CN104531630A - 一种环氧化物水解酶突变体的设计及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种高对映体选择性的AuEH2G218S和AuEH2S247Y突变酶的设计与构建，通过序列同源性分析、同源建模、分子对接和动力学模拟等最终确定突变位点，利用大引物PCR技术获得突变基因命名为Aueh2G218S和Aueh2S247Y。本发明还公开了突变酶工程菌的构建以及高效表达的方法，制备的突变酶具有高高对映体选择性及催化活性的特性，具有较大的工业化生产潜力。

Description

一种环氧化物水解酶突变体的设计及制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程和蛋白质表达领域，尤其涉及AuEH2G218S和AuEH2S247Y酶基因的构建，以及该酶的制备和性质研究。
背景技术
环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase,EH，EC,3.3.2.-)又称环氧化物水合酶或环氧水化酶，是一类催化水分子立体选择性的加成环氧化物水解为相应1,2-二醇的水解酶类。此类水解酶具有较好的区域选择性和对映体选择性，因此成为动力学拆分消旋体环氧化物制备手性环氧化物与二醇的理想生物催化剂。
手性环氧化物和邻二醇是有机合成中重要的手性合成子，是合成现在手性药物、农业、香料及精细化工等行业各种活性物质的重要中间体。一些手性的环氧化物和二醇已用于β-肾上腺素受体抑制剂、减肥药、神经药物、抗癌药物，杀虫剂及液晶材料等的生产，具有广阔的应用前景和市场需求。传统化学合成法由于其合成产物为消旋体，进行手性拆分尤为困难，常需要用到重金属元素等有毒物质，不仅面临着资源和环境巨大的挑战，且很难获得高对映体得率的化合物。在化学法和生物法制备手性纯环氧化物的方法中，酶动力学拆分法由于其高的对映体选择受到广大研究者的重视。EH广泛存在于植物、昆虫、哺乳动物及微生物体内，微生物来源的EH具有不依赖辅因子的酶，其来源广泛，底物谱宽广，对映体选择性高等特性，对其研究已成为当前研究的热点。
目前，研究较多的微生物EH主要来自于黑曲霉(Aspergillus niger)、黏红酵母(Rhodotorulaglutinis)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter AD1)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，这些EH对一些特定的底物具有较高的催化活性和高对映体选择性。近年来，分子生物学技术，如定点突变、饱和突变、错易PCR和DNA shuffling等也用于改造EH的催化活性、稳定性、对映体选择性等性质，并通过高通量筛选获得性质提高的突变酶。基于同源建模，分子对接，动力学模拟等理性设计的宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)环氧化物水解酶(AuEH2)的分子改造研究未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种对映体选择性不同的AuEH2G218S和AuEH2S247Y酶的设计与构建方法，对宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)环氧化物水解酶(AuEH2)进行了分子改造。
本发明的技术方案：综合考虑分子对接、同源建模、结合能计算、同源性分析等因素确定宇佐美曲霉AuEH2基因突变位点，设计特异性突变引物，构建突变酶基因Aueh2G218S和Aueh2S247Y，并成功实现其在大肠杆菌中的表达。AuEH2G218S和AuEH2S247Y的cDNA序列及氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
携带有宇佐美曲霉AuEH2基因的重组质粒pET-28a(+)-Aueh2由江南大学构建和保藏(专利公开号:CN102994470A)。
所述的突变酶的活性测定方法：
在2mL EP管中各加入800μL磷酸钾缓冲液(pH 7.0)和100μL稀释适当超声破碎粗酶液，在30℃下预温5min，然后各加入100μL 200mM消旋体环氧苯乙烷(SO)立即记时反应10min后。取反应液200μL加入至含有1mL乙酸乙酯(1mM的正戊醇作为内标)萃灭，1000rpm离心2min后，吸取上层有机相加入无水MgSO4干燥后，过0.22μm有机膜，用手性GC色谱柱CP-Chirasil-Dex CB测定(S)/(R)-SO浓度。对映体过量率计算公式为ee＝(S-R)×100/(S+R)。计算当ee达到99％时，(S)-SO得率＝残余(S)-SO浓度×100/初始SO浓度。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟分解1μmol SO所需的酶量定义为1个环氧化物水解酶的活性单位(U)。
所述的酶基因的构建和表达的方法：
(1)以已知的黑曲霉EH的晶体结构(PDB：1Q07)为模板，同源建模获得AuEH2的三维结构。
(2)用AutoDock 4.2软件将模型底物分子(S)-SO和(R)-SO分别与AuEH2进行分子对接，统计出催化三联体结合的(S)/(R)-SO分子内的氨基酸，同源性分析排除保守位点氨基酸，根据氨基酸的性质、空间结果及位置等选择多个点进行同源建模，获得突变酶的三维结构，并计算AuEH2及突变酶与(S)-SO)和(R)-SO之间的结合能，及亲核攻击191氨基酸Asp上O原子与环氧化物环氧环上未取代C原子距离，综合以上因素选择分别将218位甘氨酸突变为丝氨酸、247位丝氨酸突变为酪氨酸。
(3)突变酶AuEH2G218S和AuEH2S247Y基因的获得：基于上面设计的突变位点，设计并合成特异性定点突变引物如下：
G218S-F：5′-GCCTGCTATATGTCGAAGCCATCGAGC-3'，
S247Y-F：5′-TGCTACCTTTGGCTATGGTTATGCTGT-3'，
根据AuEH2基因序列设计并合成上下游引物如下：
AuEH2-F：5'-GAATTCATGGCACTCGCTTACAGCAA-3'，含EcoR Ⅰ酶切位点；
AuEH2-R：5'-GCGGCCGCTCATTTTCTACCAGCCCATAC-3'，含Not Ⅰ酶切位点；
先分别以pET-28a(+)-Aueh2为模板，分别以G218S-F和AuEH2-R、S247Y-F和AuEH2-R为引物分别PCR合成大引物B-G218S和B-S247Y。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析并割胶回收目的条带。然后以大引物(B-G218S或者B-S247Y)和AuEH2-F以pET-28a(+)-Aueh2为模板进行PCR获得突变酶基因M-G218S和M-S247Y，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-Aueh2G218S、pUCm-T-Aueh2S247Y)，转化JM109感受态细胞，经蓝白斑筛选选择正确的重组子送上海生工测序。
将测序结果正确的pUCm-T-Aueh2G218S、pUCm-T-Aueh2S247Y与pET-28a(+)质粒均用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a(+)-Aueh2G218S、pET-28a(+)-Aueh2S247Y，并对重组质粒进行序列测定。
(4)E.coli BL21(DE3)/Aueh2G218、E.coli BL21(DE3)/Aueh2S247Y的构建、表达及活性测定：将pET-28a(+)-Aueh2G218S、pET-28a(+)-Aueh2S247Y分别转化E.coli BL21(DE3)，在含有Kan抗性平板上筛选转化子。挑去阳性转化子于2mL含Kan抗性的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，以1％的接种量转接到30mL相同培养基中，28℃振荡培养至对数生长中期(OD600为0.6～0.8)，加人0.2mM的IPTG诱导8h。同时以含pET-28a(+)空质粒的E.coli BL21(DE3)为阴性对照。重组表达菌经超声破碎后测定EH的活性及对映体比率(E)，及(S)-SO对映体过量率ee值。
本发明的有益效果：本发明提供了两种宇佐美曲霉AuEH2G218S和AuEH2S247Y突变酶的设计与构建的方法，新型突变酶工程菌的构建及突变酶的高效表达的方法。突变酶具有高对映体选择性、高催化效率的优点，有较大应用潜力，也为EH的研究奠定了理论基础。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1突变酶基因及其表达质粒的构建
采用大引物PCR技术构造突变酶基因Aueh2G218S和Aueh2S247Y：分别以G218S-F和AuEH2-R、S247Y-F和AuEH2-R为引物、以pET-28a(+)-Aueh2为模板进行PCR(94℃4min；94℃30s，45℃30s，72℃30s，2个循环；94℃30s，55℃30s，72℃30s，28个循环；72℃10min)，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带得到大引物；以第一轮PCR割胶回收产物和AuEH2-F为引物进行大引物PCR(94℃4min；94℃30s，45℃30s，72℃30s，2个循环；94℃30s，55℃30s，72℃30s，28个循环；72℃10min)，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并pUCm-T连接(pUCm-T-Aueh2G218S、pUCm-T-Aueh2S247Y)，转化JM109感受态细胞，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
实施例2E.coli BL21(DE3)/Aueh2G218、E.coli BL21(DE3)/Aueh2S247Y的构建、表达及活性测定
将pET-28a(+)-Aueh2G218S、pET-28a(+)-Aueh2S247Y分别转化E.coli BL21(DE3)，在含有Kan抗性平板上筛选转化子。挑去阳性转化子于2mL含Kan抗性的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，以1％的接种量转接到30mL相同培养基中，28℃振荡培养至对数生长中期(OD600为0.6～0.8)，加人0.2mM的IPTG诱导8h。同时以含pET-28a(+)空质粒的E.coli BL21(DE3)为阴性对照，经SDS-PAGE检测实现了突变酶在大肠杆菌中的表达。重组表达菌经超声破碎后，利用突变酶动力学拆分消旋体SO，生产的(S)-SO对映体过量率ee值均大于98％。

Claims (4)

1.一种源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的环氧化物水解酶的定向改造酶AuEH2G218S和AuEH2S247Y，其核苷酸序列对应于序列表中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3。
2.由权利要求1所述的环氧化物水解酶基因(Aueh2G218S和Aueh2S247Y)编码的高对映体选择性环氧化物水解酶(AuEH2G218S和AuEH2S247Y)，其完整的氨基酸序列对应于序列表中的SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。
3.理性设计突变位点：
用AutoDock4.2软件将模型底物分子(S)-SO和(R)-SO分别与AuEH2进行分子对接，统计出催化三联体结合的(S)/(R)-SO分子内的氨基酸，同源性分析排除保守位点氨基酸，根据氨基酸的性质、空间结果及位置等选择多个点进行同源建模，获得突变酶的三维结构，并计算AuEH2及突变酶与(S)-SO和(R)-SO之间的结合能，及亲核攻击氨基酸Asp上O原子与环氧化物环氧环上未取代C原子距离，综合以上因素选择分别将218位甘氨酸突变为丝氨酸、247位丝氨酸突变为酪氨酸。
4.突变酶基因Aueh2G218S和Aueh2S247Y序列的获取方法：
基于上面设计的突变位点，设计并合成特异性定点突变引物如下：
G218S-F：5′-GCCTGCTATATGTCGAAGCCATCGAGC-3'，
S247Y-F：5′-TGCTACCTTTGGCTATGGTTATGCTGT-3'，
根据AuEH2基因序列设计并合成上下游引物如下：
AuEH2-F：5'-GAATTCATGGCACTCGCTTACAGCAA-3'，含EcoR Ⅰ酶切位点；
AuEH2-R：5'-GCGGCCGCTCATTTTCTACCAGCCCATAC-3'，含Not Ⅰ酶切位点；
分别以G218S-F和AuEH2-R、S247Y-F和AuEH2-R为引物、以pET28a(+)-Aueh2为模板进行PCR(94℃4min；94℃30s，45℃30s，72℃30s，2个循环；94℃30s，55℃30s，72℃30s，28个循环；72℃10min)，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带(分别为549bp和463bp)得到大引物；以第一轮PCR割胶回收产物和AuEH2-F为引物进行大引物PCR(94℃4min；94℃30s，45℃30s，72℃30s，2个循环；94℃30s，55℃30s，72℃30s，28个循环；72℃10min)，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收PCR产物(均为1188bp)获得目的基因。
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