CN104530213A - 一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺 - Google Patents

一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺 Download PDF

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肖大年
张政
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Abstract

本发明公开了一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺，包括如下步骤：(1)获取目的基因；(2)PCR扩增：在微量离心管中,以步骤(1)中得到的1μg/mL目的基因为模板DNA，加入适量的缓冲液、4种dNTP混合物、0.5-2.5U/50μL的DNA聚合酶体系、一对0.1-0.5μmol/L合成DNA的引物,体系pH为6.8-7.8；(3)基因重组；(4)转化；(5)分离纯化；(6)基因表达；(7)修饰；(8)冻干，本发明的干扰素能够在短时间内大量生产，用聚乙二醇修饰之后，延长了干扰素的半衰期，提高了对肝炎病毒靶向性，并且抗原性弱，不会引起人体的免疫反应，药效好，固定化生产，稳定性好，适于推广应用。

Description

一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺。
背景技术
病毒性肝炎感染后发病多呈隐匿性,持续感染会导致肝硬化和原发性肝癌,死亡率很高，对于最终发展成肝硬化的患者,唯一有效的治疗就是进行肝脏移植,但是在肝移植手术不能普及的情况下,对慢性病毒性肝炎进行早期治疗就显得尤为重要，目前,病毒性肝炎的治疗尚无特效药,主要采用干扰素、核苷类抗病毒药和各类中成药，即是免疫增强药，但是现行市场上的干扰素半衰期短，靶向性不足，更严重的是天然干扰素药物具有抗原活性，申请号为CN200510069269.6公开了一种乙型肝炎基因工程靶向干扰素及其生产工艺，乙型肝炎基因工程靶向干扰素采用构建人源抗HBsAg的dsFv基因,与a-干扰素(IFN-a)基因连接,运用基因工程技术表达乙肝靶向干扰素(dsFv-IFV融合蛋白)，乙型肝炎基因工程靶向干扰素的生产工艺,将制成的培养基与菌株接种后送进培养箱培养,完成培养后的细菌在繁殖间大量繁殖,然后通过分离收集细菌,并裂解分离包涵体蛋白,在折叠液中复性,再经纯化、浓缩,最后分装冻干，亲和层析纯化后证明该融合蛋白具有干扰素活性和与乙肝病毒表面抗原的反应性，融合蛋白属于人源，避免异源性带来的危害，但是该干扰素仍具有抗原性，另外靶向性不足。
发明内容
为克服现有技术上的不足，本发明目的是提供一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺，包括如下步骤：
(1)获取目的基因:从病毒性肝炎患者体内获取效应T细胞，在温度为37℃，PH为7.0的条件下，用限制性内切酶对DNA进行部分酶解，得到控制干扰素合成的目的基因，备用；
(2)PCR扩增:在微量离心管中,以步骤(1)中得到的1μg/mL目的基因为模板DNA，加入适量的缓冲液、4种dNTP(即dATP、dCTP、dGTP、dTTP)混合物、0.5-2.5U/50μL的DNA聚合酶体系、一对0.1-0.5μmol/L合成DNA的引物,体系PH为6.8-7.8，PCR扩增包括如下基本反应步骤：
①预变性：温度92℃，反应5min，使双链DNA模板解离成为单链；
②变形：温度92℃，反应65s，使双链DNA模板解离成为单链
③复性：温度55℃，反应45s，引物与模板DNA单链互补配对结合；
④延伸：温度72℃，反应5min，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下，以脱氧核糖核苷为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的DNA链。
⑤重复“变性--复性--延伸”的循环25次，得到所需数量的目的基因；
(3)基因重组:以质粒作为运载体，运用步骤(1)中的限制性内切酶切割质粒以及目的基因，使其产生相同的黏性末端，再经过DNA聚合酶将步骤(2)中得到的扩增后的目的基因导入质粒基因中，得重组质粒；
(4)转化:将大肠杆菌悬浮于3℃的0.4mol/L氯化钙溶液中，并加入步骤(3)中的重组质粒，混合后放置约半小时，然后短暂升温至42℃使细菌进入热休克状态，加入富营养培养基以进行复苏，使之处于感受态主动摄取外源遗传物质。
(5)分离纯化:在牛肉膏蛋白胨培养基上培养步骤(4)得到的大肠杆菌， 挑取含有标记基因的菌落，将其接种到另一培养基中培养，重复挑取培养过程，直至达到纯度要求；
(6)基因表达:经过分离纯化的工程菌置于发酵罐中培养，控制温度为37℃，PH为6.8，从发酵罐流出液中即可提取，得到干扰素；
(7)修饰:向反应釜里加入分子量20000直链单甲氧基聚乙二醇、步骤(6)所得干扰素、50mmol/L磷酸盐缓冲液，混合均匀，在温度为25℃、PH为8.5、200r/min震荡反应4h，用30％的冰醋酸终止反应，反应产物经过0.45μm尼龙膜过滤、脱气后，让流动相通过色谱柱，采用线性梯度洗脱和等度洗脱相结合的方法进行提纯，得修饰干扰素；
(8)冻干:将样品稀释至1×106IU/ml，加入2％蔗糖、3％甘氨酸、0.5％吐温-80，0.2％明胶作为保护剂，分装至西林瓶中，每瓶1ml，放入冻干箱冻干，得产品。
优选的，所述步骤(2)中，所述DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。
优选的，所述步骤(2)中，所述缓冲液为10-50mmol/L的磷酸缓冲液、50mmol/L的KCl、5mmol/L的二硫苏糖醇、100μg/mL的牛血清白蛋白、0.5mmol/L-2mmol/L的Mg2+的混合溶液。
优选的，所述步骤(8)中，所述保护剂中各物质含量为2％蔗糖、3％甘氨酸、0.5％吐温-80，0.2％明胶。
有益效果：本发明通过获取目的基因、PCR扩增、基因重组、转化、分离纯化、基因表达、修饰、冻干八大步骤完成病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺，能够在短时间内大量生产，用聚乙二醇修饰之后，延长了干扰素的半衰期，提高了对肝炎病毒靶向性，并且抗原性弱，不会引起人体的免疫反应，药效好，固定化生产，稳定性好，整个成产过程严格控制温度和PH，得到的干扰素稳定性好，可以有效进行批量化生产，在PCR扩增步骤中，PCR技术具有速度快，灵 敏度高的特点，按照碱基互补配对原则进行，扩增精确，另外扩增量大，所选DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶，TaqDNA聚合酶耐热性能好，保证DNA链在高温条件下正常聚合，缓冲液中的100μg/mL牛血清白蛋白、二硫苏糖醇具有很好的稳定酶活性的作用，Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，影响酶的活性和真实性，浓度在0.5mmol/L-2mmol/L之间时，酶的活性高，采用聚乙二醇对干扰素进行氨基化修饰，增加了干扰素的分子量,稳定性得到提高，减少药物***，屏蔽了一些干扰素分子表面的抗原决定簇,减少免疫原性,降低体内清除率，并减缓了蛋白酶的水解，延长干扰素的半衰期，冻干步骤中加入2％蔗糖、3％甘氨酸、0.5％吐温-80，0.2％明胶，有效的保证了干扰素的生物活性在1.4×108IU/mg以上，且在4℃、6个月的环境下仍具有良好的温定性能。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面
结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1：
本实施例的一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺，包括如下步骤：
(1)获取目的基因:从病毒性肝炎患者体内获取效应T细胞，在温度为37℃，PH为7.0的条件下，用限制性内切酶对DNA进行部分酶解，得到控制干扰素合成的目的基因，备用；
(2)PCR扩增:在微量离心管中,以步骤(1)中得到的1μg/mL目的基因为模板DNA，加入适量的缓冲液、4种dNTP(即dATP、dCTP、dGTP、dTTP)混合物、0.5U/50μL的DNA聚合酶体系、一对0.1mol/L合成DNA的引物,体系PH为6.8，PCR扩增包括如下基本反应步骤：
①预变性：温度92℃，反应5min，使双链DNA模板解离成为单链；
②变形：温度92℃，反应65s，使双链DNA模板解离成为单链
③复性：温度55℃，反应45s，引物与模板DNA单链互补配对结合；
④延伸：温度72℃，反应5min，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下，以脱氧核糖核苷为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的DNA链。
⑤重复“变性--复性--延伸”的循环25次，得到所需数量的目的基因；
(3)基因重组:以质粒作为运载体，运用步骤(1)中的限制性内切酶切割质粒以及目的基因，使其产生相同的黏性末端，再经过DNA聚合酶将步骤(2)中得到的扩增后的目的基因导入质粒基因中，得重组质粒；
(4)转化:将大肠杆菌悬浮于3℃的0.4mol/L氯化钙溶液中，并加入步骤(3)中的重组质粒，混合后放置约半小时，然后短暂升温至42℃使细菌进入热休克状态，加入富营养培养基以进行复苏，使之处于感受态主动摄取外源遗传物质。
(5)分离纯化:在牛肉膏蛋白胨培养基上培养步骤(4)得到的大肠杆菌，挑取含有标记基因的菌落，将其接种到另一培养基中培养，重复3次挑取培养过程，直至达到纯度要求；
(6)基因表达:经过分离纯化的工程菌置于发酵罐中培养，控制温度为37℃，PH为6.8，从发酵罐流出液中即可提取，得到干扰素；
(7)修饰:向反应釜里加入分子量20000直链单甲氧基聚乙二醇、步骤(6)所得干扰素、50mmol/L磷酸盐缓冲液，混合均匀，在温度为25℃、PH为8.5、200r/min震荡反应4h，用30％的冰醋酸终止反应，反应产物经过0.45μm尼龙膜过滤、脱气后，让流动相通过色谱柱，采用线性梯度洗脱和等度洗脱相结合的方法进行提纯，得修饰干扰素；
(8)冻干:将样品稀释至1×106IU/ml，加入2％蔗糖、3％甘氨酸、0.5％吐温 -80，0.2％明胶作为保护剂，分装至西林瓶中，每瓶1ml，放入冻干箱冻干，得产品。
其中，所述步骤(2)中，所述DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶，关键的是，所述步骤(2)中，所述缓冲液为10mmol/L的磷酸缓冲液、50mmol/L的KCl、5mmol/L的二硫苏糖醇、100μg/mL的牛血清白蛋白、0.5mmol/L的Mg2+的混合溶液，而且，所述步骤(8)中，所述保护剂中各物质含量为2％蔗糖、3％甘氨酸、0.5％吐温-80，0.2％明胶。
实施例2：
其余与所述实施例1相同，不同之处在于，所述步骤(2)中，所述DNA聚合酶体系为2.5U/50μL的DNA聚合酶体系，0.5μmol/L合成DNA的引物，体系PH为7.8，。
实施例3：
其余与所述实施例1相同，不同之处在于，所述步骤(2)中，所述DNA聚合酶体系为2U/50μL的DNA聚合酶体系，0.3μmol/L合成DNA的引物，体系PH为7，所述步骤(2)中，所述缓冲液为30mmol/L的磷酸缓冲液、50mmol/L的KCl、5mmol/L的二硫苏糖醇、100μg/mL的牛血清白蛋白、1.5mmol/L的Mg2+的混合溶液。
上述三个实施例中，检测到的DNA聚合酶活性在0.8×108IU/mg以上，PCR扩增效果明显，经过聚乙二醇氨基化学修饰后，单链聚乙二醇-干扰素含量和修饰率分别达到0.25mg/ml和36.63％，具有典型的聚乙二醇修饰蛋白的特性,体外抗原活性保留了天然抗原活性的15％，冻干后的干扰素，6个月后生物活性在1.0×108IU/mg以上。
经实际应用中可知，通过获取目的基因、PCR扩增、基因重组、转化、分离纯化、基因表达、修饰、冻干八大步骤完成病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产 工艺，能够在短时间内大量生产，用聚乙二醇修饰之后，延长了干扰素的半衰期，提高了对肝炎病毒靶向性，并且抗原性弱，不会引起人体的免疫反应，药效好，固定化生产，稳定性好，整个成产过程严格控制温度和PH，得到的干扰素稳定性好，可以有效进行批量化生产，在PCR扩增步骤中，PCR技术具有速度快，灵敏度高的特点，按照碱基互补配对原则进行，扩增精确，另外扩增量大，所选DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶，TaqDNA聚合酶耐热性能好，保证DNA链在高温条件下正常聚合，缓冲液中的100μg/mL牛血清白蛋白、二硫苏糖醇具有很好的稳定酶活性的作用，Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，影响酶的活性和真实性，浓度在0.5mmol/L-2mmol/L之间时，酶的活性高，采用聚乙二醇对干扰素进行氨基化修饰，增加了干扰素的分子量,稳定性得到提高，减少药物***，屏蔽了一些干扰素分子表面的抗原决定簇,减少免疫原性,降低体内清除率，并减缓了蛋白酶的水解，延长干扰素的半衰期，冻干步骤中加入2％蔗糖、3％甘氨酸、0.5％吐温-80，0.2％明胶，有效的保证了干扰素的生物活性在1.4×108IU/mg以上，且在4℃、6个月的环境下仍具有良好的温定性能。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (4)

1.一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获取目的基因：从病毒性肝炎患者体内获取效应T细胞，在温度为37℃，PH为7.0的条件下，用限制性内切酶对DNA进行部分酶解，得到控制干扰素合成的目的基因，备用；
(2)PCR扩增：在微量离心管中,以步骤(1)中得到的1μg/mL目的基因为模板DNA，加入适量的缓冲液、4种dNTP混合物、0.5-2.5U/50μL的DNA聚合酶体系、一对0.1-0.5μmol/L合成DNA的引物,体系PH为6.8-7.8，PCR扩增包括如下基本反应步骤：
①预变性：温度92℃，反应5min，使双链DNA模板解离成为单链；
②变形：温度92℃，反应65s，使双链DNA模板解离成为单链
③复性：温度55℃，反应45s，引物与模板DNA单链互补配对结合；
④延伸：温度72℃，反应5min，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用
下，以脱氧核糖核苷为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的DNA链。
⑤重复“变性--复性--延伸”的循环25次，得到所需数量的目的基因；
(3)基因重组:以质粒作为运载体，运用步骤(1)中的限制性内切酶切割质粒以及目的基因，使其产生相同的黏性末端，再经过DNA聚合酶将步骤(2)中得到的扩增后的目的基因导入质粒基因中，得重组质粒；
(4)转化:将大肠杆菌悬浮于3℃的0.4mol/L氯化钙溶液中，并加入步骤(3)中的重组质粒，混合后放置约半小时，然后短暂升温至42℃使细菌进入热休克状态，加入富营养培养基以进行复苏，使之处于感受态主动摄取外源遗传物质。
(5)分离纯化:在牛肉膏蛋白胨培养基上培养步骤(4)得到的大肠杆菌，挑取含有标记基因的菌落，将其接种到另一培养基中培养，重复挑取培养过程，直至达到纯度要求；
(6)基因表达:经过分离纯化的工程菌置于发酵罐中培养，控制温度为37℃，PH为6.8，从发酵罐流出液中即可提取，得到干扰素；
(7)修饰:向反应釜里加入分子量20000直链单甲氧基聚乙二醇、步骤(6)所得干扰素、50mmol/L磷酸盐缓冲液，混合均匀，在温度为25℃、PH为8.5、200r/min震荡反应4h，用30％的冰醋酸终止反应，反应产物经过0.45μm尼龙膜过滤、脱气后，让流动相通过色谱柱，采用线性梯度洗脱和等度洗脱相结合的方法进行提纯，得修饰干扰素；
(8)冻干:将样品稀释至1×106IU/ml，加入2％蔗糖、3％甘氨酸、0.5％吐温-80，0.2％明胶作为保护剂，分装至西林瓶中，每瓶1ml，放入冻干箱冻干，得产品。
2.根据权利要求1所述的病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺，其特征在于，所述步骤(2)中，所述DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。
3.根据权利要求1所述的病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺，其特征在于，所述步骤(2)中，所述缓冲液为10-50mmol/L的磷酸缓冲液、50mmol/L的KCl、5mmol/L的二硫苏糖醇、100μg/mL的牛血清白蛋白、0.5mmol/L-2mmol/L的Mg2+的混合溶液。
4.根据权利要求1所述的病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺，其特征在于，所述步骤(8)中，所述保护剂中各物质含量为2％蔗糖、3％甘氨酸、0.5％吐温-80，0.2％明胶。
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