CN104535516A - 一种总胆碱的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种总胆碱的测定方法，包括以下步骤：配制试验用缓冲溶液、标准溶液，用分光光度计测定氯化胆碱标准溶液的吸光系数，将样品经预处理后用分光光度计测定吸光系数，并计算出样品中胆碱的含量，其特征在于，样品的预处理包括以下步骤：取含有胆碱的饲料样品，粉碎，加入无水乙醇，溶解分散均匀，样品混合均匀后进行水解处理，搅拌使样品分散均匀，水浴加热至50-80℃，加热时长170-240分钟；而后振荡均匀，调节pH至弱酸性，并用的弱酸性缓冲液定容；涡旋振荡，离心，取上清液过滤，收集滤液用于测定。用于测定的滤液，加入10-20倍弱碱性缓冲液所配置的酶反应液，保证用于测试的滤液呈弱碱性，在37℃左右保温反应10-60分钟，得测试样品溶液并测定。

Description

一种总胆碱的测定方法

技术领域

本发明涉及一种总胆碱的测定方法，属于化学成分分析技术领域，特别适用饲料成分分析应用。

背景技术

胆碱(choline)，分子式为C₅H₁₄NO⁺X^-，胆碱是机体内许多生理功能所必需的营养物质，在构成细胞结构、维持脂质代谢、保证神经***的正常功能方面发挥重要作用，是动物饲料中需要添加的重要营养物质。胆碱在动植物界广泛存在，尤其是谷物、豆科类及菜粕类副产品，此外，鱼粉和肉骨粉也都是胆碱的丰富来源。饲料生产中要求客观、准确地评定胆碱含量，合理科学地制定饲料配方。

已报道的饲料中总胆碱的测定方法有以下几种：①基于雷氏盐和四苯硼钠络合反应的分光光度计法，该方法测定误差较大是因为四苯硼钠测定胆碱会受到钾、钠、胺离子干扰，雷氏盐会受到三甲胺等季胺盐的干扰；②气相色谱法，该方法需要将季胺胆碱降解成叔胺，添加内标，然后衍生测定，操作繁琐且重重复性差；③液相色谱法，样品中的胆碱利用示差折光检测器进行测定，该方法虽然灵敏，但对仪器和操作人员要求高、且费用高、难以普及；④离子色谱法，NY/T 1819-2009《饲料中胆碱的测定离子色谱法》，该方法未建立原料水解步骤，检测出原料胆碱含量测定结果非常低，通常低于200mg/kg，而这些与实际情况(即一般原料胆碱含量应在1000mg/kg以上)是极不相符。导致该问题的原因是饲料中胆碱多以复合磷脂的形成存在，游离形式胆碱很少，需要经过彻底水解释放出胆碱部分，总胆碱才能被准确定量。因此，NY/T 1819-2009不适用于原料总胆碱测定，且原料采用强酸或强碱水解释放出游离态胆碱成为定量的首个关键步骤。

同时，GB/T 5413.20-2013《婴幼儿配方食品和乳粉胆碱的测定》中，虽选用强酸水解，但未对原料水解液作净化处理，即存在以下问题：原料中富含核黄素等发色物质，原料经水解后颜色加深，造成原料背景值增高；且原料富含维生素C等还原性物质，会阻碍酶的氧化反应，造成胆碱测定值偏低。因此，原料水解液净化处理成为胆碱准确定量的第二个关键步骤。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术测试饲料中胆碱时，必须采用大型色谱设备，应用困难，且饲料中胆碱释放不完全，容易受到背景因素干扰，测试结果不准确的问题，提供一种检测饲料中总胆碱的方法。本发明的方法可以用于饲料原料、配合饲料、添加剂预混合饲料中总胆碱浓度的定量测定。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种总胆碱的测定方法，包括以下步骤：

(1)配制试验用缓冲溶液：配制弱酸性缓冲液，弱碱性缓冲液和酶反应液。所述弱酸性缓冲液是pH＝4-7的缓冲液，优选为pH＝4.0的缓冲液，特别是乙酸钠缓冲液。所述弱碱性缓冲液是pH＝7-8的缓冲液，优选为pH＝8.0的缓冲液，特别是Tris-盐酸缓冲液(也称Tris缓冲液)。所述酶反应液是混合酶反应液，混合酶反应液至少包含有胆碱氧化酶和磷脂酶D。优选的，磷脂酶D的浓度至少为0.7U/mL，优选为0.75-1.0U/mL。胆碱氧化酶至少为0.8U/mL，优选为1.0-1.2U/mL。胆碱氧化酶可以在弱酸至弱碱性的条件下发挥酶催化反应的作用，而磷脂酶D在弱碱性的条件下能够发挥出较好的活性，所以优选使用弱碱性的缓冲液配制酶反应液。

进一步，上述弱酸性缓冲液为乙酸钠缓冲液，pH＝4.0，摩尔浓度为0.2mol/L的。上述弱碱性缓冲液为Tris-盐酸缓冲液，三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为0.1mol/L，pH＝8.0。

进一步，所述混合酶反应液含有胆碱氧化酶、过氧化物酶、邻联茴香胺、曲拉通和磷脂酶D。这些混合酶的浓度分别为胆碱氧化酶1.0-1.2U/mL、过氧化物酶2.5-2.8U/mL、邻联茴香胺1mmol/L、曲拉通1％和磷脂酶D 0.75-1.0U/mL。更优选的，所述混合酶反应液：用Tris-盐酸缓冲液配制含有胆碱氧化酶、过氧化物酶、邻联茴香胺、曲拉通和磷脂酶D的混合酶反应液。磷脂酶D的反应活性是影响混合酶反应液的酶催化反应的关键步骤，优选保证其磷脂酶的活性，使用Tris-盐酸缓冲液配制的混合酶液整体活性最佳，使用效果最好。

(2)配制标准溶液：配制氯化胆碱标准溶液。

(3)用可见光分光光度计测定氯化胆碱标准溶液的吸光系数。

(4)将样品预处理，然后用分光光度计测定经过预处理的样品的吸光系数，并计算出样品中胆碱的含量。优选使用可见光分光光度计进行测试。本发明将胆碱的主要测试工作分配集中到相对条件要求较低的分光光度计上进行，可以降低检测过程的设备/环境要求，提高总胆碱测试方法的通用性。

步骤(4)中样品的预处理及测定，包括以下步骤：

(4a)取含有胆碱的饲料样品，粉碎，优选粉碎至粒度小于0.45mm，加入无水乙醇，溶解分散均匀，优选采用涡旋振荡至样品完全分散。优选的涡旋振荡处理，还可以采用搅拌促进溶解分散，特别是磁力搅拌，设备简单，操作方便，搅拌效果优良。

样品混合均匀后进行水解处理，优选为酸碱水解处理，使样品中的胆碱充分释放到溶液中。更优选的，如果样品主要为植物性原料则加入酸液，如果样品主要为动物性原料则加入碱液。所述酸液是酸性溶液，可以是有机酸溶液也可以是无机酸溶液，优选为无机酸溶液，特别是盐酸、硫酸、磷酸等。所述碱溶液是碱性溶液，可以是有机碱溶液也可以是无机碱溶液，优选为无机碱溶液，特别是氢氧化钠、氢氧化钾等配制的溶液。所述植物性原料是指样品的制备原料是从植物材料获得的，如豆粕、菜粕、棉粕、米糠、玉米、小麦等，所述动物性原料是指样品的制备原料是从动物材料获得的，如鱼粉、肉粉、羽毛粉、血球蛋白粉、血浆蛋白粉等。然后，搅拌使样品分散均匀，优选磁力搅拌，水浴加热至50-80℃，优选为65-72℃，加热时长170-240分钟为宜，优选为170-190分钟。而后振荡均匀，调节pH至弱酸性，优选调节pH＝4.0，并用步骤(1)中配制的弱酸性缓冲液定容。

(4b)涡旋振荡，离心，取上清液过滤，收集滤液用于测定。优选的初始滤液弃去不用。所述初始滤液又称最初滤液，开始进行过滤后，先被过滤下来到烧杯的滤液称为初滤液/最初滤液，因为此时的滤液是对过滤装置清洗的影响，容易含有杂质纯净度不佳，所以把初滤液倒掉之后继续采集到的滤液用于后续测定，纯净度较高，可有效减少误差。通常根据过滤的溶液量可以大致判断初始滤液为最初1-30秒内流出滤液为初始滤液，本领域技术人员可以根据实际测试经验进行相应调整，不影响本发明方法的实施。

(4c)用于测定的滤液，加入Tris缓冲液所配置的酶反应液，优选的加入酶反应液用量为10-20倍体积量，保证用于测试的滤液呈弱碱性，优选测试用滤液pH＝7-8。在37℃左右保温反应10-60分钟，保温在37℃左右是依据酶的反应活性调整的温度范围，一般来说可以是34-38℃之间，根据实际工作情况可以小幅调整，优选保温酶促反应25-40分钟，特别是30分钟。以样品空白为参比，在步骤(3)中相同的测试波长下，测试样品溶液的吸光值，并计算胆碱的含量。

本发明是基于酶联氧化法测定原料中总胆碱，本发明方法可以将饲料中结合态胆碱完全释放出来，成功地解决了背景干扰除杂的问题，具有易操作、可重复、特异性强、灵敏度高、准确性好的特点。与现有技术测定饲料中胆碱方法(NY/T 1819-2009和GB/T 5413.20-2013)相比存在以下不同：通过强酸或强碱完全分解饲料中结合态胆碱。饲料中胆碱多以复合磷脂的形成存在，经过彻底水解释放出游离胆碱部分，再经胆碱氧化酶特异性的氧化偶联反应，利用分光光度计测定游离胆碱含量，进而推算饲料中总胆碱含量。当待测样品为植物源性原料时，采用酸液水解，当待测样品动物源性样品时，采用碱液水解。对于不同来源的样品采取不再的水解方式，结合态胆碱释放完全，测定结果准确，弥补了NY/T 1819-2009方法仅用0.1mol/L盐酸水解，方式单一，不彻底的缺陷。

进一步，步骤(4b)还包括加入活性炭脱色处理。浓度不低于10mg/mL。在待测样品水解液中加入浓度为10-30mg/mL的活性炭，优选18-24mg/mL的活性炭，特别优选20mg/mL的活性炭。加入活性炭避免了水解液生色后空白吸光值增大，使得样品背景吸光值均落在0.05以内，明显降低了样品的测定误差，有效地消除背景干扰。同时，添加活性炭还避免了原料中维生素C等对氧化反应的干扰，提高了样品测定的准确性和重复性。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)本发明方法首先针对植物性原料和动物性原料分别采用强酸和强碱的水解方式，促使原料和饲料中结合态胆碱水解，释放出游离的胆碱。本发明可以用于植物性、动物性原料以及饲料中总胆碱浓度的定量测定。

(2)本发明方法在水解液中加入的活性炭，净化原料中核黄素、叶酸水解生成的颜色，使样品的背景吸光值在一个合理的范围内，避免原料空白过高引起的测定误差，同时，活性炭微粒末端强氧化性物质可以消除原料中强还原性维生素C等引起的干扰。

(3)本发明通过测定水提取液中游离胆碱含量，推算原料中总胆碱，专属性强，能排除其他物质对胆碱的干扰。

(4)本发明方法采用分光光度计对胆碱测定，线性范围在5μg-25μg，最小检出量0.5μg，原料中总胆碱回收率在97.8％-102.0％之间，RSD小于8.0％。

附图说明：

图1为本发明实施例1中根据胆碱标准液的浓度和吸光值绘制标准曲线。

图2为本发明实施例2中根据胆碱标准液的浓度和吸光值绘制标准曲线。

图3为实施例3中水解过程中选择不同的处理温度对于检测结果的影响。

图4为实施例4中水解过程中不同的处理时长对于检测结果的影响。

具体实施方式

通过大量的试验摸索，最终获得饲料中总胆碱的测定方法，其步骤如下：

(1)试剂和溶液的配制

(1.1)乙酸钠缓冲液，C(CH₃COOHNa)＝0.2mol/L，pH＝4.0：称取16.4g无水乙酸钠于1000mL烧杯中，加入900mL蒸馏水搅拌溶解，用冰乙酸调节溶液pH值至4.0，再将溶液转移至1000mL容量瓶中，定容，室温可存放1周。

(1.2)Tris-盐酸缓冲液，C((HOCH₂)₃CNH₂)＝0.1mol/L，pH＝8.0：称取12.1g三羟甲基氨基甲烷于1000mL烧杯中，加入900mL蒸馏水搅拌溶解，用浓度1moL/L的盐酸调节pH值至8.0，再将溶液转移至1000mL容量瓶中，定容，室温可以存放1周。

(1.3)混合酶反应液：称取4mg的胆碱氧化酶、5mg过氧化物酶于100mL容量瓶，加入50mL Tris缓冲液，振荡1min。再加入25mg邻联茴香胺、1mL曲拉通溶液和100uL磷脂酶D，用Tris-盐酸缓冲液稀释至100mL，混匀后盛于棕色瓶内，避光保存于冰箱，可以存放1周。

(2)绘制标准曲线：精确称取0.5769g在105℃烘至恒重的氯化胆碱于1L的容量瓶中，用蒸馏水溶解后定容，即得浓度为500mg/mL胆碱标准溶液储备液。分别吸取10、20、30、40、50mL的储备液于100mL的容量瓶，用蒸馏水稀释定容即得浓度为50、100、150、200、250μg/mL的胆碱标准工作液。分别吸取0.2mL各浓度胆碱标准工作液，37℃预热5min，加入3mL混合酶反应液，37℃保温30min，以空白为参比，在420nm波长下测定样品溶液的吸光值，以胆碱浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。所述根据一般测试需要，可以选定标准溶液的浓度范围为20-400μg/mL，在此浓度范围能能够实现大部分的胆碱含量测试情况，且测试结果准确可靠，特别优选50-250μg/mL。

(3)样品的处理

(3.1)样品的水解：将含有胆碱的饲料样品粉碎，全部通过0.45mm分样筛，充分混匀，取5.0000g饲料于100mL烧杯，先加入5mL无水乙醇，在涡旋仪上振荡至样品完全分散，植物性原料加入30mL浓度1mol/L酸液，动物性原料加入30mL浓度1mol/L碱液，在室温下磁力搅拌20min，使样品在溶液中分散均匀，将烧杯放入水浴振荡锅，100rpm/min的转速下，70℃，振荡180min。将烧杯中样品水解液转移至100mL容量瓶中，植物性原料加入1mol/L碱液，动物性原料加入1mol/L酸液，调节pH至4.0，用醋酸钠缓冲液定容，待净化。

(3.2)样品的净化：移取20mL样品水解液于50mL离心管内，加入0.4g活性炭，涡旋振荡后室温放置10min，10000rpm/min下离心10min，取上清液过滤，弃初始滤液5mL，收集滤液待测定。

(3.3)样品的反应：样品空白吸取0.2mL滤液于5mL离心管内，加入3mL的Tris-盐酸缓冲液；样品吸取0.2mL滤液于5mL离心管内，加入3mL酶混合反应液，离心管放入37℃水浴锅保温30min，以样品空白为参比，在420nm波长下测定样品溶液的吸光值，用样品实测值带入标准曲线计算样品中胆碱含量，

(4)计算结果与表示

胆碱含量 $(\mathrm{mg}/\mathrm{kg})=\frac{C\×100}{M}$

其中C：样品溶液实测吸光值在标准曲线中对应胆碱浓度μg/mL；

100：胆碱提取液的体积mL；

m：样品的质量g。

在本发明的测试方法中，当待测样品为植物源性原料时，采用1mol/L盐酸水解，当待测样品为动物源性样品时，采用1mol/L氢氧化钠水解。此方法对不同来源的样品采取不同水解方式，结合态胆碱释放完全，测试准确。

本发明所述饲料中总胆碱测定方法，采用通用型721分光光度计即可对胆碱进行测定，线性范围在5μg-25μg，最小检出量0.5μg，原料中总胆碱回收率在95.3％-103.3％之间，RSD小于8.0％，是一种易操作、可重复、特异性强、灵敏度高、准确性好的方法。

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。本发明中未特别说明的百分比均为重量百分比，本发明所述的wt％是指重量百分比。

实施例1植物源性原料豆粕中总胆碱的测定方法

本实施例的主要特点在于对植物源性原料制备的饲料样品，采用酸液处理，进而实现饲料样品中胆碱的快速准确分析试验。

具体的试验方法步骤如下：

1、试剂与溶液

除特殊说明外，所有的试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T 6682中规定的二级水规定。

1.1酸水解液：吸取86.2mL浓盐酸于1000mL容量瓶中，加入蒸馏水定容至1L，浓度为1mol/L，室温下存放1个月有效。

1.2乙酸钠缓冲液，C(CH₃COOHNa)＝0.2mol/L，pH＝4.0：称取16.4g无水乙酸钠于1000mL烧杯中，加入900mL蒸馏水搅拌溶解，用冰乙酸调节溶液pH值至4.0，再将溶液转移至1000mL容量瓶中，定容，室温可存放1周。

1.3Tris-盐酸缓冲液，C((HOCH₂)₃CNH₂)＝0.1mol/L，pH＝8.0：称取12.1g三羟甲基氨基甲烷于1000mL烧杯中，加入900mL蒸馏水搅拌溶解，用浓度1mol/L的盐酸调节pH值至8.0，再将溶液转移至1000mL容量瓶中，定容，室温可以存放1周。

1.4混合酶反应液：称取4mg的胆碱氧化酶、5mg过氧化物酶于100mL容量瓶，加入50mL Tris-盐酸缓冲液，振荡1min。再加入25mg邻联茴香胺、1mL曲拉通溶液和100uL磷脂酶D，用Tris-盐酸缓冲液稀释至100mL，混匀后盛于棕色瓶内，避光保存于冰箱，可以存放1周。

1.5胆碱储备液：精确称取0.5769g在105℃烘至恒重的氯化胆碱于1L的容量瓶中，用蒸馏水溶解后定容，即得浓度为500mg/mL胆碱标准溶液储备液。

1.6胆碱工作液：分别吸取10、20、30、40、50mL的储备液于100mL的容量瓶，用蒸馏水稀释定容即得浓度为50、100、150、200、250μg/mL的胆碱标准工作液。

2、仪器设备

2.1可见分光光度计：721型

2.2天平：感量万分之一

2.3恒温水浴振荡器：转速100rpm/min

2.4涡旋振荡仪

2.5酸度计：pH精确至0.01

3、标准曲线绘制

分别吸取0.2mL浓度50、100、150、200、250μg/mL的胆碱标准工作液，37℃预热5min，加入3mL混合酶反应液，37℃保温30min，以空白为参比，在420nm波长下测定样品溶液的吸光值，以胆碱浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，线性方程为Y＝0.0025X-0.0018，相关系数r＝0.9995(n＝5)。

4、样品的处理

将豆粕样品粉碎，全部通过0.45mm粉样筛，充分混匀，取5.0000g豆粕于100mL烧杯，加入5mL无水乙醇，在涡旋仪上振荡至样品完全分散，再加入30mL浓度1mol/L盐酸，室温下磁力搅拌20min，将烧杯放入水浴振荡锅，100rpm/min的转速下，70℃，振荡180min。然后，将烧杯中样品水解液转移至100mL容量瓶中，加入30mL浓度1mol/L氢氧化钠，用醋酸钠缓冲液定容。取20mL豆粕水解液于50mL离心管内，加入0.4g活性炭，涡旋振荡后室温放置10min，10000rpm/min转速离心10min，取上清液过滤，弃初始滤液5mL，收集滤液待测定。

5、测定步骤

样品空白吸取0.2mL滤液于5mL离心管内，加入3mL的Tris-盐酸缓冲液；样品吸取0.2mL滤液于5mL离心管内，加入3mL酶混合反应液，离心管放入37℃水浴锅保温30min，以样品空白为参比，在420nm波长下测定样品溶液的吸光值。

6、胆碱含量计算

胆碱含量 $(\mathrm{mg}/\mathrm{kg})=\frac{C\×100}{M}$

其中C：样品溶液实测吸光值在标准曲线中对应胆碱浓度μg/mL；

100：胆碱提取液的体积mL；

m：样品的质量g。

7、重复性

每个样品应进行两次平行测定，相对误差不超过5％，二者的平均值为最终的胆碱含量。

8、精密度和回收率试验

取上述豆粕2.0000g样品，分别加入5、15、25mL浓度为500μg/mL的胆碱储备液，按照“样品处理”项处理，根据回归方程计算实测浓度，计算每种浓度平均值及相对标准偏差，精密度以相对标准偏差表示，回收率以胆碱添加实测值与添加理论值的比值表示，结果如下。

表1精密度和回收率试验结果

实施例2动物源性原料鱼粉中总胆碱的测定方法

本实施例的主要特点在于对动物源性原料制备的饲料样品，采用碱液处理，进而实现饲料样品中胆碱的快速准确分析试验。

具体的试验方法步骤与实施例1相似，重复步骤不再赘述，只记录试验关键技术信息和差异点：

1、其他步骤与实施例1相同，不再赘述，不同步骤如下：

2、样品的处理

将鱼粉样品粉碎，全部通过0.45mm粉样筛，充分混匀，取5.0000g鱼粉于100mL烧杯，加入5mL无水乙醇，在涡旋仪上振荡至样品完全分散，再加入30mL浓度1mol/L氢氧化钠，室温下磁力搅拌20min，将烧杯放入水浴振荡锅，100rpm/min的转速下，70℃，振荡180min。然后，将烧杯中样品水解液转移至100mL容量瓶中，加入30mL浓度1mol/L盐酸，用醋酸钠缓冲液定容。取20mL鱼粉水解液于50mL离心管内，加入0.4g活性炭，涡旋振荡后室温放置10min，10000rpm/min转速离心10min，取上清液过滤，弃初始滤液5mL，收集滤液待测定。

3、精密度和回收率试验

取上述鱼粉2.0000g样品，分别加入5、15、25mL浓度为500μg/mL的胆碱储备液，按照“样品处理”项处理，根据回归方程计算实测浓度，计算每种浓度平均值及相对标准偏差，精密度以相对标准偏差表示，回收率以胆碱添加实测值与添加理论值的比值表示，结果如下。

表2精密度和回收率试验结果

从以上实例可以看出，本发明利用酶偶联氧化的比色法测定原料中总胆碱含量，该方法测定结果准确可靠，操作简单，适合饲料原料的胆碱含量的测定。

对比例1植物源性原料豆粕中总胆碱的测定方法

本对比例的主要特点是：对植物源性原料的样品采用碱液处理，分析试验碱液处理对于植物源性样品的测试的影响。

试验过程与实施例1相同，不同之处仅在于，涡旋振荡至样品完全分散后，加入30mL浓度1mol/L氢氧化钠，进行碱处理。以下是精密度和回收率试验分析过程和结果。

取豆粕2.0000g样品，分别加入5、15、25mL浓度为500μg/mL的胆碱储备液，按照“样品处理”项处理，根据回归方程计算实测浓度，计算每种浓度平均值及相对标准偏差，精密度以相对标准偏差表示，回收率以胆碱添加实测值与添加理论值的比值表示，结果如下。

表3精密度和回收率试验结果

由对比例1可以看出，当使用碱液处理植物源性样品时，测定结果准确度较差，回收率和重现性降低。

对比例2动物源性原料鱼粉中总胆碱的测定方法

本对比例的主要特点是：对动物源性原料的样品采用酸液处理，分析试验酸液处理对于动物源性样品的测试的影响。

试验过程与实施例2相同，不同之处仅在于，涡旋振荡至样品完全分散后，加入30mL浓度1mol/L盐酸溶液，进行酸处理。以下是精密度和回收率试验分析过程和结果。

取鱼粉2.0000g样品，分别加入5、15、25mL浓度为500μg/mL的胆碱储备液，按照“样品处理”项处理，根据回归方程计算实测浓度，计算每种浓度平均值及相对标准偏差，精密度以相对标准偏差表示，回收率以胆碱添加实测值与添加理论值的比值表示，结果如下。

表4精密度和回收率试验结果

由对比例2可以看出，当使用酸液处理动物源性样品时，测定结果准确度较差，回收率和重现性降低。

对比例3活性炭对植物性原料豆粕中总胆碱的测定的影响

本对比例的主要特点是：对植物源性原料的样品采用酸液处理，排除活性炭的脱色处理步骤，分析活性炭脱色处理对于样品的测试的影响。

试验过程与实施例1相同，不同之处仅在于，不再使用活性炭进行脱色处理。以下是精密度和回收率试验分析过程和结果。

取豆粕2.0000g样品，分别加入5、15、25mL浓度为500μg/mL的胆碱储备液，按照“样品处理”项处理，根据回归方程计算实测浓度，计算每种浓度平均值及相对标准偏差，精密度以相对标准偏差表示，回收率以胆碱添加实测值与添加理论值的比值表示，结果如下。

表5精密度和回收率试验结果

由对比例3可以看出，当不使用活性炭进行样品脱色处理时，测定结果准确度较差，回收率和重现性降低。

对比例4活性炭对动物源性原料鱼粉中总胆碱的测定的影响

本对比例的主要特点是：对动物源性原料的样品采用碱液处理，并排除活性炭脱色处理步骤，分析试验碱液处理以及活性炭脱色对于动物源性样品的测试的影响。

试验过程与实施例1相同，不同之处仅在于，涡旋振荡至样品完全分散后，加入30mL浓度1mol/L氢氧化钠，进行碱处理，并且样品处理完以后不使用活性炭脱色处理，考查无活性炭脱色处理的情况下，检测分析结果的准确性、重现性、可靠性。以下是精密度和回收率试验分析过程和结果。

取鱼粉2.0000g样品，分别加入5、15、25mL浓度为500μg/mL的胆碱储备液，按照“样品处理”项处理，根据回归方程计算实测浓度，计算每种浓度平均值及相对标准偏差，精密度以相对标准偏差表示，回收率以胆碱添加实测值与添加理论值的比值表示，结果如下。

表6精密度和回收率试验结果

由对比例4可以看出，当不使用活性炭进行样品脱色处理时，测定结果准确度较差，回收率和重现性降低。

实施例3植物源性原料豆粕中总胆碱的测定方法，分析温度对反应的影响

实施过程同实施例1，只是在样品的处理的时候，加入盐酸混合均匀以后，对加热温度进行对比研究，分别尝试50℃、60℃、70℃、80℃、90℃时，胆碱水解释放的效率，横向对比测试结果，测试结果如图3所示。可见当温度为50-75℃时，水解效率较高，特别是70℃左右，效果最好，温度降低或升高则表现出对于水解效率不良的影响。

实施例4植物源性原料豆粕中总胆碱的测定方法，水解时间温度对反应的影响

实施过程同实施例1，只是在样品的处理的时候，加入盐酸混合均匀以后，对加热至70℃，保温120、140、160、180、200、220、240分钟，充分水解。然后测试胆碱水解释放的比率，横向对比测试结果，测试结果如图4所示。可见当水解时间为170-240分钟时，水解效率较高。当分解时长超过180分钟以后基本不再变化，所以最优选的水解时长为180分钟左右，以170-190分钟最佳。进一步减少反应时长，低于160分钟后水解比率大幅度下降；而增加时间超过200分钟后，则无水解率上升变化，只会增加检测过程的整体耗时。

Claims (10)

1.一种总胆碱的测定方法，包括以下步骤：

（1）配制试验用缓冲溶液：配制弱酸性缓冲液，弱碱性缓冲液和酶反应液；

所述弱酸性缓冲液是pH=4-7的缓冲液，

所述弱碱性缓冲液是pH=7-8的缓冲液，

所述酶反应液是混合酶反应液，混合酶反应液至少包含有胆碱氧化酶和磷脂酶D，用上述弱碱性缓冲溶液配置；

（2）配制标准溶液：配制氯化胆碱标准溶液；

（3）用分光光度计测定氯化胆碱标准溶液的吸光系数；

（4）将样品预处理，然后用分光光度计测定经过预处理的样品的吸光系数，并计算出样品中胆碱的含量；

其特征在于：

步骤（4）中样品的预处理及测定，包括以下步骤：

（4a）取含有胆碱的饲料样品，粉碎，加入无水乙醇，溶解分散均匀，样品混合均匀后进行水解处理，搅拌使样品分散均匀，水浴加热至50-80℃，加热时长170-240分钟；而后振荡均匀，调节pH至弱酸性，并用步骤（1）中配制的弱酸性缓冲液定容；

（4b）涡旋振荡，离心，取上清液过滤，收集滤液用于测定；

（4c）用于测定的滤液，加入10-20倍体积的酶反应液，保证用于测试的滤液呈弱碱性；

在37℃左右保温反应10-60分钟；

以样品空白为参比，在步骤（3）中相同的测试波长下，测试样品溶液的吸光值，并计算胆碱的含量。

2.根据权利要求1所述的总胆碱的测定方法，其特征在于，磷脂酶D的浓度至少为0.7U/mL；优选的，胆碱氧化酶至少为0.8U/mL。

3.根据权利要求1所述的总胆碱的测定方法，其特征在于，混合酶反应液含有胆碱氧化酶、过氧化物酶、邻联茴香胺、曲拉通和磷脂酶D。

4.根据权利要求3所述的总胆碱的测定方法，其特征在于，混合酶的浓度分别为胆碱氧化酶1.0-1.2U/mL、过氧化物酶2.5-2.8U/mL、邻联茴香胺1mmol/L、曲拉通浓度为1%和磷脂酶D 0.75-1.0U/mL。

5.根据权利要求1所述的总胆碱的测定方法，其特征在于，所述弱酸性缓冲液是乙酸钠缓冲液；优选的，所述弱碱性缓冲液是Tris-盐酸缓冲液。

6.根据权利要求1所述的总胆碱的测定方法，其特征在于，可见光分光光度计在400-450nm波长测试样品的吸光系数，优选在420nm测定吸光系数。

7.根据权利要求1所述的总胆碱的测定方法，其特征在于，在步骤（4a）中含有胆碱的样品，粉碎至粒度小于0.45mm。

8.根据权利要求1所述的总胆碱的测定方法，其特征在于，在步骤（4a）中采用酸碱水解处理样品。

9.根据权利要求8所述的总胆碱的测定方法，其特征在于，酸碱水解处理样品时：如果样品主要为植物性原料则加入酸液，如果样品主要为动物性原料则加入碱液。

10.根据权利要求1所述的总胆碱的测定方法，其特征在于，在步骤（4b）中，包括加入活性炭吸附脱色。