CN104531793A - 全细胞生物转化制备l-2-氨基丁酸的方法 - Google Patents

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本发明涉及一种全细胞生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法。所述方法是：将苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶串联表达，克隆氯霉素抗性的表达载体上，实现二个酶在同一细菌中共表达；甲酸酶克隆到卡拉霉素抗性pET-28a载体上进行表达，和大肠杆菌中辅酶I代谢途径中限速步骤的pcnB基因串联表达，实现二个酶的高表达；将二种抗性的表达载体，转化到同一个细菌里进行共表达，实现了四个酶，在同一属主菌里的表达；用大肠杆菌发酵表达含有四种酶的大肠杆菌用全细胞，实现从苏氨酸到L-2-氨基丁酸的生物还原转化。本发明使得在转化体系内，不需要添加辅酶就可以实现2-酮基丁酸的高效转化，成本低、方法简单。

Description

全细胞生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法
技术领域
本发明涉及一种全细胞生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法。
背景技术
L-2-氨基丁酸是重要的药物中间体和化工原料，市场需求非常大，每年市场在2000多吨以上。目前工业上主要是采用化学法进行合成。化学法的优势是制备成本低，但对环境污染严重，随着国家对环保的要求提高，用生物法制备L-2-氨基丁酸收到人们的青睐，生物法的优点是污染小，环境友好，属于绿色工业产品，是发展方向。但现行的生物转化方法，步骤多，涉及到酶制备，和需要在生物还原转化体系中加入辅酶，成本无法和化学合成法相比。传统的方法都是先采用苏氨酸脱氨酶，将苏氨酸脱氨，得到2-酮基丁酸，然后再用亮氨酸脱氢酶进行生物还原转化，制备获得L-2-氨基丁酸。特别是第一步需要将苏氨酸使用价格昂贵的苏氨酸脱氢酶，先行脱氨，再添加辅酶，用酶法进行转化。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种步骤简单、成本低的全细胞生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种全细胞生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法，将苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶串联表达，克隆氯霉素抗性的表达载体上，表达载体选用T7启动子，低拷贝的复制起点，实现二个酶在同一细菌中共表达；
甲酸酶的比活性低，克隆到中等拷贝的卡拉霉素抗性pET-28a载体上进行表达，和大肠杆菌中辅酶I代谢途径中限速步骤的pcnB基因串联表达，实现二个酶的高表达；
将二种抗性的表达载体，转化到同一个细菌里进行共表达，实现了四个酶，在同一属主菌里的表达，通过不同的拷贝的表达载体，调节了同一细菌中表达出的几个酶有一个合适的活性比例，可以有助于实现高效率生物转化。用大肠杆菌发酵表达含有四种酶的大肠杆菌用全细胞实现从苏氨酸到L-2-氨基丁酸的生物还原转化。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本申请建立的技术是采用细菌的全细胞进行转化，一个菌同时表达四个酶，进行生物还原转化，避免酶的纯化，显著性的降低了成本，过表达辅酶I在大肠杆菌里合成的限速步骤酶pcnB基因，使得内源性辅酶增加，避免2-酮基丁酸生物还原转化过程添加价格昂贵的辅酶I。这些改进使得生物转化制备L-2-氨基丁酸的成本极大地降低，为生物转化制备L-2-氨基丁酸工业化提供一条新途径。
传统的方法都是先采用苏氨酸脱氨酶，将苏氨酸脱氨，得到2-酮基丁酸，然后再用亮氨酸脱氢酶进行生物还原转化，制备获得L-2-氨基丁酸。我们用同一个菌，表达四个酶，避免将苏氨酸先用苏氨酸脱氢酶，显著地降低了制备L-2-氨基丁酸的工业化成本。
考虑到甲酸酶的比活性较低，我们采用中等拷贝的表达载体pET-28a实现甲酸酶的高效表达，而活性相对较高的苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶用低拷贝的表达载体在同一细菌里进行表达，优化了同一细胞中酶的比例，实现生物转化的高效率。
在相对较高的的甲酸酶表达载体上，串联表达了大肠杆菌里辅酶I合成的限速步骤的pcnB基因，并实现高表达。结果使得在转化体系内，不需要添加辅酶就可以实现2-酮基丁酸的高效转化。
具体实施方式
实例1：将pET28的载体的抗性和复制起点，替换成pLys S的氯霉素抗性和复制起点，然后将苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶，串联克隆到该载体上；将甲酸酶和pcnB基因串联到pET28a载体上；二个不同抗性的表达载体，同时转入到大肠杆菌BL21(DE3)表达属主菌里，在IPTG的诱导下，实现4个酶的同时表达。
用大肠杆菌发酵表达含有四种酶的大肠杆菌用全细胞实现从苏氨酸到L-2-氨基丁酸的生物还原转化。
实施例2：
将上述四个酶同时表达的菌体，配制成悬浮液，加入一定量的甲酸铵和苏氨酸，在30度进行转化，然后不断补加苏氨酸，到终浓度为0.8 M，L-2-氨基丁酸基本停止转化，离心去掉菌体，上清浓缩到干，用甲醇洗涤去盐，得到纯度为98%的L-2-氨基丁酸，EE值在99%以上。
本申请，采用将苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶，克隆到一个氯霉素抗性的低拷贝的表达载体上，将活性低甲酸克隆到pET28a载体上。为增加表达工程菌的内源性辅酶I，同时将大肠杆菌内源性辅酶I合成的限速步骤的酶pcnB基因，和甲酸酶基因串联表达。实现4个酶，在二个不同抗性载体，转化到同一细菌BL21(DE3) 菌里，共表达。用我们的工程菌，可以直接以L-苏氨酸作为底物，进行全细胞生物转化，获得L-2-氨基丁酸的高效制备。

Claims (4)

1.一种全细胞生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法是：
将苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶串联表达，克隆氯霉素抗性的表达载体上，实现二个酶在同一细菌中共表达；
甲酸酶克隆到卡拉霉素抗性pET-28a载体上进行表达，和大肠杆菌中辅酶I代谢途径中限速步骤的pcnB基因串联表达，实现二个酶的高表达；
将二种抗性的表达载体，转化到同一个细菌里进行共表达，实现了四个酶，在同一属主菌里的表达；
用大肠杆菌发酵表达含有四种酶的大肠杆菌用全细胞，实现从苏氨酸到L-2-氨基丁酸的生物还原转化。
2.根据权利要求1所述的一种全细胞生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶串联表达的表达载体选用T7启动子。
3.根据权利要求1所述的一种全细胞生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，甲酸酶采用中等拷贝的表达载体pET-28a实现甲酸酶的高效表达。
4.根据权利要求1或2所述的一种全细胞生物转化制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶用低拷贝的表达载体在同一细菌里进行表达。
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