CN104557542B - 一种超临界色谱制备高纯度epa酯和dha酯单体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超临界色谱制备高纯度EPA酯和DHA酯单体的方法，包括：以超临界CO2作为流动相、反相填料作为固定相组成超临界色谱分离***，控制***压力和温度使得***内的CO2处于超临界状态；将混合多不饱和脂肪酸酯原料液注入色谱柱中进行分离；采用馏分切割装置，收集纯度大于95％的EPA酯和DHA酯馏分。通过本发明的制备方法，整个过程大大减少了有机溶剂的使用，采用富含苯环的反相色谱填料，单次上载量大，纯度高，收集到的EPA酯和DHA酯单体产品纯度在95％以上，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及化工分离技术领域，具体是涉及一种超临界色谱制备高纯度EPA酯和DHA酯单体的方法。
背景技术
EPA和DHA是深海鱼油中最主要的两种多不饱和脂肪酸，它们对人体健康有多种独特的生理功效，但其生理功能也存在一定差异。EPA和DHA都具有改善血液循环、软化血管、调整血脂、降低血压的作用，但DHA特有促进胎儿和儿童大脑发育、保护视力、调节免疫的作用。此外，EPA对儿童发育所必须的花生四烯酸的摄取有竞争作用，会给儿童视力及大脑的发育产生不利的影响，因而，在儿童营养品中应该避免添加EPA。由于分离难度大，目前市售的EPA和DHA往往是两者的混合物。若能将两者完全分离，再面对不同年龄段的人群调配不同的比例，可以更好地发挥各自的功能，提高产品的性能。
EPA和DHA以甘油酯的形式存在于鱼油中，一般先将其转化为甲酯或者乙酯的形式，然后加以纯化和利用。EPA酯和DHA酯的纯化工作有两方面的内容，包括多不饱和脂肪酸酯的富集和EPA酯、DHA酯单体的制备。工业上常用的多级分子蒸馏法、尿素包合法只能得到富含EPA酯和DHA酯的混合多不饱和脂肪酸酯。为得到高纯度的EPA酯和DHA酯单体，需要进一步分离混合多不饱和脂肪酸酯中的EPA酯和DHA酯，目前采用的方法有硝酸银涂敷硅胶层析法、银离子交换树脂层析法、高效液相色谱法和超临界流体色谱法。
CN101265185B公开了一种用硝酸银涂敷硅胶柱分离二十碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯的制备方法，分别得到99.02％的DHA甲酯和99.61％的DPA甲酯，收率大于90％，但是使用了昂贵的硝酸银，且易引入重金属污染。此外，大量使用丙酮和正己烷作为洗脱溶剂对环境污染大。
CN103962091A公开了一种银离子改性氨基硅胶柱分离EPA和DHA的方法。该法解决了硝酸银涂敷柱中银离子的稳定性差和在分离过程中重金属污染样品的问题，可实现EPA和DHA的基线分离，但是仅限于分析规模，上载量小。
CN102285880B公开了一种高效液相色谱法制备高纯度EPA乙酯和DHA乙酯的方法。该法采用C18或者C8作为固定相，醇水溶液作为流动相，分离后的纯化液用乙酸乙酯萃取，再减压浓缩后得到纯度大于99％的EPA乙酯和DHA乙酯单体。但该法同样需要使用大量的有机溶剂。
CN103787863A公开了一种高效液相色谱法提纯EPA的方法。该法以C18或者C8等反相填料作为固定相，填装在大直径的动态轴向压缩柱中，流动相采用甲醇水，收集到的目标组分浓缩处理后得到纯度大于98％的EPA。该法需要使用大量的有机溶剂。
CN1634852A公开了一种利用超临界流体色谱技术分离制备高纯度EPA乙酯和DHA乙酯的方法。该法使用反相C18为分离介质，流动相为超临界CO2，可得到纯度大于90％的EPA乙酯和DHA乙酯单体。但是，由于EPA酯和DHA酯与其他结构相近的多不饱和脂肪酸之间的选择性差，该法不能同时得到纯度大于95％的单体。
CN103787862A公开一种半制备超临界流体色谱法分离EPA和DHA的方法。该法使用反相C18为固定相，添加改性剂的超临界CO2作为流动相，可得到纯度大于99％的EPA和DHA单体。但是该方法需要将原料预先用甲醇溶解并需要一定比例的甲醇作为改性剂。
综上述所，这些方法使用大量有机溶剂或有害物质，存在有机溶剂、重金属残留的风险和易发生生产过程中燃爆的风险，开发完全无溶剂消耗的绿色工艺来大规模生产纯度大于95％的EPA酯和DHA酯单体的方法是十分有必要的。
发明内容
本发明针对现有制备高纯度EPA酯和DHA酯单体方法所存在的不足，提供一种无污染、上载量大、收率高、能同时制备纯度高于95％的EPA酯和DHA酯单体的超临界流体色谱方法。
二十碳五烯酸，化学名：全-顺-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸，简称EPA；二十二碳六烯酸,化学名：全-顺-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸，简称DHA。
一种超临界色谱制备高纯度EPA酯和DHA酯单体的方法，包括以下步骤：
(1)以超临界CO2作为流动相、反相填料作为固定相组成超临界色谱分离***，控制***压力和温度使得***内的CO2处于超临界状态；
(2)将混合多不饱和脂肪酸酯原料液注入色谱柱中进行分离；
(3)采用馏分切割装置，收集纯度大于95％的EPA酯和DHA酯馏分。
制备色谱技术的关键在于固定相的选择，此固定相必须能够识别EPA酯和DHA酯在链长和双键数上的微小差异。所述的固定相是一类富含苯环的反相填料，包括聚苯乙烯/二乙烯苯型反相树脂或者苯基硅烷键合硅胶。一方面，苯环上的大π键与多不饱和脂肪酸酯上的双键有π-π作用，这种作用力可识别EPA酯和DHA酯在双键数上的差异；另一方面，反相填料的疏水作用可识别多不饱和脂肪酸酯在碳数上的差异，因而，这两类固定相对EPA酯和DHA酯有良好的分离度，而且，对于其他不同碳数和双键的多不饱和脂肪酸酯的选择性也优于C18填料。
所述的聚苯乙烯/二乙烯苯型反相树脂是颗粒均匀粒径、孔径均一、具有高机械强度的苯乙烯和二乙烯苯的共聚白球。该白球通过悬浮聚合法合成，骨架中富含苯环，具体可按照CN102603929B、CN101445573B或CN101186661B描述的方法合成。
所述的苯基硅烷键合硅胶可按CN1250555C描述的方法合成，其表面富含苯环；或者，使用waters、Agilent、kromasil等公司生产的苯基硅烷键合硅胶中的一种。
所述的反相填料的粒径控制在5～70μm，进一步优选为10～30μm。若粒径太大，则柱效降低，不利于EPA酯和DHA酯的分离；若粒径太小，则柱压太高，不利于操作。所述的反相填料的孔径控制在5～50nm，进一步优选为10～30nm。若填料的孔径太小，则EPA酯和DHA酯不容易进入孔道内，可能堵塞孔道；若填料的孔径太大，则孔内扩散慢，传质阻力大。
所述的反相填料用湿法装柱法填装到色谱柱中，装柱溶剂为甲醇或乙醇，色谱柱的直径为10～50mm，长度100～500mm。若色谱柱过大，则填装困难，床层不均匀，导致管壁效应与涡流效益加剧；若色谱柱过小，则处理量少。超临界色谱技术往往选用CO2作为流动相，这是因为CO2的临界温度(31℃)接近室温，临界压力(7.4MPa)不太高，可使超临界色谱在相对温和的条件下操作。另外，CO2具有无毒，不燃烧，无化学腐蚀性等优点。所述的超临界CO2的温度为30～80℃，压力为10～30MPa。
所述的混合多不饱和脂肪酸酯原料为混合多不饱和脂肪酸甲酯或者混合多不饱和脂肪酸乙酯，其中EPA酯+DHA酯的总质量分数为60％～95％，进一步优选为65％～85％。若原料中EPA酯和DHA酯的总含量过低，则色谱分离的难度加大，不利于获得高纯度产品；若原料中EPA酯和DHA酯的总含量过高，则原料的制备难度加大，工艺的经济性降低。
微藻油或者鱼油的酯化物经过多级分子蒸馏法、尿素包合法或者萃取法脱除鱼油酯化物中的饱和脂肪酸和低不饱和脂肪酸即可制得混合多不饱和脂肪酸酯原料。多级分子蒸馏法具体可按照CN1072711C描述的方法操作。尿素包合法具体可按照CN1036008A描述的方法操作。萃取法具体可按照CN103396319A描述的方法操作。
所述的混合多不饱和脂肪酸酯原料液不用有机溶剂稀释而直接进样，从而避免有机溶剂的残留。
所述的混合多不饱和脂肪酸酯原料液通过带有定量环的六通阀注入色谱柱中，进样量为200～5000μL/次。
所述的色谱柱的出口安装了馏分切割装置，包括依次安装在色谱柱出口的高压紫外检测器、电磁阀和收集装置。
所述的高压紫外检测器，实时监控流出液的组成和浓度的变化，紫外波长为210nm。
所述的电磁阀安装在高压紫外检测器的出口，根据在线高压紫外检测器的信号控制电磁阀切换来切割色谱峰。
所述的收集装置为三套带有收集罐的旋风分离器，安装在电磁阀之后，分别收集含EPA酯、DHA酯和杂质的馏分。各馏分中的溶质与CO2在旋风分离器中减压后实现气液分离，溶质部分流入收集罐中。
EPA酯和DHA酯含量的测定按照中国药典中所描述的方法操作，气相色谱法的分析条件为：聚乙二醇为固定液的石英毛细管柱(30m×0.25mm，膜厚0.25μm)，FID检测器，进样口温度250℃，检测器温度270℃；载气为N2，流速4ml/min，分流比3：1；程序升温，初始柱温190℃，保持4分钟，以每分钟2℃的速率升温至230℃，保持15分钟；进样量1μL；内标为二十一烷酸甲酯。
所述的收集到的EPA酯和DHA酯产品取少量样品用乙醇溶解后，采用上述方法测定其纯度。
本发明回收率的计算方法如下：
回收率＝产品中EPA酯(或DHA酯)的质量÷原料中EPA酯(或DHA酯)的质量。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1.流动相为超临界CO2，无需加入极性溶剂作为改性剂，避免了有机溶剂的使用；
2.原料可以直接进样，不需要事先溶解在有机溶剂中，避免使用有机溶剂；
3.产品馏分在旋风分离器减压后即可轻易地实现气液分离，不需要先使用有机溶剂吸收溶质，然后热浓缩的过程，可避免溶剂的使用；
4.使用富含苯环的反相色谱填料，这类填料对EPA酯和DHA酯的分离度大，因而单次上载量大，纯度高，收集到的产品纯度在95％以上，适合工业化生产。
附图说明
图1为实施例1中的紫外检测器在线检测的色谱流出曲线。
图2为实施例1中EPA乙酯产品的气相色谱图。
图3为实施例1中DHA乙酯产品的气相色谱图。
具体实施方式
以下实例中所使用的反相树脂填料采用CN101445573B所述的悬浮聚合法制得，其步骤为：将75g苯乙烯、5g二乙烯苯、0.4g过氧化苯甲酰的混合液倒入100g去离子水和0.2g聚乙烯醇组成的水溶液中，然后在35℃下搅拌1小时，升温至80℃，保温1小时，加入1mL十二烷基硫酸钠水溶液，保温1小时后升温至95℃，保温1小时后熟化使液滴***成球，然后过滤、洗涤、烘干、过筛得到不同粒度的聚苯乙烯/二乙烯苯共聚白球。
实施例1
将聚苯乙烯/二乙烯苯型反相树脂填料(10μm，)置于甲醇中充分溶胀，然后用湿法装柱法填装到的20×250mm的色谱柱中。控制超临界色谱***的温度40℃、压力20MPa，超临界CO2的流速为3mL/min。上样4mL的混合多不饱和脂肪酸乙酯于色谱柱中，其中混合多不饱和脂肪酸乙酯原料中EPA乙酯+DHA乙酯的总质量分数为65％。根据紫外检测器在线检测的流出曲线分段收集高纯度的EPA乙酯和DHA乙酯部分。重复上样20次后，在收集罐中取少量的EPA乙酯和DHA乙酯产品，气相色谱分析得EPA乙酯纯度为99.6％，DHA乙酯的纯度为97.9％。用气相色谱定量分析后，计算得EPA酯的收率为73.1％，DHA酯的收率为77.4％。
紫外检测器在线检测的色谱流出曲线如图1所示，EPA乙酯产品、DHA乙酯产品的气相色谱图如图2、3所示。
实施例2
将聚苯乙烯/二乙烯苯型反相树脂填料(20μm，)置于甲醇中充分溶胀，然后用湿法装柱法填装到的10×250mm的色谱柱中。控制超临界色谱***的温度50℃、压力10MPa，超临界CO2的流速为2mL/min。上样2mL的混合多不饱和脂肪酸乙酯于色谱柱中，其中混合多不饱和脂肪酸乙酯原料中EPA乙酯+DHA乙酯的总质量分数为80％。根据紫外检测器在线检测的流出曲线分段收集高纯度的EPA乙酯和DHA乙酯部分。重复上样20次后，在收集罐中取少量的EPA乙酯和DHA乙酯产品，气相色谱分析得EPA乙酯纯度为99.5％，DHA乙酯的纯度为98.8％。用气相色谱定量分析后，计算得EPA酯的收率为74.3％，DHA酯的收率为78.5％。
实施例3
将Kromasil100-10-Phenyl型苯基硅胶填料(10μm，)置于甲醇中超声分散，然后用湿法装柱法填装到的10×150mm的色谱柱中。控制超临界色谱***的温度40℃、压力20MPa，超临界CO2的流速为2mL/min。上样2mL的混合多不饱和脂肪酸甲酯于色谱柱中，其中混合多不饱和脂肪酸甲酯原料中EPA甲酯+DHA甲酯的总质量分数为65％。根据紫外检测器在线检测的流出曲线分段收集高纯度的EPA甲酯和DHA甲酯部分。重复上样20次后，在收集罐中取少量的EPA甲酯和DHA甲酯产品，气相色谱分析得EPA甲酯纯度为99.6％，DHA甲酯的纯度为97.9％。用气相色谱定量分析后，计算得EPA甲酯的收率为83.5％，DHA甲酯的收率为87.1％。
实施例4
将Kromasil100-16-Phenyl苯基硅胶填料(16μm，)置于甲醇中超声分散，然后用湿法装柱法填装到的10×250mm的色谱柱中。控制超临界色谱***的温度50℃、压力10MPa，超临界CO2的流速为3mL/min。上样4mL的混合多不饱和脂肪酸甲酯于色谱柱中，其中混合多不饱和脂肪酸甲酯原料中EPA甲酯+DHA甲酯的总质量分数为80％。根据紫外检测器在线检测的流出曲线分段收集高纯度的EPA甲酯和DHA甲酯部分。重复上样20次后，在收集罐中取少量的EPA甲酯和DHA甲酯产品，气相色谱分析得EPA甲酯纯度为99.4％，DHA甲酯的纯度为98.3％。用气相色谱定量分析后，计算得EPA甲酯的收率为80.2％，DHA甲酯的收率为79.6％。
Claims (8)
1.一种超临界色谱制备高纯度EPA酯和DHA酯单体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以超临界CO2作为流动相、反相填料作为固定相组成超临界色谱分离***，控制***压力和温度使得***内的CO2处于超临界状态；所述反相填料为聚苯乙烯/二乙烯苯型反相树脂或者苯基硅烷键合硅胶；
(2)将混合多不饱和脂肪酸酯原料液注入色谱柱中进行分离；
(3)采用馏分切割装置，收集纯度大于95％的EPA酯和DHA酯馏分。
2.根据权利要求1所述的高纯度EPA酯和DHA酯单体的制备方法，其特征在于，所述作为流动相的超临界CO2的温度为30～80℃。
3.根据权利要求1所述的超临界色谱制备高纯度EPA酯和DHA酯单体的方法，其特征在于，所述作为流动相的超临界CO2的压力为10～30MPa。
4.根据权利要求1所述的超临界色谱制备高纯度EPA酯和DHA酯单体的方法，其特征在于，所述反相填料的粒度为5～70μm，孔径5～50nm。
5.根据权利要求1所述的超临界色谱制备高纯度EPA酯和DHA酯单体的方法，其特征在于，所述色谱柱直径为10～50mm，长度100～500mm。
6.根据权利要求1所述的超临界色谱制备高纯度EPA酯和DHA酯单体的方法，其特征在于，所述混合多不饱和脂肪酸酯为混合多不饱和脂肪酸甲酯或混合多不饱和脂肪酸乙酯，其中EPA酯和DHA酯的总质量分数为60％～95％。
7.根据权利要求1所述的超临界色谱制备高纯度EPA酯和DHA酯单体的方法，其特征在于，所述混合多不饱和脂肪酸酯原料液的进样量为200～5000μL。
8.根据权利要求1所述的超临界色谱制备高纯度EPA酯和DHA酯单体的方法，其特征在于，所述的馏分切割装置包括依次安装于色谱柱出口的高压紫外检测器、电磁阀和收集装置。
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