酶活力单位。

淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶。

α-淀粉酶又称淀粉1,4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1,4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。

β-淀粉酶又称淀粉1,4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1,4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。

根据本发明，优选使用α-淀粉酶。

根据本发明，糖化酶优选为α-1,4-葡萄糖水解酶。

按照本发明，淀粉质原料可以为本领域公知的各种可以用于酶解、发酵制备赖氨酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类（如木薯）和小麦中的一种或几种。

本发明中，氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，可以为自尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、硝酸铵、液氨和氨水中的一种或几种。其中，当氮源为铵盐时，培养液中氮的浓度以铵根离子的浓度表示，氮的浓度控制在0.35-1.2克/升，则铵根离子的浓度控制在0.5-1.5克/升。

本发明的发明人在实验中发现，所述碳源和氮源的连续流加比间歇流加的发酵效果好，因此，本发明中的流加优选为连续流加。

本领域技术人员应该理解的是，赖氨酸的发酵培养应该在空气中进行。为了有效利用发酵罐的产能，接种后且流加碳源和流加氮源之前发酵罐中的培养液的体积优选为发酵罐体积的40-60%，随着流加碳源和流加氮源，发酵罐中的培养液的体积逐渐增大，为了保证发酵罐中的空气量，优选为流加碳源和流加氮源至发酵罐体积的70-80%时放料，为了保证放料后发酵罐中的菌种数量，不影响放料后发酵罐中的发酵培养，放料体积优选为放料前发酵罐中培养液体积的4-10%。

本发明的方法还包括在所述发酵的过程中向发酵培养基中加入碱性物质的步骤，优选地，所述碱性物质的加入使得发酵培养基的pH值为6.5-7.5。

其中，所述碱性物质的种类没有特别的限制，只要能够调节发酵培养基的pH值且不影响发酵菌种的生理活动即可，优选地，所述碱性物质为液氨、氨水、硫酸铵、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钡、氢氧化铝、氢氧化锰、氢氧化锌、碳酸钠、碳酸钾、碳酸锂和氨水中的一种或多种。

优选地，为了较好的控制发酵培养基的pH值，所述碱性物质以溶液的形式加入，其中，含有所述碱性物质的溶液的浓度不受特别限制，只要能够有效地调节培养基的pH值，同时又不会对发酵菌种造成伤害以及不会较大程度的稀释培养基即可。优选地，所述溶液中碱性物质的浓度为0.1-30重量%。

其中，对所述碱性物质的加入方式也没有特别的限制，优选地，为了便于控制发酵培养基的pH值，所述碱性物质以连续流加的方式进行加入。

本发明中，对发酵培养的条件无特殊要求，可以采用本领域常用的条件，优选为：通气量为0.5-1.5体积：（体积·分钟），压力为0.05-0.1MPa。

本发明中，对赖氨酸发酵菌种的种类无特殊要求，可以采用本领域常用的菌种，优选选自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌和黄色短杆菌的一种或多种；更优选的，所述发酵菌株选自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌和黄色短杆菌的两种或多种。

本发明中，优选发酵培养45-50小时后放罐。本发明中的放罐是指将发酵罐中的培养液全部从发酵罐中放出，即停止发酵。

本领域技术人员应该理解的是，为了得到纯度较高的赖氨酸产品，本发明方法还包括从放料或放罐的溶液中提取赖氨酸。对于提取赖氨酸的方法无特殊要求，可以采用本领域常用的各种方法，例如，采用连续离子交换分离提取方法，向放料或放罐的溶液中加入大量的浓硫酸调pH至2.0-3.0进行酸化，酸化后经过金属膜或陶瓷膜过滤除去菌体，得到赖氨酸膜滤液即赖氨酸清液，或将酸化后的赖氨酸发酵液经絮凝过滤除菌体后得到赖氨酸清液，除菌体后的赖氨酸清液采用强酸型阳离子交换树脂进行吸附交换，树脂吸附饱和后用稀氨水进行洗脱，洗脱下来的赖氨酸经浓缩、盐酸调节pH值、结晶、固液分离、烘干，得到赖氨酸盐酸盐成品；或者在放料或放罐的溶液中加入酸，使赖氨酸发酵液酸化，经过滤或离心等方法除去菌体。在除去菌体后的赖氨酸清液中加入氢氧化钙调节pH值至8.0-11.5，使赖氨酸清液中的盐、胶体等杂质生成不溶物，经固液分离后得到赖氨酸溶液，将赖氨酸溶液浓缩至每毫升赖氨酸溶液中赖氨酸的含量为0.6-0.8g，再经过过滤可以得到高纯度的赖氨酸溶液，然后经浓缩、盐酸调节pH值、结晶、固液分离、烘干，得到赖氨酸盐酸盐成品。

本发明中，培养液的成分无特殊要求，可以采用本领域常用的赖氨酸发酵培养液，例如，培养液可以含有淀粉质原料糖化清液、糖蜜、玉米浆、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、苏氨酸、蛋氨酸和谷氨酸。根据本发明，所述培养液中各组分的含量可以在很大范围内改变，优选情况下，每升培养液中，淀粉质原料糖化清液的含量为40-60克，糖蜜的含量为15-30克，甜菜碱的含量为2-5克，玉米浆的含量为20-70克，硫酸铵的含量可以为0-40克，磷酸氢二钾的含量可以为0-1.5克，硫酸镁的含量为2-5克，苏氨酸的含量为0.1-0.3克，蛋氨酸的含量为0.1-0.3克，谷氨酸的含量为0-0.4克。

本领域技术人员应该理解的是，赖氨酸发酵菌种在被接种至发酵培养液中之前，采用常规方法将赖氨酸发酵菌种经过种子罐培养，然后再将菌种接入发酵培养液中。在种子罐培养的培养程度可以通过取样显微镜镜检、OD（optical density）值测定对产赖氨酸微生物的生长进行观察，当通过上述方法观察菌体形态正常、测定OD值达到0.75以上时停止培养，然后再将种子罐的种子液接入发酵培养液中。种子罐培养可以采用一级种子罐培养也可以采用二级种子罐培养，一级种子罐培养即将赖氨酸发酵菌种在一个种子罐中一直培养到所需的培养程度；二级种子罐培养即先将赖氨酸发酵菌种在一个种子罐中培养一段时间后再转入另一个种子罐继续培养，培养到所需的培养程度。二级种子罐培养在各个种子罐的培养时间没有具体限定，只要最终能培养到所需的培养程度即可。为了操作方便，本发明的种子罐培养优选采用一级种子罐培养。

由于赖氨酸发酵菌种个体微小，数量不易统计，而种子液的OD值为被测种子液吸收的光密度，可以反映种子液中赖氨酸微生物的数量，因此，本领域中一般均采用OD值来表示种子液中赖氨酸微生物的数量，本发明也沿用本领域的采用OD值来表示种子液中赖氨酸微生物的数量的习惯。且本发明中，OD值用722N可见光分光光度计测定。

种子罐培养基中各组分的含量可以在很大范围内改变，优选情况下，每升培养基中，淀粉质原料糖化清液的含量为30-50克，甜菜碱的含量可以为2-8克，玉米浆（干重为20-50重量%）的含量为30-80克，磷酸二氢钾的含量为0.5-5克，对氨基苯甲酸的含量为2-6克，硫酸镁的含量为0.4-5克，硫酸铵的含量为10-18克，苏氨酸的含量为0.1-1克，蛋氨酸的含量为0-0.3克，谷氨酸的含量为0-0.4克。

实施例

以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。

在下述实施例和对比例中：

OD值测定：将取样的发酵液进行26倍稀释，采用722N可见光分光光度计，在波长562纳米可见光下测定吸光值。

按照GB/T5009.7-2008的方法测定发酵液中还原性糖的浓度。

按照GB/T3595-2000的方法测定发酵液中氨氮的浓度。

按照GB10794-2009的方法检测培养液中的赖氨酸浓度（以赖氨酸盐酸盐计）。

单罐供酸量=（放罐的赖氨酸浓度×放罐体积+中间放料赖氨酸浓度×中间放料体积）。

转化率（%）=单罐供酸量/总糖的重量×100%，其中总糖的重量包括种子罐用糖重量和发酵罐用糖重量。

制备例1

本制备例用于说明赖氨酸种子以及发酵培养基的制备。

（1）将收获的100重量份玉米通过机械加工将玉米颗粒粉碎，使玉米粉过30目筛的通过率为80%。

（2）将粉碎后的产物加水调浆至12Bé°，相对于每克粉碎产物的干重，加入20个酶活力单位的淀粉酶（诺维信公司，α-淀粉酶），在100±2.0℃、pH为6.0±0.1的条件下酶解100分钟，得到酶解产物。其中，将酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液（固含量为20重量%）；之后加入80个酶活力单位的糖化酶（α-1,4-D-葡萄糖水解酶，诺维信公司），在60±1.0℃、pH为4.5±0.1的条件下酶解72小时，得到淀粉质原料糖化清液。

（3）使用步骤（2）得到的淀粉质原料糖化清液配制种子罐培养基，具体组成为：相对于每升的培养基，淀粉质原料糖化清液的含量为40克，玉米浆（干重为35重量%）的含量为50克，硫酸铵的含量为14g，磷酸二氢钾的含量为3.0克，硫酸镁的含量为2克，苏氨酸的含量为0.8克，对氨基苯甲酸的含量为4mL，甜菜碱的含量为5mL。将培养基加热到121℃灭菌，维持20分钟后降温至37℃并保持恒定。

（4）使用步骤（2）得到的淀粉质原料糖化清液配制发酵培养液，具体组成为：相对于每升的培养液，淀粉质原料糖化清液的含量为40克，玉米浆（干重为35重量%）的含量为50克，苏氨酸的含量为0.2克，蛋氨酸的含量为0.2克，甜菜碱的含量为3.6克，糖蜜（产地新疆）的含量为20克，硫酸镁的含量为3克。培养液加热到121℃灭菌30分钟后降温至37℃并保持恒定，用氨水调节pH至6.9，得到发酵培养基。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备赖氨酸的方法。

开启种子培养罐中的搅拌，调节罐压为0.1MPa，按照通风量与培养基1:1体积比通入无菌空气，用氨水调节pH至6.8并保持恒定。将大肠杆菌菌种（菌株ZL01原种取自中国工业微生物菌种保藏管理中心）活化和增殖后接入种子罐中进行培养，培养过程中，流加淀粉质原料糖化清液控制还原糖浓度为3-10g/L，流加氨水控制溶液的pH值为6.8，并且每隔120分钟取样镜检并测定OD值，当镜检菌体形态正常且OD值达到0.8时停止培养，得到成熟的种子液A。

将种子液A加入到制备例1中的发酵培养基中开始发酵，其中，以每毫升初始发酵培养基计，发酵菌种的接种量为10体积%（接种后且流加碳源和流加氮源之前发酵罐中的培养基的体积为发酵罐体积的50%），发酵条件包括：按照通风量与培养基体积1:1通入无菌空气，罐压为0.07MPa，流加淀粉质原料糖化清液控制发酵溶液中还原糖浓度为8.0-10.0g/l，流加硫酸铵溶液控制发酵溶液中氨氮浓度为0.8-1.0g/l，流加氢氧化钠溶液控制溶液pH为6.8±0.1。接种后至发酵12小时期间主要为菌种生长阶段，发酵温度控制为35℃；发酵12小时至发酵结束为主要产酸阶段，发酵温度控制为37℃。

当液位高于发酵罐75%时开始排料，每次排出发酵液体积的5%左右，装入三角瓶内封口后冷藏于4℃。发酵培养48小时后放罐，测定发酵终点赖氨酸浓度和中间排料的赖氨酸浓度，计算产酸浓度和糖酸转化率见表1。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备赖氨酸的方法。

开启种子培养罐中的搅拌，调节罐压为0.1MPa，按照通风量与培养基1:1体积比通入无菌空气，用氨水调节pH至6.8并保持恒定。将谷氨酸棒杆菌菌种（菌株BTC01原种取自中国工业微生物菌种保藏管理中心）活化和增殖后接入种子罐中进行培养，培养过程，流加淀粉质原料糖化清液控制还原糖浓度为3-10g/L，流加氨水控制溶液的pH值为6.8，并且每隔120分钟取样镜检并测定OD值，当镜检菌体形态正常且OD值达到0.8时停止培养，得到成熟的种子液B。

将种子液B加入到制备例1中的发酵培养基中开始发酵，其中，以每毫升初始发酵培养基计，发酵菌种的接种量为12体积%（接种后且流加碳源和流加氮源之前发酵罐中的培养基的体积为发酵罐体积的60%），发酵条件包括：按照通风量与培养基体积0.5:1通入无菌空气，罐压为0.1MPa，流加淀粉质原料糖化清液控制发酵溶液中还原糖浓度为7.0-9.0g/l，流加氯化铵溶液和氨水控制发酵溶液中氨氮浓度为0.6-0.8g/l，pH为6.5±0.1。接种后至发酵12小时期间主要为菌种生长阶段，发酵温度控制为32℃；发酵12小时至发酵结束为主要产酸阶段，发酵温度控制为35.5℃。

当液位高于发酵罐80%时开始排料，每次排出发酵液体积的10%左右，装入三角瓶内封口后冷藏于4℃。发酵培养48小时后放罐，测定发酵终点赖氨酸浓度和中间排料的赖氨酸浓度，计算产酸浓度和糖酸转化率见表1。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备赖氨酸的方法。

开启种子培养罐中的搅拌，调节罐压为0.1MPa，按照通风量与培养基1:1体积比通入无菌空气，用氨水调节pH至6.8并保持恒定。将黄色短杆菌菌种（菌株BTC02原种取自中国工业微生物菌种保藏管理中心）活化和增殖后接入种子罐中进行培养，培养过程，流加淀粉质原料糖化清液控制还原糖浓度为3-10g/L，流加氨水控制溶液的pH值为6.8，并且每隔120分钟取样镜检并测定OD值，当镜检菌体形态正常且OD值达到0.8时停止培养，得到成熟的种子液C。

将种子液C加入到制备例1中的发酵培养基中开始发酵，其中，以每毫升发酵培养基计，发酵菌种的接种量为15体积%（接种后且流加碳源和流加氮源之前发酵罐中的培养基的体积为发酵罐体积的40%），发酵条件包括：按照通风量与培养基体积1.5:1通入无菌空气，罐压为0.05MPa，流加淀粉质原料糖化清液控制发酵溶液中还原糖浓度为5.0-7.0g/l，流加磷酸铵溶液控制发酵溶液中氨氮浓度为0.5-0.7g/l，流加碳酸钠溶液控制溶液pH为7.5±0.1。接种后至发酵12小时期间主要为菌种生长阶段，发酵温度控制为36℃；发酵12小时至发酵结束为主要产酸阶段，发酵温度控制为39℃。

当液位高于发酵罐70%时开始排料，每次排出发酵液体积的5%左右，装入三角瓶内封口后冷藏于4℃。发酵培养48小时后放罐，测定发酵终点赖氨酸浓度和中间排料的赖氨酸浓度，计算产酸浓度和糖酸转化率见表1。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备赖氨酸的方法。

采用实施例3的方法进行赖氨酸的发酵，不同的是，菌种生长阶段的发酵温度为31℃菌种产酸阶段的发酵温度为34℃。产酸浓度以及发酵转换率如表1所示。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备赖氨酸的方法。

采用实施例3的方法进行赖氨酸的发酵，不同的是，菌种生长阶段的发酵温度为38℃，产酸阶段的发酵温度为42℃。产酸浓度以及发酵转换率如表1所示。

实施例6

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备赖氨酸的方法。

采用实施例3的方法进行赖氨酸的发酵，不同的是，菌种生长阶段的发酵温度为30℃，产酸阶段的发酵温度为35℃。产酸浓度以及发酵转换率如表1所示。

实施例7

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备赖氨酸的方法。

采用实施例3的方法进行赖氨酸的发酵，不同的是，接种后至发酵18小时期间主要为菌种生长阶段，发酵温度控制为35℃；发酵18小时至发酵结束为主要产酸阶段，发酵温度控制为37℃。

实施例8

本实施例用于说明本发明提供的发酵制备赖氨酸的方法。

采用实施例3的方法进行赖氨酸的发酵，不同的是，发酵菌种为乳酸发酵短杆菌菌种（菌株BTC03原种取自中国工业微生物菌种保藏管理中心）。

对比例1

本对比例用于说明现有技术提供的发酵赖氨酸制备的方法。

采用实施例3的方法进行赖氨酸的发酵，不同的是，不采用分段式控制发酵温度，而是整个发酵过程控制温度为37℃。产酸浓度、发酵周期以及发酵转换率如表1所示。

表1

实施例/对比例编号	产酸浓度（g/100mL）	转化率（%）
			实施例1	18.6	63.1
实施例2	18.2	62.7
			实施例3	18.8	63.5
实施例4	16.5	62.1
			实施例5	17.5	62.0
实施例6	17.8	61.9
			实施例7	16.8	62.2
实施例8	18.3	62.5
			对比例1	16.0	60.5

从上表1的数据可以看出，与对比例1相比，实施例1-8采用本发明提供的柠檬酸的制备方法，在发酵过程中分段式控制发酵温度，有效地提高了柠檬酸的产酸浓度、发酵转换率；实施例1与实施例4-6相比，将菌种生长阶段和产酸阶段的温度以及温差控制在本发明优选的范围内，能够进一步提高柠檬酸的发酵水平。将实施例1与实施例7进行比较可以看出，将发酵菌种接种至发酵培养基中至发酵12小时的时间段作为区分菌种生长阶段和产酸阶段的控制点，发酵水平能够得到进一步提高。

另外，实施例1-8采用分段式控制发酵温度的发酵方法，可以有效缩短发酵周期，提高设备利用效率，降低发酵过程中的电力和动力等能源消耗；此外，发酵产酸阶段采用较高的发酵温度，可以节省高温物料降温所需的循环冷却水，也起到降低电力和动力能耗的作用。

因此，采用本发明的分段式控制发酵温度制备柠檬酸的方法能够有效的提高柠檬酸的发酵水平，并降低能耗。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (12)

1.一种发酵制备赖氨酸的方法，该方法包括：将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵以生成赖氨酸，所述发酵过程包括菌种生长阶段和菌种产酸阶段，在菌种生长阶段的发酵温度为30-38℃，在菌种产酸阶段的发酵温度为32-42℃，且在菌种生长阶段的发酵温度低于在菌种产酸阶段的发酵温度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在菌种生长阶段的发酵温度为32-36℃，在菌种产酸阶段的发酵温度为35-39℃。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在菌种生长阶段的发酵温度比在菌种产酸阶段的发酵温度低0.5-5℃。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，在菌种生长阶段的发酵温度比在菌种产酸阶段的发酵温度低2-3.5℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述菌种生长阶段是指将赖氨酸发酵菌种接种至发酵培养基中开始至赖氨酸的生成速率达到5g/L/h时的发酵时间段，所述菌种产酸阶段是指赖氨酸的生成速率大于5g/L/h时至发酵结束时的发酵时间段。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流加为连续流加；

流加的碳源为淀粉类原料的糖化清液和/或纤维素类原料的糖化清液；流加碳源的量使培养液中还原性糖的浓度控制在2-12克/升；

流加的氮源选自尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、硝酸铵、液氨和氨水中的一种或多种；流加氮源的量使培养液中氮的浓度控制在0.35-1.2克/升。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中，以接种后且流加碳源和流加氮源之前的培养培养基为基准，所述赖氨酸发酵菌种的接种量为5-20体积%。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，接种后且流加碳源和流加氮源之前发酵罐中的培养基的体积为发酵罐体积的40-60%，流加碳源和流加氮源至发酵罐体积的70-80%时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养基体积的4-10%。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括，在所述发酵的过程中向发酵培养基中加入碱性物质的步骤，所述碱性物质的加入使得发酵培养基的pH值为6.5-7.5。

10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述碱性物质选自液氨、氨水、硫酸铵、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钡、氢氧化铝、氢氧化锰、氢氧化锌、碳酸钠、碳酸钾、碳酸锂和氨水中的一种或多种。

11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中，所述发酵培养的条件为：通气量为0.5-1.5体积：（体积·分钟），压力为0.05-0.1MPa，时间为45-50小时。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵菌种选自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌和黄色短杆菌的一种或多种。