CN104560794A - 一株植物乳杆菌及利用该菌株制备果蔬酱的方法 - Google Patents
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Abstract
一株植物乳杆菌及利用该菌株制备果蔬酱的方法，涉及一株植物乳杆菌及果蔬酱的制备方法。本发明提供一株植物乳杆菌及利用该菌株制备果蔬酱的方法，为了解决现有的果蔬酱为保证口感和色泽添加较多的糖、果胶、防腐剂和色素，易对人身体产生危害的问题。该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年11月28日，保藏编号为CGMCC？No.10075。方法：一、原料选择；二、打浆；三、灭菌，冷却；四、植物乳杆菌发酵：添加植物乳杆菌发酵剂冻干粉，厌氧发酵；五、无菌灌装，即为果蔬酱。本发明以植物乳杆菌发酵剂制备果蔬酱，不含糖、果胶、防腐剂和色素，保持原本色彩和口味，富含多酚类化合物和乳酸菌。
Description
技术领域
本发明涉及一株植物乳杆菌及果蔬酱的制备方法。
背景技术
人类从长期的生产劳动实践中认识到乳酸菌是一种有益微生物，主要用于保存和加工产品，我们常接触到的乳酸菌为动物性乳酸菌，多数存在于酸奶等乳品中。这些动物性乳酸菌中的大多数在尚未进入胃里时就死亡，只有极少数能进入肠道。但是，植物源乳酸菌则完全不同，它不怕酸碱，耐高温，能在恶劣的环境下生存，因此能达到肠道内部，抑制肠内部有害细菌，达到肠道内部菌群平衡，提高免疫力，抗过敏性，增加营养的吸收。
传统的果酱制品为了获得良好的凝胶形态和保藏性，其含糖量高达60％～65％，使口感甜腻不利于健康，且生产中厂家多注重口感多于注重营养，使得果酱类食品中所含的营养成份不能完全被吸收。加入植物乳杆菌发酵剂的果蔬酱不仅不含糖，保持原本的新鲜色彩和口味，其最主要的特色是富含多酚类化合物和乳酸菌，因此具有抗氧化、增加保藏期、保持肠道菌群平衡的优点。另外，现在的果酱等食品生产工艺复杂费时费力，为了消灭中的细菌常需加入一些对人体不利的抗菌剂，在果蔬酱等食品中加入植物乳杆菌发酵剂后，可以节约生产时间减少抗菌剂的使用。因此，研制出一种可应用于果蔬酱等食品植物乳杆菌发酵剂，以提高这些食品的营养价值的相关研究显得非常重要。
发明内容
本发明提供一株植物乳杆菌及利用该菌株制备果蔬酱的方法，为了解决现有的果蔬酱为保证口感和色泽添加较多的糖、果胶、防腐剂和色素，易对人身体产生危害的问题。
本发明的植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)rwh，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年11月28日，保藏编号为CGMCC No.10075。
本发明的植物乳杆菌呈长杆、短杆或弯曲杆状，也常有棒形和球杆状，一般成连排列。通常不运动，运动带鞭毛，无芽孢，革兰氏染色阳性。
本发明植物乳杆菌微好养，可在MRS培养基上生长，生长温度范围为2～53℃，最适生长温度为30～40℃，耐酸，最适pH为5.5～6.2，在中性或初始碱性条件下，通常会降低 其生长速率，需要氨基酸、肽、盐类、脂肪酸或脂肪酸酯类及可发酵碳水化合物。
本发明植物乳杆菌能专性的分解糖，终产物中至少有一半是乳酸盐，副产物可能是乙酸、乙醇、CO2、甲酸盐或琥珀酸盐。不液化明胶，不分解酪素，不产生吲哚和H2S，无细胞色素，接触酶阴性，联苯胺反应阴性。
本发明植物乳杆菌通过16S rDNA序列比对分析，与乳酸菌属(Lactobacillus plantarum)内各种之间有极高的同源性，同源性为100％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定植物乳杆菌属于乳杆菌属。
利用上述植物乳杆菌制备果蔬酱的方法，按以下步骤进行：
一、原料选择：选用新鲜、无腐烂且无虫蚀的果蔬，用水清洗；
二、打浆：将清洗后的果蔬切成块，用胶体磨磨成浆；
三、灭菌：采用142℃3秒超高温瞬时灭菌机灭菌，冷却至37℃；
四、植物乳杆菌发酵：按果蔬酱中固形物重量的0.020％添加植物乳杆菌发酵剂冻干粉，37℃厌氧发酵48小时；
五、无菌灌装：将发酵好的果蔬酱在无菌条件下包装即为植物乳杆菌发酵果蔬酱。
步骤一中果蔬可选择两种以上，酸甜互补的营养价值高的果蔬类产品。
本发明的有益效果：
本发明以植物乳杆菌发酵剂制备果蔬酱，不仅不含糖、果胶、防腐剂和色素，保持原本的新鲜色彩和口味，还富含多酚类化合物和乳酸菌，因此具有抗氧化、增加保藏期、保持肠道菌群平衡的优点。另外，加入植物乳杆菌发酵剂后，可以节约生产时间减少抗菌剂的使用。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)rwh，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年11月28日，保藏编号为CGMCC No.10075。
本实施方式的植物乳杆菌呈长杆、短杆或弯曲杆状，也常有棒形和球杆状，一般成连排列。通常不运动，运动带鞭毛，无芽孢，革兰氏染色阳性。
本实施方式植物乳杆菌微好养，可在MRS培养基上生长，生长温度范围为2～53℃，最适生长温度为30～40℃，耐酸，最适pH为5.5～6.2，在中性或初始碱性条件下，通常会降低其生长速率，需要氨基酸、肽、盐类、脂肪酸或脂肪酸酯类及可发酵碳水化合物。
本实施方式植物乳杆菌能专性的分解糖，终产物中至少有一半是乳酸盐，副产物可能是乙酸、乙醇、CO2、甲酸盐或琥珀酸盐。不液化明胶，不分解酪素，不产生吲哚和H2S，无细胞色素，接触酶阴性，联苯胺反应阴性。
本实施方式植物乳杆菌由天然发酵的酸菜液中分离筛选得到，具体分离方法为：将10mL天然发酵酸菜汁接种于250mL MRS液体培养基中，于30℃富集培养48h，采用倒平板法，将富集培养的菌液混匀后，用移液枪取培养基，分别加入事先装有9mL的生理盐水并在高温灭菌锅中消毒的编号有103、104、105、107、108、109的试管中，每个试管加1mL的菌液。准备35个干燥灭菌后的培养皿，按MRS培养基配方再配置1L的固体培养基，待培养基的温度下降至50℃时，尽快将上述盛有不同稀释浓度的菌液，用移液枪吸取1mL，移至培养基皿底，然后倒入固体培养基，至于水平位置迅速的旋转培养皿，使其布满皿底。将不同稀释浓度的菌液，分别接种5个，等待培养基凝固后，放入37℃恒温箱中，培养3～5天。分别在稀释浓度为107、108、109的培养皿中挑取独立的菌落，接种于编号ABCDEF六只MRS液体培养基中，37℃培养4～6天，六种菌液各取20mL，用配好的1M氢氧化钠溶液滴定其产酸浓度，以产酸速度为指标对分离的植物乳杆菌进行筛选。最后选择rwh为最优菌。进行革兰氏染色，镜检，生理生化反应实验，条件符合植物乳杆菌微生物标准。
MRS培养基配方：酵母膏5g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，柠檬酸二铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58，硫酸锰0.25，吐温801mL，琼脂1.5％-2％，蒸馏水定容至1L，pH 6.2。
对筛选得到的植物乳杆菌进行16S rDNA测序鉴定，其16S rDNA序列长度为1437bp，16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示，测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对。同源性分析结果表明，该序列与乳杆菌属内各种之间有极高的同源性，同源性为100％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定植物乳杆菌属于乳酸菌属(Lactobacillus plantarum)。
具体实施方式二：本实施方式利用植物乳杆菌制备果蔬酱的方法，按以下步骤进行：
一、原料选择：选用新鲜、无腐烂且无虫蚀的果蔬，用水清洗；
二、打浆：将清洗后的果蔬切成块，用胶体磨磨成浆；
三、灭菌：采用142℃3秒超高温瞬时灭菌机灭菌，冷却至37℃；
四、植物乳杆菌发酵：按果蔬酱中固形物重量的0.020％添加植物乳杆菌发酵剂冻干 粉，37℃厌氧发酵48小时；
五、无菌灌装：将发酵好的果蔬酱在无菌条件下包装即为植物乳杆菌发酵果蔬酱。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤四中植物乳杆菌发酵剂冻干粉的制备方法为：
A、植物乳杆菌的活化：
量取10mL质量浓度0.9％的生理盐水于试管内，经121℃灭菌20分钟冷却至37℃，挑取植物乳杆菌rwh，在无菌状态下接种到0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在37℃恒温箱中静止活化30分钟，备用；
B、母发酵剂的制备：
取100mL MRS培养基于250mL三角瓶内，经121℃灭菌20分钟冷却至37℃，将步骤一活化后的菌液按体积百分含量10％的比例接种到MRS培养基中，在37℃静止培养24小时，作为母发酵剂。
C、生产发酵剂的制备：
首先配制200mL质量百分比浓度为10％的脱脂奶乳浊液置于500mL三角瓶内，121℃灭菌20分钟，然后冷却至37℃，将步骤二制备的母发酵剂按体积百分含量3％的比例接种到脱脂奶乳浊液中，37℃静止培养，培养至发酵液活菌数≥109个/mL，作为生产发酵剂；
D、粉末冻干菌种的制备：
将步骤三制备的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度0.8～1cm，加盖瓶塞后放入-30℃冰柜速冻，冻结后将玻璃安瓶用托盘盛放，放入冻干机进行冷冻干燥，制备植物乳杆菌发酵剂冻干粉。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式利用上述植物乳杆菌制备果蔬酱的方法，按以下步骤进行：
一、原料选择：选用新鲜、无腐烂且无虫蚀的果蔬，用水清洗；
二、打浆：将清洗后的果蔬切成块，用胶体磨磨成浆；
三、灭菌：采用142℃3秒超高温瞬时灭菌机灭菌，冷却至37℃；
四、植物乳杆菌发酵：按果蔬酱中固形物重量的0.020％添加植物乳杆菌发酵剂冻干粉，37℃厌氧发酵48小时；
五、无菌灌装：将发酵好的果蔬酱在无菌条件下包装即为植物乳杆菌发酵果蔬酱。
步骤四中植物乳杆菌发酵剂冻干粉的制备方法为：
A、植物乳杆菌的活化：
量取10mL质量浓度0.9％的生理盐水于试管内，经121℃灭菌20分钟冷却至37℃，挑取植物乳杆菌rwh，在无菌状态下接种到0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在37℃恒温箱中静止活化30分钟，备用；
B、母发酵剂的制备：
取100mL MRS培养基于250mL三角瓶内，经121℃灭菌20分钟冷却至37℃，将步骤一活化后的菌液按体积百分含量10％的比例接种到MRS培养基中，在37℃静止培养24小时，作为母发酵剂。
C、生产发酵剂的制备：
首先配制200mL质量百分比浓度为10％的脱脂奶乳浊液置于500mL三角瓶内，121℃灭菌20分钟，然后冷却至37℃，将步骤二制备的母发酵剂按体积百分含量3％的比例接种到脱脂奶乳浊液中，37℃静止培养，培养至发酵液活菌数≥109个/mL，作为生产发酵剂；
D、粉末冻干菌种的制备：
将步骤三制备的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度1cm，加盖瓶塞后放入-30℃冰柜速冻，冻结后将玻璃安瓶用托盘盛放，放入冻干机进行冷冻干燥，制备植物乳杆菌发酵剂冻干粉；
为验证本发明的有益效果，进行以下实验：
(一)植物乳杆菌对食品中常出现的细菌、酵母菌、霉菌的抑菌率实验
抑菌实验：将植物乳杆菌发酵剂冻干粉溶解于0.9％生理盐水中，配置一系列不同浓度的乳酸菌发酵剂的培养基。细菌制成含合适菌落数的菌悬液，接种于平板37℃培养，酵母菌和霉菌接种于沙氏液体培养基30℃摇床培养。以含有等量0.9％生理盐水的培养基作对照试验，以纯培养基作空白试验，每个浓度试验做2个平行样。
抑菌率计算：细菌按稀释分离平板菌落计算法，酵母菌用美兰染色液处理后在显微镜下直接计算，抑菌率＝N0-N1/N0×100％，式中N0为空白条件下的细菌数，N1为植物乳杆菌发酵剂下的细菌数。霉菌以干中法计算，将三角瓶中的培养液菌体用定量滤纸抽滤收集后，于105℃烘至恒重，抑菌率＝M0-M1/M0×100％,式中M0为空白条件下的菌体干质量(g)，M1植物乳杆菌发酵剂浓度下的菌体干质量(g)。
表1 植物乳杆菌发酵剂对细菌的抑菌率(％)
表2 植物乳杆菌发酵剂对酵母菌的抑菌率(％)
表3 植物乳杆菌发酵剂对霉菌的抑菌率(％)
以上实验所用的菌种都是由黑龙江省科学院大庆分院微生物所提供。
(二)植物乳杆菌对果蔬酱的保藏天数试验：
在无菌条件下，将植物乳杆菌发酵剂冻干粉按不同浓度接种于含有果蔬酱的试管中，振摇后密封，以原果蔬酱为空白，分别于30、37、45℃下培养，定期取果蔬酱测定菌数，以菌数＞100/mL为变质。结果如下表：单位(天)
表4 植物乳杆菌对果蔬酱的保藏天数
序列表
<110> 黑龙江省科学院大庆分院
<120> 一株植物乳杆菌及利用该菌株制备果蔬酱的方法
<160> 1
<210> 1
<211> 1437
<212>16S rDNA
<213>乳酸菌属（Lactobacillus plantarum）
<220>
<223> 植物乳杆菌16S rDNA序列
<400> 1
Ccctatactt gcaagtcgaa cgaactctgg tattgattgg tgcttgcatc atgatttaca 60
tttgagtgag tggcgaactg gtgagtaaca cgtgggaaac ctgcccagaa gcgggggata 120
acacctggaa acagatgcta ataccgcata acaacttgga ccgcatggtc cgagtttgaa 180
agatggcttc ggctatcact tttggatggt cccgcggcgt attagctaga tggtggggta 240
acggctcacc atggcaatga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac 300
tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa 360
agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa actctgttgt 420
taaagaagaa catatctgag agtaactgtt caggtattga cggtatttaa ccagaaagcc 480
acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt 540
attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc ttcggctcaa 600
ccgaagaagt gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat 660
gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg 720
tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagtat gggtagcaaa caggattaga taccctggta 780
gtccataccg taaacgatga atgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag 840
ctaacgcatt aagcattccg cctggggagt acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt 900
gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct 960
taccaggtct tgacatacta tgcaaatcta agagattaga cgttcccttc ggggacatgg 1020
atacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080
acgagcgcaa cccttattat cagttgccag cattaagttg ggcactctgg tgagactgcc 1140
ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg 1200
ctacacacgt gctacaatgg atggtacaac gagttgcgaa ctcgcgagag taagctaatc 1260
tcttaaagcc attctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agtcggaatc 1320
gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380
ccgtcacacc atgagagttt gtaacaccca aagtcggtgg ggtaaccttt taggaac 1437
Claims (3)
1.一株植物乳杆菌，其特征在于该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)rwh，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年11月28日，保藏编号为CGMCC No.10075。
2.利用植物乳杆菌制备果蔬酱的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、原料选择：选用新鲜、无腐烂且无虫蚀的果蔬，用水清洗；
二、打浆：将清洗后的果蔬切成块，用胶体磨磨成浆；
三、灭菌：采用142℃3秒超高温瞬时灭菌机灭菌，冷却至37℃；
四、植物乳杆菌发酵：按果蔬酱中固形物重量的0.020％添加植物乳杆菌发酵剂冻干粉，37℃厌氧发酵48小时；
五、无菌灌装：将发酵好的果蔬酱在无菌条件下包装即为植物乳杆菌发酵果蔬酱。
3.根据权利要求2所述的利用植物乳杆菌制备果蔬酱的方法，其特征在于步骤四中植物乳杆菌发酵剂冻干粉的制备方法为：
A、植物乳杆菌的活化：
量取10mL质量浓度0.9％的生理盐水于试管内，经121℃灭菌20分钟冷却至37℃，挑取植物乳杆菌rwh，在无菌状态下接种到0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在37℃恒温箱中静止活化30分钟，备用；
B、母发酵剂的制备：
取100mL MRS培养基于250mL三角瓶内，经121℃灭菌20分钟冷却至37℃，将步骤一活化后的菌液按体积百分含量10％的比例接种到MRS培养基中，在37℃静止培养24小时，作为母发酵剂。
C、生产发酵剂的制备：
首先配制200mL质量百分比浓度为10％的脱脂奶乳浊液置于500mL三角瓶内，121℃灭菌20分钟，然后冷却至37℃，将步骤二制备的母发酵剂按体积百分含量3％的比例接种到脱脂奶乳浊液中，37℃静止培养，培养至发酵液活菌数≥109个/mL，作为生产发酵剂；
D、粉末冻干菌种的制备：
将步骤三制备的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度0.8～1cm，加盖瓶塞后放入-30℃冰柜速冻，冻结后将玻璃安瓶用托盘盛放，放入冻干机进行冷冻干燥，制备植物乳杆菌发酵剂冻干粉。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150429 |