CN104560725B - 基于流式细胞技术高通量筛选产乙醇真菌的试剂盒及其应用 - Google Patents

基于流式细胞技术高通量筛选产乙醇真菌的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于流式细胞技术高通量筛选产乙醇真菌的试剂盒及其应用，该试剂盒包括盒体与试剂，还包括细胞培养板、离心管和铜筛，所述的试剂为：试剂A：柠檬酸：6.15g；柠檬酸钠：17.544g；1000mL；试剂B：碘化丙啶（PI）：0.3mg；2,7‑二氢二氯荧光黄双乙酸钠：0.3mg；试剂C：葡萄糖：2g，50mL；试剂D：葡萄糖：12g，50mL；试剂E：酵母粉：0.5g；胰蛋白胨：0.5g；磷酸氢二铵：0.05g；硫酸镁：0.025g，pH 5.5，50mL；试剂F：酵母粉：0.05g；胰蛋白胨：0.05g；磷酸氢二铵：0.05g；硫酸镁：0.025g，pH 5.5，50mL。

Description

基于流式细胞技术高通量筛选产乙醇真菌的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种基于流式细胞技术高通量筛选产乙醇真菌的试剂盒及其应用。
背景技术
生物质能源是未来可持续能源***的重要组成部分， 从本世纪开始，生物能进入可再生资源的研究领域，其以无污染，效率高等优点成为世界上利用能源的主要方向，因此目前开发利用生物能已成为各国的共同目标。而在生物能源当中，目前研究最广泛，最有效果的就是生物乙醇的利用和开发。由目前的社会的科技水平和发展的程度而言，在能够预见的未来几十年中燃料乙醇是完全有可能实现产业化生产的。
优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌株，性能优良的菌株可以为生产带来很高的经济效益。目前在高产乙醇酿酒酵母筛选的方法主要有，高浓度酒精平板筛选法、TTC复合平板筛选法等。这些方法工作量都很大，在进行菌落筛选时，往往依靠实验人员经验，凭借肉眼观察，选择目的菌株，存在盲目性，大大降低了筛选效率。
活性氧(reactive oxygen species, ROS)是指氧的某些衍生物如超氧负离子(O2-)、羟自由基(OH·)和过氧化氢(H2O2)等,过量的ROS能够使生物大分子如DNA、蛋白质、脂类发生过氧化链式反应,造成细胞结构的损伤,影响生理活性。Howlett检测了铜离子所引起的酿酒酵母胞内ROS的变化,发现ROS水平对细胞周期有一定影响。有研究表明，酵母细胞整体活性以及产醇能力与其体内ROS的水平呈一定程度的负相关关系，这为我们以对数期酵母体内ROS的含量作为筛选条件提供了有力的支撑。
流式细胞技术(Flow cytometry, FCM)能够快速地对个体细胞进行光化学分析,使研究人员建立个体细胞在群体中的多维表象,与常规的细胞计数方法相比具有很多优势,如精确度高,重复性好等优点。它用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。通过使用特定的染料对样品进行染色，从而激发检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于流式细胞技术高通量筛选产乙醇真菌的试剂盒及其应用，该试剂盒基于流式细胞技术，利用真菌细胞整体活性以及产醇能力与其体内ROS的水平呈一定程度的负相关关系，来判断被测真菌的产醇能力，应用该试剂盒可以快速高效的筛选高产乙醇的真菌，提高工业筛选效率。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
基于流式细胞技术高通量筛选产乙醇真菌的试剂盒，包括盒体与试剂，还包括细胞培养板、离心管和铜筛，所述的试剂包括试剂A、B、C、D、E、F各一瓶：
试剂A：柠檬酸：6.15g；柠檬酸钠：17.544g；加双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后封装；
试剂B：碘化丙啶（PI）：0.3mg；2,7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠：0.3mg；
试剂C：葡萄糖：2g，加双蒸水定容至50mL，高压灭菌后封装；
试剂D：葡萄糖：12g，加双蒸水定容至50mL，高压灭菌后封装；
试剂E：酵母粉：0.5g；胰蛋白胨：0.5g；磷酸氢二铵：0.05g；硫酸镁：0.025g，加双蒸水40mL溶解，用NaOH溶液调节pH至5.5，再用双蒸水定容至50mL，高压灭菌后封装；
试剂F：酵母粉：0.05g；胰蛋白胨：0.05g；磷酸氢二铵：0.05g；硫酸镁：0.025g，加双蒸水40mL溶解，用NaOH溶液调节pH至5.5，再用双蒸水定容至50mL，高压灭菌后封装。
所述细胞培养板为48孔~96孔细胞培养板。
所述离心管为0.5~1.5mL离心管。
所述铜筛为200~400目。
所述细胞培养板为1~2块，离心管为48~96支，铜筛1只。
所述试剂B分装在棕色离心管中。
所述NaOH溶液浓度为1~5mol/L。
所述细胞培养板、离心管和铜筛均进行过灭菌处理，可以是紫外照射灭菌，也可以是高温加热灭菌。所述试剂盒保存在4℃条件下。
所述基于流式细胞技术高通量筛选产乙醇真菌的试剂盒在筛选产乙醇真菌中的应用。
所述的应用，包括如下步骤：
试剂B：碘化丙啶（PI）：0.3mg；2,7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠（DCFH-DA）：0.3mg；临用时加无菌双蒸水定容至3mL，暗处滤过消毒，现配现用；
试剂E与试剂C充分混合，4℃保存备用；
试剂F与试剂D充分混合，4℃保存备用；
本发明试剂盒使用方法如下：
1）、试剂B的配置：碘化丙啶（PI）：0.3mg；2,7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠（DCFH-DA）：0.3mg；临用时加无菌双蒸水定容至3mL，暗处滤过消毒，现配现用；
2）、菌悬液的制备
取被测菌液1mL于4℃、5500r/min离心10min，弃去上层清液，菌体沉淀用试剂A清洗两边，再用1mL试剂A悬浮，获得菌悬液，备用；
3）、根据需要对菌悬液进行各种诱变处理，例如化学诱变、紫外照射诱变、离子束注入诱变等处理后获得诱变后的菌悬液，备用；
4）、将试剂C与试剂E充分混合，在孔板中加入试剂C+E，添加量为500-1000μl/孔；向步骤2）获得的菌悬液中加入30μl试剂B，于37℃避光放置10min，用300目铜筛过滤后，于流式细胞仪上检测，用孔板进行收集，每个孔收集1×104个菌体；放入恒温摇床，37℃，250r/min培养24h；
5）、将试剂D与试剂F充分混合，分装至无菌的10mL离心管中，5mL/管；
6）、将步骤4）中所得到的菌液，一一对应的加至步骤五所准备好的离心管中，500-1000μl/管；放入恒温摇床，37℃，150r/min培养60h；
7）、检测步骤6）所得到的发酵液中酒精的含量。
有益效果：本发明提供的基于流式细胞技术高通量筛选产乙醇真菌的试剂盒及其应用，该试剂盒基于流式细胞技术，利用真菌细胞整体活性以及产醇能力与其体内ROS的水平呈一定程度的负相关关系，来判断被测真菌的产醇能力，应用该试剂盒可以快速高效的筛选高产乙醇的真菌，提高工业筛选效率，节约劳动成本，同时试剂盒所用试剂量少，可同时筛选48~96个样品，大大提高效率。
具体实施方式
下面结合具体实例，对本发明做详细描述。
实施例1
用本发明试剂盒测定离子束注入对酿酒酵母体内ROS含量的影响
一、配置溶液
试剂B：碘化丙啶（PI）：0.3mg；2,7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠（DCFH-DA）：0.3mg，分装在棕色离心管中，避光保存，加无菌双蒸水定容至3mL，暗处滤过消毒，现配现用；
二、测定离子束注入对酿酒酵母体内ROS含量的影响
1.对酿酒酵母进行离子束注入
（a）培养好的菌液于4℃、5500r/min离心10min，弃去上层清液，试剂A清洗两遍，再用试剂A悬浮酵母细胞沉淀物，留待N+注入处理。
（b）用灭菌的保护液（0.5%(wt)淀粉和0.5%(wt)葡萄糖）稀释上述菌悬液，取稀释液100μL，用无菌玻璃刮铲均匀涂布于直径为90mm的无菌培养皿中央，无菌风吹干制成菌膜。将制备的菌膜分别置于离子注入机真空靶室的无菌靶台上，在1×10-3pa真空状态下采用能量为15KeV，剂量分别为0、4×1015、5×1015、6×1015、8×1015、10×1015、11×1015ions/cm2，的N+注入酵母菌膜，分别以1.5mL试剂A浸泡、洗脱，获得洗脱下来的菌液，将获得的菌液依次命名ck、a、b、c、d、e、f。
2.试剂盒测定
（a）取被测菌液ck、a、b、c、d、e、f各1mL于4℃、5500r/min离心10min，弃去上层清液，菌体沉淀用试剂A清洗一遍，再用1mL试剂A悬浮，获得菌悬液，备用；
（b）将试剂C与试剂E充分混合，在48孔板中加入试剂C+E，添加量为500-1000μl/孔；
（c）向步骤（a）获得的菌悬液中加入30μl试剂B，于37℃避光放置10min，用300目铜筛过滤后，于流式细胞仪上检测，用步骤（b）中所准备好的48孔板进行收集，每个孔收集1×104个菌体，，放入恒温摇床，37℃，250r/min培养24h，得到菌液；
（d）将试剂D与试剂F充分混合，分装至48支无菌的10mL离心管中，5mL/管；
（e）将步骤（c）中所得到的菌液，一一对应的加至步骤（d）所准备好的离心管中，1000μl/管；放入恒温摇床，37℃，150r/min培养60h；
三、检测结果如表1。
表1：
N+离子注入剂量（×1015ions/cm2） 0 4 5 6 8 10 11
DCF荧光强度 65.38 142.38 234.65 139.63 198.55 248.89 265.87
实施例2
用本发明试剂盒测定紫外线照射诱变对酿酒酵母体内ROS含量的影响
一、配置溶液
试剂B：碘化丙啶（PI）：0.3mg；2,7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠（DCFH-DA）：0.3mg，分装在棕色离心管中，避光保存，加无菌双蒸水定容至3mL，暗处滤过消毒，现配现用；
二、测定紫外线照射对酿酒酵母体内ROS含量的影响
1.对酿酒酵母进行紫外照射
（a）培养好的菌液于4℃、5500r/min离心10min，弃去上层清液，试剂A清洗两遍，再用试剂A悬浮酵母细胞沉淀物，留待紫外辐照注入处理。
（b）用无菌水稀释步骤（a）中的菌悬液，取 2 mL于U = 75 mm 的无菌培养皿中，置于30W紫外灯下30cm处，分别照射处理：30 s、45 s、90 s、120 s、180 s、240 s，每个处理重复3 次，每次紫外照射后在黑暗培养箱中静置30min 。以不进行照射作对照， 紫外线照射以后的操作都在黑暗中进行， 防止光修复。将获得的菌液依次命名ck1、a1、b1、c1、d1、e1、f1。
2． 试剂盒测定
（a）取被测菌液ck1、a1、b1、c1、d1、e1、f1。各1mL于4℃、5500r/min离心10min，弃去上层清液，菌体沉淀用试剂A清洗一边，再用1mL试剂A悬浮，获得菌悬液，备用；
（b）将试剂C与试剂E充分混合，在48孔板中加入试剂C+E，添加量为500-1000μl/孔；
（c）向步骤（a）获得的菌悬液中加入30μl试剂B，于37℃避光放置10min，用300目铜筛过滤后，于流式细胞仪上检测，用步骤（b）中所准备好的48孔板进行收集，每个孔收集1×104个菌体，；放入恒温摇床，37℃，250r/min培养24h；
（d）将试剂D与试剂F充分混合，分装至48支无菌的10mL离心管中，5mL/管；
（e）将步骤（c）中所得到的菌液，一一对应的加至步骤（d）所准备好的离心管中，1000μl/管；放入恒温摇床，37℃，150r/min培养60h；
三、检测结果如表2所示。
表2：
紫外辐照时间（s） 0 30 45 90 120 180 240
DCF荧光强度 65.38 142.38 234.65 348.69 473.82 643.19 753.28
实施例3
用本发明试剂盒高通量筛选产乙醇酿酒酵母
一、对酿酒酵母进行诱变
将出发菌株酿酒酵母S23（所用出发菌株为实验室筛选得到，在专利201410495426.9中已经报道过，且本发明仅作为示例，并不涉及具体菌株的保护）制成细胞悬液，调整细胞浓度为106个/毫升，然后将菌液于4℃、5500r/min离心10min，弃去上层清液，试剂A清洗两遍，再用试剂A悬浮酵母细胞沉淀物，进行诱变处理。诱变处理为：不同紫外照射强度照射处理，不同离子束注入处理，然后挑选不同诱变菌液合计48份。
二、 试剂盒筛选
（a）取诱变后的菌液各1mL于4℃、5500r/min离心10min，弃去上层清液，菌体沉淀用试剂A清洗一边，再用1mL试剂A悬浮，获得菌悬液，备用；
（b）将试剂C与试剂E充分混合，在48孔板中加入试剂C+E，添加量为500-1000μl/孔；
（c）向步骤（a）获得的菌悬液中加入30μl试剂B，于37℃避光放置10min，用300目铜筛过滤后，于流式细胞仪上检测，用步骤（b）中所准备好的48孔板进行收集，收集DCF荧光强度小于200的菌体，每个孔收集1×104个菌体，放入恒温摇床，37℃，250r/min培养24h；
（d）将试剂D与试剂F充分混合，分装至48支无菌的10mL离心管中，5mL/管；
（e）将步骤（c）中所得到的菌液，一一对应的加至步骤（d）所准备好的离心管中，1000μl/管；放入恒温摇床，37℃，150r/min培养60h；
（f）测定步骤（e）所得到的发酵液中的酒精含量，筛选酒精含量高的菌株。
三、实验结果
同时筛选的48株菌液中，乙醇含量(mL/L)分别如表3所示，其中出发菌株的乙醇含量为60 mL/L。
表3：
[60,70） [70,80） [80,90） [90,100） [100,110） [110,120） [120,+∞）
2 2 4 7 18 9 6
表中[a,b）为范围在a与b之间，包括a，但不包括b。从表3中可以看出，不用诱变得到不同产乙醇能力的酵母，使用该试剂盒筛选，可以同时考察多株菌株的发酵能力，试剂用量少，筛选效率高。
以上实施例仅仅是对本发明的进一步解释说明，并不作为对本发明保护范围的限制，本发明试剂盒可以根据待测菌株的数目选择细胞培养板的孔数以及离心管的数目，同时对不同诱变条件的菌株进行产乙醇能力筛选，操作简单，试剂用量少，筛选效率高，大大减少劳动付出。

Claims (6)

1.基于流式细胞技术高通量筛选产乙醇真菌的试剂盒，包括盒体与试剂，其特征在于：还包括细胞培养板、离心管和铜筛，所述细胞培养板为48孔~96孔细胞培养板，所述的试剂包括试剂A、B、C、D、E、F各一瓶：
试剂A：柠檬酸：6.15g；柠檬酸钠：17.544g；加双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后封装；
试剂B：碘化丙啶：0.3mg；2,7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠：0.3mg；试剂B分装在棕色离心管中；
试剂C：葡萄糖：2g，加双蒸水定容至50mL，高压灭菌后封装；
试剂D：葡萄糖：12g，加双蒸水定容至50mL，高压灭菌后封装；
试剂E：酵母粉：0.5g；胰蛋白胨：0.5g；磷酸氢二铵：0.05g；硫酸镁：0.025g，加双蒸水40mL溶解，用NaOH溶液调节pH至5.5，再用双蒸水定容至50mL，高压灭菌后封装；
试剂F：酵母粉：0.05g；胰蛋白胨：0.05g；磷酸氢二铵：0.05g；硫酸镁：0.025g，加双蒸水40mL溶解，用NaOH溶液调节pH至5.5，再用双蒸水定容至50mL，高压灭菌后封装。
2.根据权利要求1所述基于流式细胞技术高通量筛选产乙醇真菌的试剂盒，其特征在于：所述离心管为0.5~1.5mL离心管。
3.根据权利要求1所述基于流式细胞技术高通量筛选产乙醇真菌的试剂盒，其特征在于：所述铜筛为200~400目。
4.根据权利要求1所述基于流式细胞技术高通量筛选产乙醇真菌的试剂盒，其特征在于：所述细胞培养板为1~2块，离心管为48~96支，铜筛1只。
5.根据权利要求1所述基于流式细胞技术高通量筛选产乙醇真菌的试剂盒，其特征在于：所述NaOH溶液浓度为1~5mol/L。
6.权利要求1~5中任意一项所述基于流式细胞技术高通量筛选产乙醇真菌的试剂盒在筛选产乙醇真菌中的应用。
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