CN104558199B - 一种治疗高胆固醇血症的融合蛋白制备及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种结合PCSK9的融合蛋白，其融合蛋白由以下通式表示：X‑连接肽‑Y‑连接肽‑Z‑连接肽‑IgG Fc片段；其中，X，Y，Z为LDL‑R(低密度脂蛋白受体)中EGF(A)区多肽突变体，连接肽为(GGGGS)n。本发明所提供的融合蛋白能高亲和结合PCSK9，抑制PCSK9对肝细胞LDL‑R的降解，增加肝细胞对LDL‑C的摄取，使其在治疗高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症等疾病方面具有明显的优势和良好的前景。

Description

一种治疗高胆固醇血症的融合蛋白制备及其用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种新型融合蛋白的制备及其用途。

背景技术

高胆固醇血症以脂蛋白代谢紊乱或血脂紊乱，尤以血液胆固醇低密度脂蛋白(LDL)升高为特征,可致卒中、冠心病、下肢血管病以及动脉粥样硬化等疾病。目前，治疗药物主要为他汀类药物，该类药物可明显降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，LDL-C水平与冠心病的风险密切相关。因此，降低LDL-C是目前降脂治疗指南中的首选目标。但是，高胆固醇血症的治疗现状不容乐观，大部分高危和极高危患者均未达到LDL-C目标值，即便使用最好的他汀类药物或增加药物剂量也不能使其达标。究其原因，临床长期使用他汀类药物治疗可刺激一种丝氨酸蛋白酶─前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)的表达，PCSK9为低密度脂蛋白受体(LDL-R)的负调节剂，在与肝细胞表面的LDL-R结合后可加速其降解，导致肝细胞以及LDL-R对胆固醇的摄取下降，进而增加循环的LDL-C水平，最终影响患者的治疗效果。由此，PCSK9也成为治疗高胆固醇血症的重要靶点。

针对PCSK9，国外已发展多个治疗性单克隆抗体，且均在临床试验中显示良好的疗效，如赛诺菲与Regeneron联手开发的alirocumab，安进公司同类产品evolocumab，均显著降低健康受试者、家族性高脂血症患者和非家族性高胆固醇血症患者的LDL-C水平；对于他汀类药物效果不佳的患者，在注射单克隆抗体后其血液LDL-C水平也降低40％-72％。

单抗良好的治疗效果鼓舞人们思考并发展更多针对PCSK9的新药，如研究发现，重组可溶性LDL-R的EGF-A区可以阻断PCSK9与LDL-R的结合及相互作用，并达到降低胆固醇的目的；专利(申请号：20128003049.9)公开了一种结合PCSK9的多肽及其使用方法，包括表皮生长因子结构域(EGF-A)及其突变体，以及与PCSK9高亲和结合的能力。此外，通过反义核酸以及RNA干扰在基因水平也能明显阻断PCSK9的作用，甚至采用小分子化合物抑制PCSK9的mRNA表达，也能明显降低胆固醇的作用。显然，各种阻断PCSK9的方法均可能成为治疗性单抗之后的抗PCSK9新药。

本发明提供了一种重组可溶性EGF-A突变体融合蛋白，该融合蛋白能高亲和结合PCSK9，并能有效抑制PCSK9生物活性，最终发挥降低胆固醇的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种融合蛋白，该融合蛋白针对LDLR中EGF(A)区的氨基酸替换/突变与人IgG FC融合蛋白(用3mEGF-FC表示)，增强EGF-FC与PCSK9的结合作用，有效抑制PCSK9活性。

本发明提供的融合蛋白由DNA重组技术或基因工程手段实现，并由以下通式表示：

X-连接肽-Y-连接肽-Z-连接肽-IgG Fc片段；其中，X、Y、Z为人LDLR(低密度脂蛋白受体)中EGF(A)多肽突变体；连接肽为(GGGGS)n。

本发明提供的融合蛋白，由人LDLR中EGF(A)区多肽突变体与人免疫球蛋白Fc片段连接形成融合蛋白，其具体序列如下：

EGF(A)多肽突变体的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO：1、3、5所述；

IgG1 Fc的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO：15所述；

IgG2 Fc的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO：17所述；

IgG3 Fc的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO：19所述；

IgG4 Fc的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO：21所述。

3mEGF-FC融合蛋白核苷酸如序列表中的SEQ ID NO：23所述。

编码所述上述融合蛋白核苷酸序列如下：

EGF(A)的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO：2、4、6所述；

IgG1 Fc的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO：16所述；

IgG2 Fc的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO：18所述；

IgG3 Fc的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO：20所述；

IgG4 Fc的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO：22所述。

3mEGF-FC融合蛋白核苷酸如序列表中的SEQ ID NO：24所述。

本发明同时提供了上述核酸序列的表达载体，其能在所转化的宿主细胞中复制表达。

本发明还提供了一种制备融合蛋白的方法，将上述表达载体引入合适的表达***，从而进行融合蛋白的表达。

本发明进一步提供了一种药物组合物，其由上述融合蛋白与药学上可接受的载体或赋形剂组成；所述药物组合物的制剂形式优选为注射剂、注射用冻干粉针。

本发明还提供了上述融合蛋白在制备预防和治疗高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症、由PCSK9诱发的代谢性疾病等疾病药物中的用途。

本发明融合蛋白的表达载体，可以是重组真核表达载体，优选哺乳动物细胞表达载体；也可以是重组病毒表达载体，优选腺相关病毒或腺病毒载体。

含有表达上述融合蛋白的宿主细胞，可以为DG44、CHO细胞及其亚系或293细胞及其亚系。

附图说明

图1 本发明融合蛋白对PCSK9降解肝细胞LDL-R的影响

图2 本发明融合蛋白对肝细胞摄取LDL-C的影响

具体实施方式

提供以下实施例对本发明作进一步阐释。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。

实施例1 融合蛋白的制备

1、质粒构建

1.1基因和引物合成

表达序列通过下述合成的基因和引物重组至表达载体。基因和引物由专业公司北京金唯智公司合成，合成基因序列重组至质粒载体pUC19中，命名为pUC19-EGFwt、pUC19-mEGF₁₄、pUC19-mEGF₁₆和pUC19-3M EGF。

合成融合蛋白基因片段:

EGFwt：

ATCACCGGTATGGGGCCCTGGGGCTGGAAATTGCGCTGGACCGTCGCCTTGCTCCTCGCCGCGGCGGGGACTGGGACCAACGAATGCTTGGACAACAACGGCGGCTGTTCCCACGTCTGCAATGACCTTAAGATCGGCTACGAGTGCCTGTGCCCCGACGGCTTCCAGCTGGTGGCCCAGCGAAGATGCGAAGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCAC

mEGF₁₄：

ATCACCGGTATGGGGCCCTGGGGCTGGAAATTGCGCTGGACCGTCGCCTTGCTCCTCGCCGCGGCGGGGACTGGGACCAACGAATGCTTGGACAACAACGGCGGCTGTTCCTACGTCTGCAATGACCTTAAGATCGGCTACGAGTGCCTGTGCCCCGACGGCTTCCAGCTGGTGGCCCAGCGAAGATGCGAAGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCAC

mEGF₁₆：

ATCACCGGTATGGGGCCCTGGGGCTGGAAATTGCGCTGGACCGTCGCCTTGCTCCTCGCCGCGGCGGGGACTGGGACCAACGAATGCTTGGACAACAACGGCGGCTGTTCCCACGTCTACAATGACCTTAAGATCGGCTACGAGTGCCTGTGCCCCGACGGCTTCCAGCTGGTGGCCCAGCGAAGATGCGAAGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCAC

3mEGF：

CCTAGGGCCACCATGGGGCCCTGGGGCTGGAAATTGCGCTGGACCGTCGCCTTGCTCCTCGCCGCGGCGGGGACTGGGACCAGCGAATGCTTGGACAACAACGGCGGCTGTTCCCACGTCTGCAATGACCTTAAGATCGGCTACGAGTGCCTGTGCCCCGACGGCTTCCAGCTGGTGGCCCAGCGAAGATGCGAAGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGATCCGGGACCAACGAATGCTTGGACAACAACGGCGGCTGTTCCCACGTCTACAATGACCTTAAGATCGGCTACGAGTGCCTGTGCCCCGACGGCTTCCAGCTGGTGGCCCAGCGAAGATGCGAAGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGATCCGGGACCAACGAATGCTTGGACAACAACGGCGGCTGTTCCCACGTCTGCAATGACCTTAAGATCGGCTACGAGTGCCCGTGCCCCGACGGCTTCCAGCTGGTGGCCCAGCGAAGATGCGAAGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCAC

合成引物:

E1：5’-ATCCCTAGGGCCACCATGGGGCCCTGGGGCTGGAAATTGCGCTGGACCGTC-3’

E2：5’-GTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGATCCT-3’

E3：5’-GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC-3’

E4：5’-GTCGTATACTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3’

1.2基因片段的扩增

利用特异引物E1和E2通过PCR方法扩增获得部分基因片段。PCR反应体系1(总体积50μl)：5×Buffer 10μl、dNTP 2μl、引物1μl(E1和E2)、模板分别为合成片段pUC19-EGFwt、pUC19-mEGF₁₄、pUC19-mEGF₁₆和pUC19-3mEGF质粒1μl、Phusion酶0.5μl，最后用双蒸水补至50μl；反应条件：98℃预变性30s，98℃10s、55℃30s、72℃30s，30个循环，最后72℃5min。基因产物以琼脂糖凝胶电泳检测，获得基因片段命名为EGFwt、mEGF₁₄、mEGF₁₆和3mEGF。

利用特异引物E3和E4通过PCR方法扩增获得部分基因片段。PCR反应体系2(总体积50μl)：5×Buffer 10μl、dNTP 2μl、引物1μl(E3和E4)、模板为pFUSE-hIgG1-Fc质粒1μl、Phusion酶0.5μl，最后用双蒸水补至50μl；反应条件：98℃预变性30s，98℃10s、55℃30s、72℃30s，30个循环，最后72℃5min。基因产物以琼脂糖凝胶电泳检测，获得基因片段命名为Fc。

利用特异引物E1和E4通过桥接PCR方法扩增获得目的基因片段。PCR反应体系3(总体积50μl)：5×Buffer 10μl、dNTP 2μl、引物1μl(P1和P2)、模板为上述扩增基因片段EGFwt、mEGF₁₄、mEGF₁₆、3mEGF分别和Fc混合各1μl、Phusion酶0.5μl，最后用双蒸水补至50μl；反应条件：98℃预变性30s，98℃10s、68℃60s 3个循环，98℃10s、55℃30s、72℃50s，30个循环，最后72℃5min。基因产物以琼脂糖凝胶电泳检测，获得基因片段命名为EGFwt-Fc、mEGF₁₄-Fc、mEGF₁₆-Fc和3mEGF-Fc。

1.3载体和基因片段的酶切处理

对pCHO1.0质粒和EGFwt-Fc、mEGF₁₄-Fc、mEGF₁₆-Fc和3mEGF-Fc基因片段分别进行双酶切处理，酶切体系的建立：在1.5ml EP管中加入如下成分：酶切体系1的建立：在1.5mlEP管中加入如下成分：pCHO1.0质粒或EGFwt-Fc、mEGF₁₄-Fc、mEGF₁₆-Fc和3mEGF-Fc基因片段40μl，Buffer410μl，AvrⅡ和BstZ17I各5μl，灭菌水45μl，混匀后在37℃下反应5h，利用QIAGEN产物纯化试剂盒回收。

1.4重组质粒的连接转化

在T4连接酶的作用下，将已用相同酶切后回收获得的基因片段pCHO1.0(AvrⅡ和BstZ17I)大片段分别和酶切过后的EGFwt-Fc(AvrⅡ和BstZ17I)、mEGF₁₄-Fc(AvrⅡ和BstZ17I)、mEGF₁₆-Fc(AvrⅡ和BstZ17I)和3mEGF-Fc(AvrⅡ和BstZ17I)基因片段连接。连接反应体系如下：在1.5ml EP管中加入如下成分pCHO1.0(AvrⅡ和BstZ17I)2μl，EGFwt-Fc(AvrⅡ和BstZ17I)或mEGF₁₄-Fc(AvrⅡ和BstZ17I)或mEGF₁₆-Fc(AvrⅡ和BstZ17I)或3mEGF-Fc(AvrⅡ和BstZ17I)6μl，10×T4 Buffer 1μl，T4 DNA ligase 1μl，混匀后在室温(20℃左右)下反应4h以上，连接产物转化至Top10大肠杆菌感受态细胞中，涂布于2YT(KANA)平板培养基上37℃静止过夜，平板编号pCHO-EGFwt-Fc、pCHO-mEGF₁₄-Fc、pCHO-mEGF₁₆-Fc和pCHO-3mEGF-Fc。

1.5重组质粒的菌落PCR筛选

从pCHO-EGFwt-Fc、pCHO-mEGF₁₄-Fc、pCHO-mEGF₁₆-Fc和pCHO-3mEGF-Fc平板中各挑取数个重组单菌落经过培养后做为PCR模板，分别进行PCR筛选鉴定。菌液PCR扩增反应体系(总体积20μL):2×Taq HS 10μL、菌液模板2μL、上下游引物(E1和E4)各1μL(终浓度0.3μmol/L)，最后用双蒸水补至20μL；反应条件:95℃3min，94℃60s、53℃60s、72℃90s，30个循环；最后72℃5min。琼脂糖凝胶电泳分析结果。

1.6重组质粒的酶切鉴定

通过菌落PCR鉴定正确的菌落接种后提取再进行酶切鉴定。首先进行重组菌的质粒提取，然后进行酶切分析，酶切体系：在1.5ml EP管中加入如下成分：质粒2μl，Buffer11μl，BSA0.1μl，AvrⅡ和BstZ17I各1μl，补灭菌水至10μl，混匀后在37℃下反应4h。琼脂糖凝胶电泳分析结果。

1.7重组质粒的测序鉴定

将通过菌落PCR和酶切鉴定正确的菌落随机接种数个菌落再进行测序鉴定。提供菌液样品重组质粒送至公司进行测序鉴定。表达质粒保存备用。

2、质粒转染及细胞筛选

质粒提取采用QIAGEN Plasmid Midi Kit，采用宿主细胞CHO-S或DG44，按照Freedom^TMCHO-S^TM Kit试剂盒说明书分别进行质粒转染。转入质粒的细胞分别置于摇瓶培养(37℃、8％CO2、110rpm/min)至48h，细胞计数仪检测细胞活率和细胞数。

转染48h后进行两步加压筛选：10P/100M，20P/200M(P＝10μg/mL Puromycin，M＝nM MTX)；30P/500M，50P/1000M，获得初筛细胞。以有限稀释法进行单克隆细胞筛选，通过检测蛋白表达量以及纯度从中优选克隆逐级扩大培养。

3、蛋白表达和纯化

筛选高产克隆细胞从96孔板扩至24孔板生长，然后扩至6孔板生长，之后扩至50mL摇瓶生长。

收集培养7天细胞培养上清液，离心除去细胞碎片，上清液以0.45μm滤膜过滤，调节pH至7.4，用HiTrap Protein-A Sepharose affinity column纯化融合蛋白，5倍柱床体积的去离子水冲洗柱子，再用5倍柱床体积的PBS缓冲液(20mM磷酸盐，pH 7.4)平衡柱子，上样，收集流出液检测，用10倍体积PBS缓冲液(0.02mol/L磷酸盐，pH 7.4)洗涤除去杂蛋白，然后使用0.1M甘氨酸缓冲液(pH3)将目的蛋白从柱上洗脱，以SDS-PAGE检测蛋白纯度在90％以上。

实施例2融合蛋白生物活性测定

EGF-Fc融合蛋白与PCSK9的结合亲和力通过生物膜干涉法测定在Otect QK(Fortebio)上测量。SA sensor传感器(Fortebio，货号18-5063)被固化在含0.5％BSA和1mMCaCl2的TrisHCl pH 7.4缓冲液中的PCSK9，在相同缓冲液中进行洗涤，并且将其转移到含有在相同缓冲液中的浓度为0-500nM的EGF-FC融合蛋白的孔中。将针对仅含有缓冲液的参比孔的信号从所有结合数据中减去。亲和力KD通过拟合为稳态算法使用Octet软件获得。概括在表I中的确定的KD值显示：与EGFwt-Fc相比，mEGF-Fc突变体及3mEGF-FC串联突变融合蛋白的亲和力增加15至50倍。

表I，EGFwt-Fc、mEGF-Fc突变体及3mEGF-FC串联突变与PCSK9的结合亲和力。KD值通过将数据拟合为稳态方程来确定。数据以mean±SD表示。

重组融合蛋白	KD值(nM)
		EGFwt-Fc	798±90
mEGF14-Fc	121±14
		mEGF16-Fc	58±9
3mEGF-Fc	17±4

实施例3融合蛋白生物活性测定

人肝癌HepG2细胞培养至对数生长期，用PBS洗细胞一次，经胰酶消化制成细胞悬液并调整细胞密度为1×10⁶cells/ml。接种细胞于96孔培养板(100μl/孔)，边缘孔加入200μl培养基。置培养板于37℃、5％CO₂培养箱中，继续培养24小时。去除细胞培养上清，每孔加入100μl无血清细胞培养基，CO2培养箱继续培养16小时；弃上清，再次换成无血清细胞培养基，加入PCSK9(终浓度25μg/ml)，同时分别加入EGFwt-FC(10～50μM)或3mEGF-Fc(03～3μM)置37℃，5％CO2培养箱孵育4小时；再加入(终浓度为6μg/ml)孵育3h，去上清，用PBS冲洗细胞3次，置于倒置荧光显微镜下观察并获取图像，所获结果再进行荧光定量；另外取细胞按照前述方法处理细胞，分别加入PCSK9(终浓度25μg/ml)和EGFwt-FC(10～50μM)或3mEGF-Fc(03～3μM)作用4小时后，收获细胞，采用免疫荧光技术，观察LDL-R的表达或降解，并进行荧光定量。

用本发明提供的EGFwt-FC和3mEGF-Fc融合蛋白干预PCSK9处理HepG2细胞，结果显示，本发明EGFwt-FC和3mEGF-Fc融合蛋白均能明显抑制PCSK9对LDL-R的降解(图1)；与此一致，本发明EGFwt-FC和3mEGF-Fc也明显增加肝细胞对LDL-C的摄取(图2)，3mEGF-Fc抑制PCKS9活性以及增加肝细胞对LDL-C摄取的作用最为明显，且呈现明显的浓度依赖关系，说明由EGF氨基酸突变而成的3mEGF-FC生物活性明显增强。

Claims (8)

1.一种结合PCSK9的重组融合蛋白，其特征在于该融合蛋白氨基酸序列由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成。

2.一种制备融合蛋白的方法，其特征在于将权利要求1所述的融合蛋白编码DNA***表达载体，并将此载体引入合适的表达***，并进行融合蛋白的表达。

3.一种药物组合物，其特征在于由权利要求1所述融合蛋白与药学上可接受的载体或赋形剂组成。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物的制剂形式为注射剂、注射用冻干粉针。

5.权利要求1所述的融合蛋白在用于制备预防和治疗由PCSK9诱发的代谢性疾病药物方面的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于由PCSK9诱发的代谢性疾病为高胆固醇血症。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于高胆固醇血症为家族性高胆固醇血症。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于融合蛋白与他汀类药物联合应用。