CN104561157A - 发酵法生产γ-氨基丁酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种发酵法生产γ-氨基丁酸,包括以下步骤:将种子以?0.5%?接种量接种至?3?L?发酵培养基,发酵结束;于发酵液中直接投加L-谷氨酸,进行催化反应;按照10%添加量添加孔径小于30nm的活性炭,90℃处理20min?以进行脱色,待浓缩液体积浓缩至15-19L时,停止浓缩,向浓缩液中加入3倍体积?95%的乙醇,过滤收集晶体,得到γ-?氨基丁酸成品。本发明用于生产乳果低聚糖操作简单、易掌握,γ-?氨基丁酸制备过程中催化液总回收率为95.7-96.4%,产物纯度为99.3%,生产周期短,大大提高了发酵法生产γ-氨基丁酸的产量,是发酵工艺中的重大的创新,值得推广。
Description
(一)技术领域
本发明涉及γ-氨基丁酸,具体涉及发酵法生产γ-氨基丁酸。
(二)背景技术
γ-氨基丁酸是中枢神经***中很重要的抑制性神经递质,它是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸,具有极其重要的生理功能,它能促进脑的活化性,健脑益智,抗癫痫,促进睡眠,美容润肤,延缓脑衰老机能,能补充人体抑制性神经递质,具有良好的降血压功效。促进肾机能改善和保护作用。抑制脂肪肝及肥胖症,活化肝功能。每日补充微量的伽玛氨基丁酸有利于心脑血压的缓解,又能促进人体内氨基酸代谢的平衡,调节免疫功能。γ-氨基丁酸属强神经抑制性氨基酸,具有镇静、催眠、抗惊厥、降血压的生理作用。它是抑制性神经递质(Inhibitory Neurotransmitter),可以抑制动物的活动,减少能量的消耗。
γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法和生物合成法两种。
化学合成法多见于专利文献的报道,成本较高,得率较低,并且在生产工艺中使用危险溶剂,甚至是有毒溶剂。因此化学合成法制备的γ-氨基丁酸不能用于食品,也不能被认为是一种天然食品添加剂。
生物合成法相比较来说是一种既安全、又低成本的方法。在早期的研究中,发酵法生产γ-氨基丁酸以大肠杆菌为生产菌,发酵培养基为麸皮水解液、玉米浆、蛋白胨、矿物质等。在发酵过程中,利用大肠杆菌脱羧酶的作用,将L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸,再分离纯化得到GABA制品。但是,若要进行食品开发,使用大肠杆菌无疑存在安全性方面的种种问题。根据最新的研究报道和专利文献,乳酸菌、酵母菌、曲霉菌等一些安全性高的微生物在γ-氨基丁酸类食品的制备中已有应用,这就使得生物合成的γ-氨基丁酸制品能用作高档功能性保健食品的配料。
2013年09月18,公布的一种利用微生物发酵法生产 γ- 氨基丁酸的方法,公开了一种枯草芽孢杆菌(菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号,中国科学院微生物研究所,保藏日期为 2011 年12 月 08 号,菌种保藏编号为 CGMCC No. 5550,菌种分类命名为枯草芽孢杆菌,英文名称为Bacillus subtilis)。通过微生物(枯草芽孢杆菌)发酵法生产 γ- 氨基丁酸, γ- 氨基丁酸含量不低于 55%。
但是上述发酵法生产γ-氨基丁酸,周期均过长,严重影响对γ-氨基丁酸供应,需要改进。
(三)发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足,提供了一种发酵法生产γ-氨基丁酸,操作方便,过程易于控制,反应时间短,产物纯度高,有利于工业化生产。
本发明是通过如下技术方案实现的:
一种发酵法生产γ-氨基丁酸,其特殊之处在于:包括以下步骤:
(1)种子培养
枯草芽孢杆菌的平板培养基:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 5 g/L,氯化钠 5 g/L,1.5% 琼脂粉,pH 7.0,
枯草芽孢杆菌的种子培养基:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 5 g/L,氯化钠 5 g/L,pH 7.0,121℃下灭菌 20 min ,培养温度为 37℃,
从平板上挑取一单菌落,接种至装有 150 ml 种子培养基的 500 ml 三角瓶中,于摇床上 200 rpm 37℃振摇培养 14 h;
(2)枯草芽孢杆菌的分批发酵
将种子以 0.5% 接种量接种至 3 L 发酵培养基,发酵培养基:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 5 g/L,氯化钠 5g/L,氯化钙0.1g/L, Zn2+0.08-0.1g/L ,FeCl3 0.1-0.4g/L ,pH 自然,在转速 600rpm,通气量1.0 vvm,35-37℃,培养 0.4-2h 后,发酵结束;
(3)催化反应:
发酵结束后,于发酵液中直接投加w/v为60-65% 的L-谷氨酸,调节pH为4.5~4.8 进行催化反应,反应条件为 30-35℃催化 0.5-2h;
(4)脱色、提纯:催化液在发酵罐中升温至 121℃灭菌 30min,灭菌结束后通过发酵罐夹套循环水冷却至常温,处理液按照10%添加量添加孔径小于30nm的活性炭,90℃处理20min 以进行脱色,将脱色液流过孔径 0.2μm 的陶瓷微滤膜,控制膜管压力在0-0.3MPa 之间,流速 65L/h,收集的滤液通过管道流入装有截留分子量 300 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中,控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间,流速为240L/h,收集流出液通过管道流入装有截留分子量 100 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中,控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间,流速为 250L/h,弃流出液,待浓缩液体积浓缩至15-19L时,停止浓缩,得浓缩液,向浓缩液中加入 3 倍体积 95%的乙醇,4℃静置0.8-1.5h,过滤收集晶体,再按 10ml/g 比例加入 95%乙醇,40℃搅拌10min,过滤收集晶体 ;将收集的晶体 100℃沸腾干燥20min,得到 γ- 氨基丁酸成品。
本发明的有益效果:本发明用于生产乳果低聚糖操作简单、作用条件温和、易掌握,γ- 氨基丁酸制备过程中催化液总回收率为95.7-96.4%,产物纯度为 99.3%,生产周期短,大大提高了发酵法生产γ-氨基丁酸的产量,是发酵工艺中的重大的创新,值得推广。
(四)具体实施方式
实施例 1
本实施例发酵法生产γ-氨基丁酸,包括以下步骤:
(1)种子培养
枯草芽孢杆菌的平板培养基:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 5 g/L,氯化钠 5 g/L,1.5% 琼脂粉,pH 7.0,
枯草芽孢杆菌的种子培养基:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 5 g/L,氯化钠 5 g/L,pH 7.0,121℃下灭菌 20 min ,培养温度为 37℃,
从平板上挑取一单菌落,接种至装有 150 ml 种子培养基的 500 ml 三角瓶中,于摇床上 200 rpm 37℃振摇培养 14 h;
(2)枯草芽孢杆菌的分批发酵
将种子以 0.5% 接种量接种至 3 L 发酵培养基,发酵培养基:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 5 g/L,氯化钠 5g/L,氯化钙0.1g/L, Zn2+0.08g/L ,FeCl3 0.28g/L ,pH 自然,在转速 600rpm,通气量1.0 vvm,37℃,培养 0.4h 后,发酵结束;
(3)催化反应:
发酵结束后,于发酵液中直接投加w/v为60% 的L-谷氨酸,调节pH为4.5~4.8 进行催化反应,反应条件为 30℃催化 2h;
(4)脱色、提纯:催化液在发酵罐中升温至 121℃灭菌 30min,灭菌结束后通过发酵罐夹套循环水冷却至常温,处理液按照10%添加量添加孔径小于30nm的活性炭,90℃处理20min 以进行脱色,将脱色液流过孔径 0.2μm 的陶瓷微滤膜,控制膜管压力在0-0.3MPa 之间,流速 65L/h,收集的滤液通过管道流入装有截留分子量 300 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中,控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间,流速为240L/h,收集流出液通过管道流入装有截留分子量 100 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中,控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间,流速为 250L/h,弃流出液,待浓缩液体积浓缩至15L时,停止浓缩,得浓缩液,向浓缩液中加入 3 倍体积 95%的乙醇,4℃静置0.8h,过滤收集晶体,再按 10ml/g 比例加入 95%乙醇,40℃搅拌10min,过滤收集晶体 ;将收集的晶体 100℃沸腾干燥20min,得到 γ- 氨基丁酸成品。
实施例 2
本实施例发酵法生产γ-氨基丁酸,包括以下步骤:
(1)种子培养
枯草芽孢杆菌的平板培养基:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 5 g/L,氯化钠 5 g/L,1.5% 琼脂粉,pH 7.0,
枯草芽孢杆菌的种子培养基:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 5 g/L,氯化钠 5 g/L,pH 7.0,121℃下灭菌 20 min ,培养温度为 37℃,
从平板上挑取一单菌落,接种至装有 150 ml 种子培养基的 500 ml 三角瓶中,于摇床上 200 rpm 37℃振摇培养 14 h;
(2)枯草芽孢杆菌的分批发酵
将种子以 0.5% 接种量接种至 3 L 发酵培养基,发酵培养基:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 5 g/L,氯化钠 5g/L,氯化钙0.1g/L, Zn2+0.1g/L ,FeCl3 0.4g/L ,pH 自然,在转速 600rpm,通气量1.0 vvm,35℃,培养 1h 后,发酵结束;
(3)催化反应:
发酵结束后,于发酵液中直接投加w/v为65% 的L-谷氨酸,调节pH为4.5~4.8 进行催化反应,反应条件为 32℃催化 0.5h;
(4)脱色、提纯:催化液在发酵罐中升温至 121℃灭菌 30min,灭菌结束后通过发酵罐夹套循环水冷却至常温,处理液按照10%添加量添加孔径小于30nm的活性炭,90℃处理20min 以进行脱色,将脱色液流过孔径 0.2μm 的陶瓷微滤膜,控制膜管压力在0-0.3MPa 之间,流速 65L/h,收集的滤液通过管道流入装有截留分子量 300 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中,控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间,流速为240L/h,收集流出液通过管道流入装有截留分子量 100 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中,控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间,流速为 250L/h,弃流出液,待浓缩液体积浓缩至15-19L时,停止浓缩,得浓缩液,向浓缩液中加入 3 倍体积 95%的乙醇,4℃静置1h,过滤收集晶体,再按 10ml/g 比例加入 95%乙醇,40℃搅拌10min,过滤收集晶体 ;将收集的晶体 100℃沸腾干燥20min,得到 γ- 氨基丁酸成品。
实施例 3
本实施例发酵法生产γ-氨基丁酸,包括以下步骤:
(1)种子培养
枯草芽孢杆菌的平板培养基:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 5 g/L,氯化钠 5 g/L,1.5% 琼脂粉,pH 7.0,
枯草芽孢杆菌的种子培养基:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 5 g/L,氯化钠 5 g/L,pH 7.0,121℃下灭菌 20 min ,培养温度为 37℃,
从平板上挑取一单菌落,接种至装有 150 ml 种子培养基的 500 ml 三角瓶中,于摇床上 200 rpm 37℃振摇培养 14 h;
(2)枯草芽孢杆菌的分批发酵
将种子以 0.5% 接种量接种至 3 L 发酵培养基,发酵培养基:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 5 g/L,氯化钠 5g/L,氯化钙0.1g/L, Zn2+0.09g/L ,FeCl3 0.1g/L ,pH 自然,在转速 600rpm,通气量1.0 vvm,36℃,培养2h 后,发酵结束;
(3)催化反应:
发酵结束后,于发酵液中直接投加w/v为62.5% 的L-谷氨酸,调节pH为4.5~4.8 进行催化反应,反应条件为35℃催化 1h;
(4)脱色、提纯:催化液在发酵罐中升温至 121℃灭菌 30min,灭菌结束后通过发酵罐夹套循环水冷却至常温,处理液按照10%添加量添加孔径小于30nm的活性炭,90℃处理20min 以进行脱色,将脱色液流过孔径 0.2μm 的陶瓷微滤膜,控制膜管压力在0-0.3MPa 之间,流速 65L/h,收集的滤液通过管道流入装有截留分子量 300 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中,控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间,流速为240L/h,收集流出液通过管道流入装有截留分子量 100 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中,控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间,流速为 250L/h,弃流出液,待浓缩液体积浓缩至15-19L时,停止浓缩,得浓缩液,向浓缩液中加入 3 倍体积 95%的乙醇,4℃静置1.5h,过滤收集晶体,再按 10ml/g 比例加入 95%乙醇,40℃搅拌10min,过滤收集晶体 ;将收集的晶体 100℃沸腾干燥20min,得到 γ- 氨基丁酸成品。
Zn2+可以为ZnSO4、ZnCl2。
Claims (1)
1.一种发酵法生产γ-氨基丁酸,其特征在于:包括以下步骤:
(1)种子培养
枯草芽孢杆菌的平板培养基:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 5 g/L,氯化钠 5 g/L,1.5% 琼脂粉,pH 7.0,
枯草芽孢杆菌的种子培养基:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 5 g/L,氯化钠 5 g/L,pH 7.0,121℃下灭菌 20 min ,培养温度为 37℃,
从平板上挑取一单菌落,接种至装有 150 ml 种子培养基的 500 ml 三角瓶中,于摇床上 200 rpm 37℃振摇培养 14 h;
(2)枯草芽孢杆菌的分批发酵
将种子以 0.5% 接种量接种至 3 L 发酵培养基,发酵培养基:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 5 g/L,氯化钠 5g/L,氯化钙0.1g/L, Zn2+0.08-0.1g/L ,FeCl3 0.1-0.4g/L ,pH 自然,在转速 600rpm,通气量1.0 vvm,35-37℃,培养 0.4-2h 后,发酵结束;
(3)催化反应:
发酵结束后,于发酵液中直接投加w/v为60-65% 的L-谷氨酸,调节pH为4.5~4.8 进行催化反应,反应条件为 30-35℃催化 0.5-2h;
(4)脱色、提纯:催化液在发酵罐中升温至 121℃灭菌 30min,灭菌结束后通过发酵罐夹套循环水冷却至常温,处理液按照10%添加量添加孔径小于30nm的活性炭,90℃处理20min 以进行脱色,将脱色液流过孔径 0.2μm 的陶瓷微滤膜,控制膜管压力在0-0.3MPa 之间,流速 65L/h,收集的滤液通过管道流入装有截留分子量 300 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中,控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间,流速为240L/h,收集流出液通过管道流入装有截留分子量 100 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中,控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间,流速为 250L/h,弃流出液,待浓缩液体积浓缩至15-19L时,停止浓缩,得浓缩液,向浓缩液中加入 3 倍体积 95%的乙醇,4℃静置0.8-1.5h,过滤收集晶体,再按 10ml/g 比例加入 95%乙醇,40℃搅拌10min,过滤收集晶体 ;将收集的晶体 100℃沸腾干燥20min,得到 γ- 氨基丁酸成品。
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