CN104546866A - 常春藤皂苷元在制备抗食管鳞癌细胞Eca-109肿瘤药物中的应用 - Google Patents
常春藤皂苷元在制备抗食管鳞癌细胞Eca-109肿瘤药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了常春藤皂苷元在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明所述的常春藤皂苷元从天然药材续断中提取得到,续断是常用的中药材,有长期的中医用药经验,该药使用安全性高,无明显毒性作用记载。研究表明,常春藤皂苷元具有确切的抗肿瘤活性,效果显著,较西药抗肿瘤相对安全,副作用小,具有开发成抗肿瘤药物的前景。
Description
本申请是申请日为2013年09月28日,申请号为2013104529876,发明名称为常春藤皂苷元在制备抗肿瘤药物中的应用的分案申请。
技术领域:
本发明属于中药领域,具体涉及常春藤皂苷元在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术背景:
肿瘤是人类健康最大的杀手一。研究抗肿瘤药物在世界范围内已经成为热点。合成药物在抗肿瘤的同时,对人体产生巨大的伤害。从天然药物中研究和发现有效而低毒的化合物,具有重要意义。
常春藤皂苷元(Hederagenin),别名(3beta,4alpha)-3,23-Dihydroxyolean-12-en-28-oicacid;常春藤皂甙元,分子式C30H48O4,结构式为:
发明内容:
本发明的目的在于提供常春藤皂苷元在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
常春藤皂苷元在制备抗肿瘤药物中的应用。
上述的应用,其在于所述的常春藤皂苷元具有在体抗肿瘤活性,所述的在体抗肿瘤活性为:抗乳腺癌MCF-7肿瘤、抗肺癌A549肿瘤、抗肝癌Hep3B肿瘤、抗胃癌MGC-803肿瘤、抗结肠癌LoVo肿瘤、抗卵巢癌HO-8910PM肿瘤、抗子宫内膜癌细胞HEC-1肿瘤、抗白血病K562肿瘤、抗食管鳞癌细胞Eca-109肿瘤。
上述的应用,其在于所述常春藤皂苷元的纯度为50%~99%。
上述的应用,其在于所述的抗肿瘤药物包括常春藤皂苷元和药学上可接受的载体或者常规食用辅料。
上述抗肿瘤药物的剂型为药学上可接受的任意一种剂型。
本发明所述的常春藤皂苷元从天然药材续断中提取得到,续断是常用的中药材,以续断为原料制备不同纯度常春藤皂苷元的方法为本领域技术人员所公知的。
本发明所述的室温为本领域技术人员所公知的25±5℃。
本发明的有益效果:
本发明所述的常春藤皂苷元从天然药材续断中提取得到,续断是常用的中药材,有长期的中医用药经验,该药使用安全性高,无毒性作用记载。
研究表明,常春藤皂苷元具有确切的抗肿瘤活性,效果显著,较西药抗肿瘤相对安全,副作用小,具有开发成抗肿瘤药物的前景。
具体实施方式:
实施例1:试验药物常春藤皂苷元的制备:
常春藤皂苷元(自制;纯度为50%、99%;制备方法:取续断药材,适当粉碎,用90%的乙醇提取3次,滤过,合并3次滤液,减压回收乙醇至无醇味,用50%的乙醇定容至1g药材/30mL,加入溶液体积分数7%~10%的盐酸(市售,分析纯,质量分数为37%),水浴回流3小时,水解温度(水浴温度)为80℃,水解液减压回收乙醇至无醇味,在室温条件下放置24~36小时,沉淀,滤过,得沉淀物,65℃以下减压干燥,即得纯度为50%常春藤皂苷元沉淀物,经少量多次水洗,经少量5%的乙醇洗,65℃以下减压干燥,即得纯度为99%常春藤皂苷元)。
实施例2:
常春藤皂苷元抗裸鼠乳腺癌MCF-7肿瘤、抗裸鼠肺癌A549肿瘤、抗裸鼠肝癌Hep3B肿瘤、抗裸鼠胃癌MGC-803肿瘤、抗裸鼠结肠癌LoVo肿瘤、抗裸鼠卵巢癌HO-8910PM肿瘤、抗裸鼠子宫内膜癌细胞HEC-1肿瘤、抗裸鼠白血病K562肿瘤、抗裸鼠食管鳞癌细胞Eca-109肿瘤实验:
1.乳腺癌MCF-7裸鼠在体抗肿瘤实验
1.1实验方法:
取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞株,在无菌条件下后制备成1×108/ml细胞悬液,以0.1ml接种于BALB/c裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径,待肿瘤生长至100~300mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法,动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每4天测1次。给药体积为0.4ml/20g。每天给药一次,共给药28天。阴性对照组灌服给予等体积的生理盐水,他莫西芬剂量为4mg/kg、99%常春藤皂苷元的高剂量为405mg/kg、99%常春藤皂苷元的中剂量为135mg/kg、99%常春藤皂苷元的低剂量为45mg/kg、50%常春藤皂苷元为270mg/kg。29天后,处死小鼠,手术剥取瘤块称重。
1.2阳性药:
他莫昔芬(厂家:扬子江药业集团有限公司,批号:12070411,规格:10mg/片×60片)。配制方法:每次给药,取药物他莫西芬片10mg加入CMC-Na 50ml,配制成浓度为0.2mg/ml的液体,给药体积为0.4ml/20g,即剂量为4mg/kg。
Tweight:给药组平均瘤重;Cweight:阴性对照组平均瘤重。
1.3实验结果
表1.常春藤皂苷元对人乳腺癌MCF-7裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
组别 | 剂量(mg/kg) | 瘤重(g) | 抑瘤率(%) |
阴性对照组 | — | 0.60±0.14 | — |
他莫西芬 | 4 | 0.16±0.11** | 73.33% |
99%常春藤皂苷元高剂量组 | 405 | 0.21±0.05** | 65.00% |
99%常春藤皂苷元中剂量组 | 135 | 0.22±0.06** | 63.33% |
99%常春藤皂苷元低剂量组 | 45 | 0.23±0.05** | 61.67% |
50%常春藤皂苷元组 | 270 | 0.24±0.08** | 60.00% |
注:与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
2.肺癌A549裸鼠在体抗肿瘤实验
2.1实验方法:
SPF级BALB/c裸鼠60只,6周龄,体质量16~18g。取对数生长期A549细胞,用无菌PBS调整A549细胞浓度为3×107/mL,在BALB/c裸鼠背部皮下接种A549细胞0.1mL,待皮下移植瘤体积达75mm3左右时(约10d),按瘤体积和荷瘤鼠体重均衡原则分组。每日给药1次,给药28天,给药期间每4日用游标卡尺测量移植瘤最长径(L)和最短径(W)。末次给药48h后脱臼处死小鼠,切除移植瘤,称取瘤重。阴性对照组腹腔注射等体积生理盐水,顺铂(DDP)剂量为2mg/kg,99%常春藤皂苷元的高剂量为405mg/kg,99%常春藤皂苷元的中剂量为135mg/kg,99%常春藤皂苷元的低剂量为45mg/kg、50%常春藤皂苷元为270mg/kg。
2.2阳性药:
顺铂(DDP)(齐鲁制药有限公司,产品批号:509017IDB,规格:每支10mg)。剂量为2.0mg/kg,i.p。
表2.常春藤皂苷元对肺癌A549裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
组别 | 剂量(mg/kg) | 瘤重(g) | 抑瘤率(%) |
阴性对照组 | — | 0.69±0.10 | — |
顺铂 | 2 | 0.13±0.09** | 81.16% |
99%常春藤皂苷元高剂量组 | 405 | 0.21±0.07** | 69.56% |
99%常春藤皂苷元中剂量组 | 135 | 0.22±0.04** | 68.12% |
99%常春藤皂苷元低剂量组 | 45 | 0.23±0.06** | 66.67% |
50%常春藤皂苷元组 | 270 | 0.25±0.010** | 63.77% |
注:与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
3.肝癌Hep3B裸鼠在体抗肿瘤实验
3.1实验方法:
将对数生长期的Hep3B细胞株与生理盐水混合,制成单细胞悬液,按每只1×107个细胞注入裸鼠背部右后腿外侧皮下,共60只。4天后,出现可触摸的质硬肿块。待移植瘤生长至约0.3cm2,随机分为6组,每组10只。每日给药1次,共给药28天。给药期间每4日用游标卡尺测量移植瘤最长径(L)和最短径(W)。末次给药48h后脱臼处死小鼠,切除移植瘤,称取瘤重。阴性对照组腹腔注射等体积生理盐水,氟尿嘧啶注射液(5-FU注射液)剂量为20mg/kg,99%常春藤皂苷元的高剂量为405mg/kg,99%常春藤皂苷元的中剂量为135mg/kg,99%常春藤皂苷元的低剂量为45mg/kg、50%常春藤皂苷元为270mg/kg。
3.2阳性药:
氟尿嘧啶注射液(5-FU注射液)(天津市金耀氨基酸有限公司产品,批号1311171)。5-FU对照组剂量为20mg/kg,i.p。
表3.常春藤皂苷元对肝癌Hep3B裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
组别 | 剂量(mg/kg) | 瘤重(g) | 抑瘤率(%) |
阴性对照组 | — | 0.61±0.04 | — |
氟尿嘧啶 | 20 | 0.17±0.04** | 72.13% |
99%常春藤皂苷元高剂量组 | 405 | 0.21±0.05** | 65.57% |
99%常春藤皂苷元中剂量组 | 135 | 0.22±0.03** | 63.93% |
99%常春藤皂苷元低剂量组 | 45 | 0.23±0.06** | 62.30% |
50%常春藤皂苷元组 | 270 | 0.24±0.07** | 60.66% |
注:与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
4.胃癌MGC-803裸鼠在体抗肿瘤实验
4.1实验方法:
制备细胞悬液,镜下调整人低分化胃粘液腺癌MGC-803细胞株细胞浓度至300万,将细胞悬液0.3mL(约100万个细胞)注入裸鼠颈背皮下,无菌喂养4周,制备成瘤源裸鼠处死瘤源裸鼠,取出移植瘤剪碎成2mm3大小的瘤块,接种至各实验鼠无菌喂养1week制备成荷瘤裸鼠。阴性对照组腹腔注射等体积生理盐水,氟尿嘧啶注射液(5-FU注射液)剂量为20mg/kg,99%常春藤皂苷元的高剂量为405mg/kg,99%常春藤皂苷元的中剂量为135mg/kg,50%常春藤皂苷元的低剂量为45mg/kg,50%常春藤皂苷元为270mg/kg。每日给药1次,共给药28天。
4.2阳性药:
氟尿嘧啶注射液(5-FU注射液)(天津市金耀氨基酸有限公司产品,批号1311171)。
表4.常春藤皂苷元对胃癌MGC-803裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
组别 | 剂量(mg/kg) | 瘤重(g) | 抑瘤率(%) |
阴性对照组 | — | 0.58±0.08 | — |
氟尿嘧啶 | 50 | 0.15±0.06** | 74.14% |
99%常春藤皂苷元高剂量组 | 405 | 0.17±0.04** | 70.69% |
99%常春藤皂苷元中剂量组 | 135 | 0.18±0.05** | 68.97% |
99%常春藤皂苷元低剂量组 | 45 | 0.20±0.03** | 65.52% |
50%常春藤皂苷元组 | 270 | 0.22±0.10** | 62.07% |
注:与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
5.结肠癌LoVo裸鼠在体抗肿瘤实验
5.1试验方法
BALB/C裸鼠60只,购自中国医学科学院上海实验动物中心,鼠龄4~6周,体重20~25g,在SPF条件下裸鼠室内饲养。在无菌条件下,裸小鼠右前肢背部皮下注射LoVo细胞,注射局部出现明显皮丘,7d后所有被接种裸小鼠均出现结节,裸鼠移植瘤模型建立,然后被随机分为6组,每组10只。阴性对照组腹腔注射等体积生理盐水,氟尿嘧啶注射液(5-FU注射液)腹腔注射剂量为20mg/kg,99%常春藤皂苷元的高剂量为405mg/kg,99%常春藤皂苷元的中剂量为135mg/kg,99%常春藤皂苷元的低剂量为45mg/kg、50%常春藤皂苷元为270mg/kg。每日给药1次,连续28d。
5.2阳性药
5%5-FU注射液(天津市金耀氨基酸有限公司产品,批号1311171)。
表5.常春藤皂苷元对结肠癌LoVo裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
组别 | 剂量(mg/kg) | 瘤重(g) | 抑瘤率(%) |
阴性对照组 | — | 0.59±0.07 | — |
氟尿嘧啶 | 20 | 0.16±0.09** | 72.88% |
99%常春藤皂苷元高剂量组 | 405 | 0.18±0.03** | 69.49% |
99%常春藤皂苷元中剂量组 | 135 | 0.20±0.06** | 66.10% |
99%常春藤皂苷元低剂量组 | 45 | 0.22±0.05** | 62.71% |
50%常春藤皂苷元组 | 270 | 0.21±0.09** | 64.41% |
注:与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
6.卵巢癌HO-8910PM裸鼠在体抗肿瘤实验
6.1实验方法:
选择4~6周龄雌性BALB/c裸鼠,将2×107个HO-8910PM细胞悬浮于0.2mL无血清RPMI-1640培养基中,注射到裸鼠背部靠近右侧后肢皮下建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型,术后裸鼠继续饲养于SPF实验室。接种2周后,待移植瘤体积长至100~150mm3,将荷瘤裸鼠随机分为6组,每组10只,阴性对照组灌胃给予双蒸水0.2mL/只,多西紫杉醇剂量为0.5mg/kg,99%常春藤皂苷元的高剂量为405mg/kg,99%常春藤皂苷元的中剂量为135mg/kg,99%常春藤皂苷元的低剂量为45mg/kg、50%常春藤皂苷元为270mg/kg。
每日给药1次,共给药28天。第8周处死裸鼠,取皮下移植瘤组织,测量肿瘤质量;抑瘤率=(1-给药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)×100%。
6.2阳性药:
多西紫杉醇组(0.5mg/kg)(恒瑞医药)。
表6.常春藤皂苷元对卵巢癌HO-8910PM裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
注:与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
7.子宫内膜癌细胞HEC-1裸鼠在体抗肿瘤实验
7.1实验方法:
在超净工作台上以75%乙醇消毒裸鼠双侧后背部皮肤,以1ml空针抽取已调整好浓度(1×108ml-1)的子宫内膜癌细胞悬液,每侧皮下接种0.2ml(含细胞数2×107个)。建模第10天评价建模是否成功。模型建立后将60只裸鼠随机分为6组,每组10只。分别于建模第11天给药,阴性对照组分别灌胃给予双蒸水0.2mL/只,顺铂剂量为3mg/kg、99%常春藤皂苷元的高剂量为405mg/kg、99%常春藤皂苷元的中剂量为135mg/kg、99%常春藤皂苷元的低剂量为45mg/kg、50%常春藤皂苷元为270mg/kg。每日给药1次,连续给药4周。
7.2阳性药及子宫内膜癌HEC-I细胞:
子宫内膜癌HEC-I细胞购自中国科学院细胞库,顺铂购自Sigma。
表7.常春藤皂苷元对子宫内膜癌细胞HEC-1裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
组别 | 剂量(mg/kg) | 瘤重(g) | 抑瘤率(%) |
阴性对照组 | — | 0.62±0.07 | — |
顺铂 | 3 | 0.15±0.06** | 75.81% |
99%常春藤皂苷元高剂量组 | 405 | 0.18±0.07** | 70.97% |
99%常春藤皂苷元中剂量组 | 135 | 0.22±0.03** | 64.52% |
99%常春藤皂苷元低剂量组 | 45 | 0.25±0.05** | 59.68% |
50%常春藤皂苷元组 | 270 | 0.24±0.11** | 61.29% |
注:与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
8.白血病K562裸鼠在体抗肿瘤实验
8.1实验方法:
在生物洁净工作台内取对数生长期的K562细胞株,用不含血清的RPMI1640培养基配制成1×1012个/L单细胞悬液。于60只裸鼠右侧腋窝处用无菌1ml注射器皮下接种0.1ml细胞悬液,并记为接种第1天。在接种第12天,大部分裸鼠可触摸到皮下肿瘤。筛选出肿瘤体积约100mm3的60只荷瘤裸鼠,按随机化原则分为阴性对照组(灭菌二蒸水,10ml/kg)、阳性对照组、99%常春藤皂苷元高、中、低剂量组和50%常春藤皂苷元组,共6组,每组10只。于分组后第2天开始给药。CTX组经腹腔注射给予浓度为2.5mg/ml的无菌CTX生理盐水溶液,每2天1次;阴性对照组、99%常春藤皂苷元各剂量组、50%常春藤皂苷元组均灌胃给药,每天1次,共28d。各组均按每只裸鼠10ml/kg给药。环磷酰胺(CTX)剂量为25mg/kg、99%常春藤皂苷元的高剂量为405mg/kg、99%常春藤皂苷元的中剂量为135mg/kg、99%常春藤皂苷元的低剂量为45mg/kg、50%常春藤皂苷元为270mg/kg。
8.2阳性药:
注射用环磷酰胺(CTX,批号10052341,江苏恒瑞医药股份有限公司)。
表8.常春藤皂苷元对白血病K562裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
组别 | 剂量(mg/kg) | 瘤重(g) | 抑瘤率(%) |
阴性对照组 | — | 0.64±0.10 | — |
环磷酰胺 | 25 | 0.15±0.08** | 76.56% |
99%常春藤皂苷元高剂量组 | 405 | 0.18±0.09** | 71.88% |
99%常春藤皂苷元中剂量组 | 135 | 0.20±0.07** | 68.75% |
99%常春藤皂苷元低剂量组 | 45 | 0.24±0.08** | 62.50% |
50%常春藤皂苷元组 | 270 | 0.23±0.11** | 64.06% |
注:与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
9.食管鳞癌细胞Eca-109裸鼠在体抗肿瘤实验
9.1实验方法:
每只鼠背部皮下注射约0.2mL无菌食管鳞癌细胞Eca-109细胞悬液(含6.0×106~8.0×106细胞),接种后每两天用游标卡尺测量瘤体最长径a与最短径b,计算肿瘤体积V=1/2ab2,1周后待肿瘤体积长至约0.2cm3后随机分组,每组10只。阴性对照组腹腔注射等体积生理盐水,氟尿嘧啶注射液(5-FU注射液)腹腔注射剂量为10mg/kg,99%常春藤皂苷元的高剂量为405mg/kg,99%常春藤皂苷元的中剂量为135mg/kg,99%常春藤皂苷元的低剂量为45mg/kg、50%常春藤皂苷元为270mg/kg。均为每日给药1次,连续28d。
9.2阳性药:
5-Fu(10mL/0.25g)(天津市金耀氨基酸有限公司产品,批号1311171),5-Fu按10mg/kg腹腔注射。
表9.常春藤皂苷元对食管鳞癌细胞Eca-109裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
组别 | 剂量(mg/kg) | 瘤重(g) | 抑瘤率(%) |
阴性对照组 | — | 0.63±0.12 | — |
氟尿嘧啶 | 10 | 0.17±0.07** | 73.02% |
99%常春藤皂苷元高剂量组 | 405 | 0.19±0.05** | 69.84% |
99%常春藤皂苷元中剂量组 | 135 | 0.21±0.06** | 66.67% |
99%常春藤皂苷元低剂量组 | 45 | 0.24±0.04** | 61.90% |
50%常春藤皂苷元组 | 270 | 0.23±0.09** | 63.49% |
注:与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
结论:
常春藤皂苷元具有在体抗肿瘤活性。具体在体抗肿瘤活性为:抗裸鼠乳腺癌MCF-7肿瘤、抗裸鼠肺癌A549肿瘤、抗裸鼠肝癌Hep3B肿瘤、抗裸鼠胃癌MGC-803肿瘤、抗裸鼠结肠癌LoVo肿瘤、抗裸鼠卵巢癌HO-8910PM肿瘤、抗裸鼠子宫内膜癌细胞HEC-1肿瘤、抗裸鼠白血病K562肿瘤、抗裸鼠食管鳞癌细胞Eca-109肿瘤。
实施例3:纯度为99%常春藤皂苷元、纯度为50%常春藤皂苷元样品制剂
98%常春藤皂苷元胶囊的制备方法:取实施例1中99%常春藤皂苷元粉末,加入1%~15%淀粉或其它药学上可接受的载体或者常规食用辅料(或其它药学上可接受的载体或者常规食用辅料:药学上可接受的载体包括口服制剂辅料或胃肠外途径给药的辅料。给药途径可以是口服、注射、局部给药等。根据本发明的技术方案,该组合物可以是口服制剂或注射用制剂,其中口服制剂包括胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、口服液、片剂、滴丸等。所用辅料包括:淀粉、蔗糖、乳糖、糖粉、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、异丙醇、吐温-80、甘油、丙二醇、微晶纤维素钠、糊精、环糊精、氯化钠、维生素C、半胱氨酸、柠檬酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、硬脂酸盐和明胶等常规辅料,制剂的后期制备工艺及设备均属制药领域的常规技术,本发明对此不作限定,故在此不予详述),用90%乙醇(或其它浓度的乙醇、水)为润湿剂,制备软材,过20目筛制粒,60℃下干燥,20目筛整理,即得合格颗粒,装0号胶囊,为0.315g/粒重,其中0.015g/辅料粒,0.300g的99%常春藤皂苷元/粒。日服3次,每次1-3粒。
50%常春藤皂苷元胶囊的制备方法:取实施例1中50%常春藤皂苷元粉末,加入1%~15%淀粉或其它药学上可接受的载体或者常规食用辅料,用90%乙醇(或其它浓度的乙醇、水)为润湿剂,制备软材,过20目筛制粒,60℃下干燥,20目筛整理,即得合格颗粒,装0号胶囊,为0.315g/粒重,其中0.015g/辅料粒,0.300g的50%常春藤皂苷元/粒。日服3次,每次2-4粒。
Claims (3)
1.常春藤皂苷元在制备抗食管鳞癌细胞Eca-109肿瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于所述常春藤皂苷元的纯度为50%~99%。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于所述的抗肿瘤药物包括常春藤皂苷元和药学上可接受的载体或者常规食用辅料。
Priority Applications (1)
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