CN104558094B

CN104558094B - 皂苷苷元衍生物、其制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN104558094B
Application number: CN201510059450.2A
Authority: CN
Inventors: 杨永安; 朱海亮; 严晓强; 俞海荣; 钟飞
Original assignee: JIANGSU NAIQUE BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JIANGSU NAIQUE BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2015-02-04
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2035-02-04
Also published as: CN104558094A

Abstract

本发明公开了一种结构如式IX所示的皂苷苷元衍生物、其制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，R₁选自H、CH₃，R₂选自H、CH₃，n为1，2。本发明具有更好的生物活性、更高的选择性以及更低的毒性等优点，对人乳腺癌细胞、***细胞、肺癌细胞和肝癌细胞有明显的抑制作用。

Description

皂苷苷元衍生物、其制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于药物化学领域，尤其是一种皂苷苷元衍生物、其制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

从中药通关藤中经过提取分离纯化得到的甾体皂苷类成分，其苷元是由21个C原子构成的独特甾体皂苷结构，因此称为C₂₁甾体皂苷。现有研究表明，具有C₂₁甾体皂苷母核的化合物具有免疫调节、平喘等药理活性，在临床上已经作为药物的指标性活性成分在临床上已经得到了较广泛的应用。

发明人经研究发现：具有C₂₁甾体皂苷母核的化合物具有良好的抗肿瘤的活性，对多种肿瘤具有较好的抑制作用，如对肝癌、肺癌、食道癌等均具有较好的抑制活性。目前对此类C₂₁甾体皂苷的研究还不深入，主要是根据其理化性质对其进行分离纯化和分析检测研究、针对其母核进行结构修饰研究、以及针对其结构特征进行药理活性研究。

如何使其具有更好的生物活性、更高的选择性、更低的毒性是当前的重要研究内容。

发明内容

发明目的：一个目的是提供一种抗肿瘤化合物，以至少解决现有技术存在的部分问题。进一步的目的是提供一种抗肿瘤化合物的制备方法。更进一步的目的是提供一种抗肿瘤化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

技术方案：一种结构如式IX所示的皂苷苷元衍生物，

其中，R₁选自H、CH₃，R₂选自H、CH₃，n为1，2。

一种结构如式IX所示的皂苷苷元衍生物的制备方法，

其中，R₁选自H、CH₃，R₂选自H、CH₃，n为1，2；

包括如下步骤：

步骤1、制备对肼基苯甲酸甲酯，并通过结构如式I所示的化合物制备结构如式II所示的化合物；

步骤2、在室温(本文中，室温指15℃～25℃)搅拌下，向反应器中加入结构式如III所示的化合物，盐酸水溶液和无水乙醇，反应后得到结构如式IV所示的化合物；

步骤3、在冰水浴搅拌作用下，向反应器中加入重氮甲烷***混合液、三氟化硼-***络合物、结构如式IV所示的化合物，反应后得到结构如式V所示的化合物；

步骤4、在室温搅拌下，向反应器中结构如式V所示的化合物、KOH水溶液、结构如式II所示的化合物和乙醇，反应后得到结构如式VI所示的化合物；

步骤5、将结构如式VI所示的化合物、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯和冰醋酸加入到反应器中，反应后获得结构如式VII所示的化合物；

步骤6、将等摩尔的盐酸羟胺、甲醇钠加入无水甲醇中，加热搅拌20～40min后，过滤掉固体，得到活化的羟胺溶液，向活化的羟胺溶液中加入结构如式VII所示的化合物，得到结构如式VIII所示的化合物；

步骤7、在-20±5℃搅拌下，向反应器中加入结构如式VII所示的化合物和二氯甲烷，并滴加三溴化硼，得到目标产物，结构式为IX所示的化合物；

式I、II、VI～VIII中，R₁选自H、CH₃，R₂选自H、CH₃，n为1，2。

在优选的实施例中，所述步骤1和步骤2进一步为：

在0±5℃下，依次向反应器中加入无水甲醇、氯化亚砜和对肼基苯甲酸，搅拌30～40min后，在常温下继续搅拌3-5h，过滤，得到的固体依次用蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤并干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇，重结晶提纯，获得对肼基苯甲酸甲酯；

将结构如式I所示的化合物溶于无水DMF中，然后依次加入1,2-二溴乙烷或二溴甲烷、以及无水碳酸钾，80±10℃加热反应30±5min；然后将反应混合物加到冰水中，过滤，固体用蒸馏水洗涤，柱层析，得到结构如式II所示的化合物；

在室温搅拌下，依次向反应器中加入结构如式III所示的化合物、盐酸水溶液、无水乙醇，搅拌2～3h后，回流反应7-9h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，得到的固体依次用盐酸水溶液、蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤并干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到结构如式IV所示的化合物。

更优选的，上述步骤为，将结构如式III所示的化合物10mmol溶于无水乙醇50ml.滴加1mol/L的盐酸5ml。

在优选的实施例中，所述步骤3进一步为：

在冰水浴搅拌作用下，依次向反应器中加入重氮甲烷***混合液、三氟化硼-***络合物、结构如式IV所示的化合物，反应20～40min后，再回流反应5～7h，TLC跟踪反应，反应结束后过滤，得到固体依次用盐酸水溶液、蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到结构如式V所示的化合物。

更优选的：上述步骤中各反应物摩尔比：IV：重氮甲烷：三溴化硼＝1:1.2～1.5:1.5～2.0。进一步优选的，比例为1:1.3:1.5、1:1.5:2。

在优选的实施例中，所述步骤4进一步为：在室温搅拌下，依次向反应器中加入结构如式V所示的化合物、KOH水溶液、结构如式II所示的化合物和乙醇，继续搅拌反应3～6h后，用盐酸酸化调节pH，过滤，得到的固体依次用蒸馏水、冷乙醇和蒸馏水洗涤，干燥后得到结构如式VI所示的化合物。

更优选的：上述步骤中各反应物摩尔比：V：II：三溴化硼＝1:1:1～1.5。进一步优选的，比例为1:1:1、1:1:1.4。

在优选的实施例中，所述步骤5进一步为：依次将结构如式VI所示的化合物、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯和冰醋酸加入到反应器中，室温搅拌反应20～40min后，仍有部分固体不溶；回流反应5～8h，TLC跟踪反应，反应结束后过滤，固体依次用盐酸水溶液、蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体产物溶于无水乙醇，重结晶提纯得到结构如式VII的化合物。

更优选的，上述步骤中各反应物摩尔比为：结构如式VI所示的化合物:对肼基苯磺酰胺:乙酸＝1：1.2～1.5：0.5。进一步优选的，比例为1:1.5:0.5、1:1.2:0.5。

在优选的实施例中，所述步骤6进一步为：将等摩尔的盐酸羟胺、甲醇钠加入无水甲醇中，加热搅拌20～40min后，过滤掉固体，得到活化的羟胺溶液，向其中加入对应的结构如式VII的化合物，回流反应3-5h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状的结构如式VIII的化合物。

更优选的，各反应物摩尔比：VII：盐酸羟胺：甲醇钠＝1:4～5:4～5。在优选的实施例中，所述步骤7进一步为：在-20±5℃搅拌下，依次向反应器中加入结构如式VIII的化合物、二氯甲烷，并滴加三溴化硼，搅拌20～40min，室温继续反应8～12h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状的目标化合物。

更优选的：上述步骤中各反应物摩尔比：VIII：三溴化硼＝1:0.5。

本专利针对皂苷苷元进行改造，有效整合了氧肟酸骨架，苯并二噁烷骨架，二氢吡唑骨架，实验可重复性强，稳定性好，实验反应所需条件较简单，且实验环境温和，产率较好，可在较小投入情况下进行大量生产。

一种结构如式IX所示的皂苷苷元衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，

其中，R₁选自H、CH₃，R₂选自H、CH₃，n为1，2。

一种抗肿瘤药物，包括结构如式IX所示的皂苷苷元衍生物以及医学上可接受的辅料。

有益效果：本发明具有更好的生物活性、更高的选择性以及更低的毒性等优点。对人乳腺癌细胞(MCF-7)、***细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)和肝癌细胞(HepG2)有明显的抑制作用，同时对人肾上皮细胞(293T)表现出了相当或者优于阳性对照药物Celecoxib的细胞毒性。

具体实施方式

结合一个具体实施案例描述本发明。各反应物、中间产物和目标化合物，以及反应过程如下所示。

本发明的含苯并二噁烷骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的合成方法，某个优选实施例主要由下列步骤组成：

步骤1.在0±5℃下，依次向圆底烧瓶中加入无水甲醇、氯化亚砜和对肼基苯甲酸1，搅拌1h左右后，常温继续搅拌3-5h，过滤，得到的固体依次用蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到酯化物对肼基苯甲酸甲酯2。

步骤2.将含有不同取代基的3,4-二羟基苯甲醛3-5溶于无水DMF中，然后依次加入1,2-二溴乙烷或二溴甲烷、无水碳酸钾，70℃加热反应30min左右。然后将反应混合物加到冰水中，过滤，固体用蒸馏水(3×200mL)洗涤，柱层析(洗脱液为V_乙酸乙酯：V_石油醚＝1：8)，得化合物6-11。

步骤3.在室温搅拌下，依次向圆底烧瓶中加入TenacissosideA(一种C₂₁甾体皂苷)12、稀盐酸、无水乙醇，搅拌1h后，回流反应7-9h。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_PE＝1:2)，反应结束后，过滤，得到的固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到部分还原化的晶体状C₂₁甾体皂苷苷元13。

步骤4.在冰水浴搅拌作用下，依次向圆底烧瓶中加入重氮甲烷***混合液、三氟化硼-***络合物、C₂₁甾体皂苷苷元13，反应0.5h左右后，再回流反应5-7h。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_PE＝1:2)，反应结束后，过滤，得到固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到晶体状中间物14。

步骤5.在室温搅拌下，依次向圆底烧瓶中加入中间物14、KOH水溶液、对应的化合物6-11、乙醇，继续搅拌反应4h后，稀盐酸酸化调节pH，过滤，得到的固体依次用蒸馏水(3×100mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥得中间体15-20。

步骤6.依次将不同的化合物15-20、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯2、冰醋酸加入到圆底烧瓶中，室温搅拌反应1h后，仍有部分固体不溶；接着回流反应5h，TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_PE＝1:2)，反应结束后，过滤，固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到晶体状中间物21-26。

步骤7.将等摩尔的盐酸羟胺、甲醇钠加入无水甲醇中，加热搅拌0.5h后，过滤掉固体，得到活化的羟胺溶液，在向其中加入对应的晶体中间物21-26，回流反应3-5h。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_PE＝1:2)，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状目标化合物27-32。

步骤8.在-20±5℃搅拌下，依次向圆底烧瓶中加入对应的中间物27-32、二氯甲烷，并逐步滴加三溴化硼，搅拌1h左右后，室温继续反应12h左右。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_正己烷＝1:2)，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状目标化合物33-38。

实施例一：

4-(5-(1,3-苯并二噁烷)-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物33)的制备

在-20℃搅拌下，依次向50mL的圆底烧瓶中加入步骤7得到的相应中间物27(10.0mmol)、二氯甲烷(25mL)，并逐步滴加三溴化硼(5mmol)继续搅拌反应1h后，将反应烧瓶转移至室温，继续反应12h。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_正己烷＝1:2)，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇重结晶提纯得到晶体状目标化合物。

得白色晶体，产率54.5％。m.p.233～234℃；¹HNMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.43(s,1H,OH),8.01(d,J＝7.1Hz,2H,ArH),7.74(d,J＝7.7Hz,2H,ArH),7.69(s,1H,NH),5.90(d,J＝4.7Hz,1H,ArH),5.83～5.59(m,2H,ArH),5.50(s,1H,CH₂),5.40(dd,J₁＝11.8Hz,J₂＝11.4Hz,1H,CH₂),5.37(s,2H,OH),4.49(s,1H,OH),4.15(d,J＝10.3Hz,1H,CH),3.58～3.29(m,5H,CHandCH₂),2.24～2.15(m,2H,CH₂),2.01(t,J＝4.8Hz,1H,CH),1.83～1.11(m,16H,CHandCH₂),0.89(s,3H,CH₃),0.84(s,3H,CH₃).ESI-MS:648.8[M+H]⁺.Anal.CalcdforC₃₆H₄₅N₃O₈:C,H,N.

实施例二：

4-(5-(4-甲基-1,3-苯并二噁烷)-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物34)的制备

制备方法参考实施例一。得白色晶体，产率42.6％。m.p.222～224℃；¹HNMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.47(s,1H,OH),8.00(d,J＝7.5Hz,2H,ArH),7.76(d,J＝7.5Hz,2H,ArH),7.72(s,1H,NH),5.91(d,J＝4.7Hz,1H,ArH),5.78～5.62(m,2H,ArH),5.50(s,1H,CH₂),5.40(dd,J₁＝11.3Hz,J₂＝11.1Hz,1H,CH₂),5.39(s,2H,OH),4.48(s,1H,OH),4.16(d,J＝10.1Hz,1H,CH),3.53～3.29(m,5H,CHandCH₂),2.24～2.15(m,2H,CH₂),2.01(t,J＝4.5Hz,1H,CH),1.80～1.10(m,18H,CHandCH₂),0.88(s,3H,CH₃),0.84(s,3H,CH₃).ESI-MS:662.8[M+H]⁺.Anal.CalcdforC₃₇H₄₇N₃O₈:C,H,N.

实施例三：

4-(5-(7-甲基-1,3-苯并二噁烷)-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物35)的制备

制备方法参考实施例一。得白色晶体，产率45.4％。m.p.215～216℃；¹HNMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.52(s,1H,OH),7.95(d,J＝7.2Hz,2H,ArH),7.75(d,J＝6.8Hz,2H,ArH),7.45(s,1H,NH),5.97(d,J＝4.7Hz,1H,ArH),5.82～5.61(m,2H,ArH),5.40(s,1H,CH₂),5.36(dd,J₁＝11.8Hz,J₂＝11.4Hz,1H,CH₂),5.32(s,2H,OH),4.59(s,1H,OH),4.13(d,J＝10.3Hz,1H,CH),3.58～3.29(m,5H,CHandCH₂),2.28～2.15(m,2H,CH₂),2.01(t,J＝4.8Hz,1H,CH),1.87～1.16(m,18H,CHandCH₂),0.89(s,3H,CH₃),0.78(s,3H,CH₃).ESI-MS:662.8[M+H]⁺.Anal.CalcdforC₃₇H₄₇N₃O₈:C,H,N.

实施例四：

4-(5-(1,4-苯并二噁烷)-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物36)的制备。

制备方法参考实施例一。以含1,4-苯并二噁烷骨架的化合物代替含1,3-苯并二噁烷骨架的化合物，得白色晶体，产率47.5％。m.p.223～224℃；¹HNMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.52(s,1H,OH),8.07(d,J＝7.7Hz,2H,ArH),7.82(d,J＝7.8Hz,2H,ArH),7.65(s,1H,NH),5.92(d,J＝4.7Hz,1H,ArH),5.86～5.61(m,2H,ArH),5.55(s,1H,CH₂),5.44(dd,J₁＝8.8Hz,J₂＝9.7Hz,1H,CH₂),5.35(s,2H,OH),4.49(s,1H,OH),4.38(d,J＝9.2Hz,2H,CH),3.79～3.43(m,6H,CHandCH₂),2.29～2.15(m,2H,CH₂),2.01(t,J＝4.8Hz,1H,CH),1.91～1.24(m,16H,CHandCH₂),0.89(s,3H,CH₃),0.84(s,3H,CH₃).ESI-MS:662.8[M+H]⁺.Anal.CalcdforC₃₇H₄₇N₃O₈:C,H,N.

实施例五：

4-(5-(5-甲基-1,3-苯并二噁烷)-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物37)的制备。

制备方法参考实施例一。以含1,4-苯并二噁烷骨架的化合物代替含1,3-苯并二噁烷骨架的化合物，得白色晶体，产率56.3％。m.p.216～218℃；¹HNMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.54(s,1H,OH),8.03(d,J＝7.3Hz,2H,ArH),7.78(d,J＝6.8Hz,2H,ArH),7.72(s,1H,NH),5.90(d,J＝4.7Hz,1H,ArH),5.80～5.67(m,2H,ArH),5.50(s,1H,CH₂),5.40(dd,J₁＝11.6Hz,J₂＝10.9Hz,1H,CH₂),5.37(s,2H,OH),4.49(s,1H,OH),4.42(d,J＝9.2Hz,2H,CH),3.79～3.45(m,6H,CHandCH₂),2.34～2.15(m,2H,CH₂),2.01(t,J＝4.8Hz,1H,CH),1.83～1.11(m,18H,CHandCH₂),0.89(s,3H,CH₃),0.84(s,3H,CH₃).ESI-MS:676.8[M+H]⁺.Anal.CalcdforC₃₈H₄₉N₃O₈:C,H,N.

实施例六：

4-(5-(8-甲基-1,3-苯并二噁烷)-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物38)的制备

制备方法参考实施例一。以含1,4-苯并二噁烷骨架的化合物代替含1,3-苯并二噁烷骨架的化合物，得白色晶体，产率44.1％。m.p.228～229℃；¹HNMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.51(s,1H,OH),7.88(d,J＝7.2Hz,2H,ArH),7.67(d,J＝7.4Hz,2H,ArH),7.54(s,1H,NH),5.90(d,J＝4.7Hz,1H,ArH),5.76～5.59(m,2H,ArH),5.50(s,1H,CH₂),5.40(dd,J₁＝11.8Hz,J₂＝11.4Hz,1H,CH₂),5.35(s,2H,OH),4.44(s,1H,OH),4.42(d,J＝9.5Hz,2H,CH),3.76～3.38(m,6H,CHandCH₂),2.44～2.13(m,2H,CH₂),2.01(t,J＝4.9Hz,1H,CH),1.83～1.11(m,18H,CHandCH₂),0.88(s,3H,CH₃),0.86(s,3H,CH₃).ESI-MS:676.8[M+H]⁺.Anal.CalcdforC₃₈H₄₉N₃O₈:C,H,N.

实施例七：

含苯并二噁烷骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物体外抗肿瘤活性关于抗肿瘤细胞增殖的研究

采用MTT[3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定含苯并二噁烷骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物对人乳腺癌细胞(MCF-7)、***细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)及肝癌细胞(HepG2)的半数抑制浓度(IC₅₀)。

(1)培养液(/L)的配制：①悬浮细胞：DMEM培养粉一袋(10.4g)，新生牛血清100mL，青霉素溶液(2×10^-5U/mL)0.5mL，链霉素溶液(2×10^-5U/mL)0.5mL，加三蒸水溶解后，用5.6％的NaHCO₃溶液调pH值至7.2-7.4，最后定容至1000mL。过滤灭菌。②贴壁细胞：同上，再加入NaHCO₃2.00g，HEPES2.38g。

(2)D-Hanks缓冲液(每升)的配制：NaCl8.00g，KCl0.40g，Na₂HPO₄·12H₂O0.06g，KH₂PO₄0.06g，NaHCO₃0.35g。高压灭菌。

(3)胰蛋白酶液的配制：利用D-Hanks缓冲液配成浓度为0.5％胰蛋白酶液。过滤除菌。

(4)实验药液的配制：将测试样品用少量的三蒸水溶解配成储备液，即按实验最高浓度的10倍配制储备液。根据化合物溶解性不同，可用三蒸水直接溶解，或用少量DMSO助溶，再加三蒸水溶解。储备液保存于-20℃冰箱中备用。

(5)人乳腺癌细胞(MCF-7)、***细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)以及肝癌细胞(HepG2)的培养：为贴壁生长细胞，常规培养于DMEM培养液内(含10％小牛血清、100U/mL链霉素)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔3-4d传代一次。传代时将原瓶中培养液转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃去原培养液，加入等量新鲜培养液，吹打均匀，移取适量至新鲜培养瓶中，再补充新鲜培养液至原体积(培养液体积约为培养瓶容量的1/10)。

(6)细胞孵育：取对数生长期的肿瘤细胞，调细胞悬液浓度为1-1.5×10⁵个/mL。在96孔培养板中每孔加细胞悬液100μL，置37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。培养24h后，分别按设计加入药液。

(7)加药：将测试药液按照最终浓度的浓度梯度分别加入到各个孔中，每个浓度设6个平行孔。实验分为药物试验组(分别加入不同浓度的测试药)、对照组(只加培养液和细胞，不加测试药)和空白组(只加培养液，不加细胞和测试药)。将加药后的96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。阳性对照药物的活性按照测试样品的方法测定。

(8)存活细胞的测定：在培养了48h后的96孔板中，每孔加MTT40μL(用D-Hanks缓冲液配成4mg/mL)。在37℃放置4h后，移去上清液。每孔加150μLDMSO，振荡5min，使formazan结晶溶解。最后，利用自动酶标仪在570nm波长处检测各孔的光密度(OD值)。

半数抑制浓度(IC₅₀)定义为当50％的肿瘤细胞存活时的药物浓度。根据测定的光密度(OD值)，制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。

测得的IC₅₀见表1所示。

表1本发明所列含苯并二噁烷骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物对肿瘤细胞的抑制IC₅₀值(μmol/mL)

^a6次平行试验，实验结果取平均值，误差在5-10％之间

本发明的含苯并二噁烷骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物对人乳腺癌细胞(MCF-7)、***细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)以及肝癌细胞(HepG2)有明显的抑制作用，尤其是对MCF-7细胞和HepG2细胞较为显著，对比TenacissosideA的抑制活性有明显提高，对比阳性对照药则表现出了相当或者优于阳性对照药物的抑制活性。因此本发明的含苯并二噁烷骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物可以应用于制备抗肿瘤药物。

实施例八：

含苯并二噁烷骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物体外抗肿瘤活性关于细胞毒性的研究

本发明测试了新合成化合物33-38对人肾上皮细胞(293T)的细胞毒性，细胞毒性结果如表2，以Celecoxib作为阳性对照。每个化合物的毒性用抑制T细胞存活率到50％时的浓度(CC₅₀)来表示。

实验方法：

(1)培养人肾上皮细胞(293T)直至达到其对数生长期末细胞趋于融合，用细胞消化液消化分散细胞，用细胞培养液配制成1×104个/mL的细胞悬液。取96孔培养板，每孔中加入100μL的细胞悬液。轻轻水平转动培养板使细胞均匀地分散在皿孔的表面。

(2)置于含5％CO₂细胞培养箱中，在37±2℃温度下培养24h。弃去原培养液，每孔加入100μL的空白对照液，阴性对照液，阳性对照液，100％和50％浓度的试验样品浸提液。每组至少设8孔。注：浸提原液或以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。采用0.9％氯化钠注射液浸提时，在稀释浸提时使用浓缩的2倍培养基。

(3)置于含5％CO2培养箱中，在37±2℃温度下进行培养。培养48h。

(4)每个培养间期后，每孔加入MTT溶液20μL，置于含5％CO₂培养箱中，在37±2℃温度下培养5h。

(5)弃去孔内液体，每孔分别加入200μLDMSO，将培养板放置10min，水平摇晃使孔内溶液颜色均匀。

(6)用酶标仪测定吸光度，波长采用570nm。

测得的CC₅₀见表2所示。

表2本发明所列含苯并二噁烷骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物对293T细胞的抑制CC₅₀值(μmol/mL)

^a6次平行试验，实验结果取平均值，误差在5-10％之间

本发明的含苯并二噁烷骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物对对人肾上皮细胞(293T)表现出了相当或者优于阳性对照药物的细胞毒性，同TenacissosideA相比，细胞毒性也几乎持平。因此本发明的含苯并二噁烷骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物可以应用于制备抗肿瘤药物。

总之，发明人认为苯并二噁烷骨架中含有2个氧原子，易产生多种非共价键相互作用，如氢键与金属离子配位等，推定这两个氧原子对配体-受体的紧密结合起重要作用，这对提高药物的靶向性有着重要意义，具有较大的发展潜力。此外，它作为重要的活性中间体，广泛存在于自然界的药效基团，具有很好的抗癌活性。氧肟酸结构式为R-CO-NHOH，是一种有机螯合剂，能与Cu²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺离子等形成稳定的金属螯合物，具有显著的络合能力。

二氢吡唑是极为重要的含氮的五元杂环化合物，它具有很多优异的抗肿瘤活性。由于二氢吡唑多是手性的，可以导致环上的取代及分子的构象具有更大的多变性，因而，具有更好的生物活性潜质。本发明将具有优秀生物活性的苯并二噁烷骨架以及氧肟酸基团引入到二氢吡唑衍生物中，同时结合了具有很好活性的C₂₁甾体皂苷苷元骨架，设计合成了一系列含苯并二噁烷骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物，实验发现它具有更好的生物活性、更高的选择性、以及更低的毒性等。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，步骤1和步骤2的顺序可以调整。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种结构如式IX所示的皂苷苷元衍生物，

其中，R₁选自H、CH₃，R₂选自H、CH₃，n为1，2。

2.一种结构如式IX所示的皂苷苷元衍生物的制备方法，

其中，R₁选自H、CH₃，R₂选自H、CH₃，n为1，2；

其特征在于，包括如下步骤：

步骤2、在室温搅拌下，向反应器中加入结构如式III所示的化合物，盐酸水溶液和无水乙醇，反应后得到结构如式IV所示的化合物；

步骤3、在冰水浴搅拌作用下，向反应器中加入重氮甲烷***混合液、三氟化硼-***络合物以及结构如式IV所示的化合物，反应后得到结构如式V所示的化合物；

步骤7、在-20±5℃搅拌下，向反应器中加入结构如式VIII所示的化合物和二氯甲烷，并滴加三溴化硼，得到目标产物，结构如式IX所示的化合物；

3.如权利要求2所述的皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤1和步骤2进一步为：

在室温搅拌下，依次向反应器中加入结构如式III所示的化合物、盐酸水溶液、无水乙醇，搅拌2～3h后，将反应烧瓶转移到78～80℃的油浴锅中，回流反应7～9h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，得到的固体依次用盐酸水溶液、蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤并干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到结构如式IV所示的化合物。

4.如权利要求2所述的皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤3进一步为：

在冰水浴搅拌作用下，依次向反应器中加入重氮甲烷***混合液、三氟化硼-***络合物和结构如式IV所示的化合物，反应20～40min后，再回流反应5～7h，TLC跟踪反应，反应结束后过滤，得到固体依次用盐酸水溶液、蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到结构如式V所示的化合物。

5.如权利要求2所述的皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤4进一步为：

在室温搅拌下，依次向反应器中加入结构如式V所示的化合物、KOH水溶液、结构如式II所示的化合物和乙醇，继续搅拌反应3～6h后，用盐酸酸化调节pH，过滤，得到的固体依次用蒸馏水、冷乙醇和蒸馏水洗涤，干燥后得到结构如式VI所示的化合物。

6.如权利要求2所述的皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤5进一步为：

依次将结构如式VI所示的化合物、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯和冰醋酸加入到反应器中，室温搅拌反应20～40min，仍有部分固体不溶；回流反应5～8h，TLC跟踪反应，反应结束后过滤，固体依次用盐酸水溶液、蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体产物溶于无水乙醇，重结晶提纯得到结构如式VII所示的化合物。

7.如权利要求2所述的皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤6进一步为：

将等摩尔的盐酸羟胺、甲醇钠加入无水甲醇中，加热搅拌20～40min后，过滤掉固体，得到活化的羟胺溶液，向其中加入对应的结构如式VII的化合物，回流反应3-5h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状的结构如式VIII所示的化合物。

8.如权利要求2所述的皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤7进一步为：

在-20±5℃搅拌下，依次向反应器中加入结构如式VIII所示的化合物、二氯甲烷，并滴加三溴化硼，搅拌20～40min，室温继续反应8～12h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状的目标化合物。

9.一种结构如式IX所示的皂苷苷元衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，

其中，R₁选自H、CH₃，R₂选自H、CH₃，n为1，2。

10.一种抗肿瘤药物，包括权利要求1所述的皂苷苷元衍生物以及医学上可接受的辅料。