一种提取侧柏叶中黄酮类物质的方法
技术领域
本发明涉及一种黄酮类物质的提取方法,具体涉及一种从侧柏叶中提取黄酮类物质的方法。
背景技术
近年来,由于自由基生命科学的进展,使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的黄酮类物质受到空前的重视。其抗氧化作用比VE强50倍,比VC强20倍,而且能通过血脑屏障到达脑部,防治中枢神经***的疾病,尤其对皮肤的保养、年轻化及血管抗炎作用特别显著。目前,从银杏叶、紫苏叶、龙柏叶、槐花、香椿嫩叶中提取黄酮类化合物报道较多。但是从侧柏叶中提取黄酮类物质并不多见。
侧柏叶是侧柏的干燥嫩枝梢及叶,含有类黄酮、鞣质、精油等多种天然活性成分,具有凉血止血、化痰止咳、祛风降湿、生发乌发、消肿散毒的功效,侧柏叶中黄酮类物质是其最重要的成分之一。因而,侧柏叶中黄酮类化合物的提取对于食品科学和医学的发展有很重要的影响。
目前应用于侧柏叶黄酮类物质的提取方法主要有:有机溶剂萃取法、酶提取法、超声提取法、微波提取法。其中,有机溶剂提取法是国内外采用的最为广泛的方法,但这种方法周期长、步骤多、产率低,且产品中会有有机溶剂的残留,对提取后产品质量有影响;酶提取法必须要保持最佳温度、最佳pH值,对整个反应的条件控制要求比较高;超声波提取技术大大的提高了提取效率、缩短了提取时间、节约溶剂,并且免去了高温对提取成分的破坏,但大量提取时效率低;微波提取法,具有快速、溶剂用量少、提取率高、成本低和质量好等许多优点,但其成品的组成不是非常稳定;显而易见,无论是何种提取技术都有自身的不足和局限性,而本项发明采用冻融与超声波技术联合提取,冻融技术的特点是:细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时,发生溶胀、破碎,使黄酮类物质得以充分释放,并且还保持活性。该技术是一种高效、环保的提取方法。目前还未见应用冻融技术提取侧柏叶黄酮类物质的报道。实验证明采用冻融与超声波技术联合提取高效且环保。
发明内容
发明目的:针对上述黄酮类物质的提取方法的不足之处,本发明提供了一种高效、环保的提取方法。
技术方案:本方法按以下步骤进行:
(1)将侧柏叶洗净、烘干、粉碎,过40目筛,得到侧柏叶粉,然后加入水,均匀混合;所加入的水与侧柏叶的质量比约为5:1。
(2)将步骤(1)得到的混合液在-40~-20℃的温度下冰冻10~24小时,室温下放置直至其融化;重复冰冻-融化步骤2~3次;如此,细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时,发生溶胀、破碎。使黄酮类物质得以充分释放,并且还保持活性。
(3)向步骤(2)所得混合液中加入乙醇充分混匀,乙醇与混合液的体积比约为1:1,浸泡1~3h后,进行超声波提取,超声功率为60~100W;超声温度为40~80℃;超声时间为20~60min;超声的空化作用对细胞膜的破坏有助于黄酮类化合物的释放与溶出,超声波使提取液不断震荡,有助于溶质扩散。因此,超声波法大大缩短了提取时间,提高了有效成分的提出率,原料的利用率。超声结束后进行离心分离,取上清液,冻干,得到粗品。
(4)将粗品配制成浓度为1~3mg/mL的溶液,滴加到大孔树脂柱中进行饱和吸附,吸附后用水洗脱除去杂质,再用60~80%乙醇作为洗脱剂,对洗脱剂进行回收溶剂和浓缩处理,最后进行冻干,即得到黄酮类物质。所述的大孔树脂为D-101、AB-8或DM-130。所述溶液的滴加量为柱体积的1.5倍;水及乙醇的用量为柱体积的5倍。
更进一步的,我们发现,如果在步骤(2)结束后,将所得混合液再次冰冻,然后置于超声环境下融解,超声功率为60~100W;超声时间为60~90min,由于超声波的热效应使水温增高,对原料有水浴作用,温度自然升高至35~40℃,不仅使得混合液快速融化,而且可以促进黄酮类化合物的释放与溶出。在超声环境下融解后,在进行步骤(3)、(4),此方法所得到的产物提取率大大提高,测定侧柏叶黄酮类物质提取率最高达到18.2%。
有益效果:本发明具有以下特点:整体工艺设计简单合理,创造性的结合了多种技术,弥补了单一技术的不足,大大提高了黄酮类物质的提取率;由于侧柏叶的特殊性,本发明提取过程中,保持了相对较低的温度,很好的保持了侧柏叶黄酮类物质的活性,使得产品非常稳定;本发明溶剂用量小且易于回收,节约成本;提取过程中仅使用了水和乙醇两种溶剂,并没有引入氯仿、乙酸乙酯等其它溶剂,对环境无污染;这些特点都极大程度上符合了工业化生产的要求。
具体实施方式:
以下通过具体的实施例对本发明进一步说明:
实施例1
取新鲜的侧柏叶,称重、洗净,自然阴干后于烘箱中60℃烘干作为原料;粉碎至40目,得到侧柏叶粉;准确称量20g侧柏叶粉,加入100mL水,制成侧柏叶混合液;将侧柏叶混合液在-20℃下进行冰冻,24h后取出室温融化,如此反复三次;加入无水乙醇100mL,充分混匀,浸泡2h后,进行超声波提取:超声功率60W;超声时间20min;超声温度40℃;离心分离,取上清液。将上清液放置于冻干机中进行冻干处理,得到粗品;将粗品准确配制浓度为1mg/mL的溶液,滴加到AB-8大孔树脂柱中进行饱和吸附,最大上样量为1.5倍柱体积,先用5倍柱体积的水洗脱除去杂质,再用5倍柱体积的60%乙醇洗脱,收集洗脱液、浓缩、冻干,得侧柏叶黄酮类物质样品2.42g。
测定:采用紫外分光光度法,以芦丁作为标准对照品,绘制芦丁标准曲线,测定侧柏叶黄酮类物质的含量。
(1)标准曲线的绘制
准确称取芦丁标准品1.0mg,用浓度为50%的乙醇定容至25.0mL。
准确吸取芦丁标准品(48μg/mL)0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于6支比色管中,分别用50%的乙醇至5.0mL,0.1M三氯化铝溶液3.0mL和1M醋酸钾溶液5.0mL,摇匀,同法制成空白对照;放置40min,待反应完全,于415nm波长处测定吸光度值。以芦丁标准品浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线。
(2)侧柏叶黄酮类物质提取率的测定
提取率Y%=m1/m2×100%
式中:m1为得到侧柏叶黄酮类物质样品的质量(g);
m2为使用侧柏叶粉的质量(g)。
(3)侧柏叶提取物中黄酮类物质含量的测定
称取5mg提取物置于25mL容量瓶中,按上述芦丁标准曲线绘制方法配制溶液,并测其吸光度。通过标准曲线计算提取物中的黄酮类物质含量。
含量P%=CVD×10-3/m×100%
式中:C为由标准曲线计算得出的待测试液的黄酮类物质浓度(mg/mL);
V为待测样品溶液总体积(mL);
D为待测试液的稀释倍数;
m为称取的提取物质量(mg)。
根据上述公式,得到侧柏叶黄酮类物质提取率为12.1%,提取物中黄酮类物质含量为82.0%;
采用常规提取方法(未经冰冻-融化处理、没有超声波辅助、其它条件一样)所得结果为:黄酮类物质提取率为3.6%,提取物中黄酮类物质含量为29.3%;可见,本发明采用冻融与超声波联合技术提取侧柏叶黄酮类物质,可以获得提取率高、质量优且无污染的产品。
实施例2
准确称量20g侧柏叶粉,加入100mL水,制成侧柏叶混合液;将侧柏叶混合液在-40℃下进行冰冻,10h后取出室温融化,如此反复三次;加入无水乙醇100mL,充分混匀,浸泡2h后,进行超声波提取:超声功率80W;超声时间40min;超声温度60℃;离心分离,取上清液。将上清液放置于冻干机中进行冻干处理,得到粗品;将粗品准确配制浓度为2mg/mL的溶液,滴加到D-101大孔树脂柱中进行饱和吸附,最大上样量为1.5倍柱体积,先用5倍柱体积的水洗脱除去杂质,再用5倍柱体积的70%乙醇洗脱,收集洗脱液、浓缩、冻干,即得侧柏叶黄酮类物质样品2.74g。
测定方法同实施例1:测定侧柏叶黄酮类物质提取率为13.7%,提取物中黄酮类物质含量为83.7%。
采用常规提取方法(未经冰冻-融化处理、没有超声波辅助、其它条件一样)所得结果为:黄酮类物质提取率为3.8%,提取物中黄酮类物质含量为28.1%;
实施例3
准确称量20g侧柏叶粉,加入100mL水,制成侧柏叶混合液;将侧柏叶混合液在-20℃下进行冰冻,24h后取出室温融化,如此反复三次;加入无水乙醇100mL,充分混匀,浸泡3h后,进行超声波提取:超声功率100W;超声时间60min;超声温度80℃;离心分离,取上清液。将上清液放置于冻干机中进行冻干处理,得到粗品;将粗品准确配制浓度为3mg/mL的溶液,滴加到D-130大孔树脂柱中进行饱和吸附,最大上样量为1.5倍柱体积,先用5倍柱体积的水洗脱除去杂质,再用5倍柱体积的80%乙醇洗脱,收集洗脱液、浓缩、冻干,即得侧柏叶黄酮类物质样品2.88g。
测定方法同实施例1:测定侧柏叶黄酮类物质提取率为14.4%,提取物中黄酮类物质含量为80.5%;
采用常规提取方法(未经冰冻-融化处理、没有超声波辅助、其它条件一样)所得结果为:黄酮类物质提取率为3.9%,提取物中黄酮类物质含量为26.5%。
实施例4
准确称量20g侧柏叶粉,加入100mL水,制成侧柏叶混合液;将侧柏叶混合液在-20℃下进行冰冻,24h后取出室温融化,如此反复三次;加入无水乙醇100mL,充分混匀,浸泡2h后,进行超声波提取:超声功率100W;超声时间40min;超声温度70℃;离心分离,取上清液。将上清液放置于冻干机中进行冻干处理,得到粗品;将粗品准确配制浓度为3mg/mL的溶液,滴加到D-101大孔树脂柱中进行饱和吸附,最大上样量为1.5倍柱体积,先用5倍柱体积的水洗脱除去杂质,再用5倍柱体积的80%乙醇洗脱,收集洗脱液、浓缩、冻干,即得侧柏叶黄酮类物质样品2.96g。
测定方法同实施例1:测定侧柏叶黄酮类物质提取率为14.8%,提取物中黄酮类物质含量为84.7%;
采用常规提取方法(未经冰冻-融化处理、没有超声波辅助、其它条件一样)所得结果为:黄酮类物质提取率为4.1%,提取物中黄酮类物质含量为30.2%;
利用本发明所述的方法提取侧柏叶中黄酮类物质与常规提取方法相比较,试验结果见下表:
表1
从表1中可以看出本发明采取了冰冻-融化以及超声波辅助的技术提取黄酮类物质,所得侧柏叶黄酮类物质提取率和提取物中黄酮类物质含量均远远大于常规提取方法。提取率14%左右,且产品稳定,提取物中黄酮类物质含量大于80%。
更进一步的,我们研究了冰冻-融解过程中超声波的应用。具体实施例如下:
实施例5
准确称量20g侧柏叶粉,加入100mL水,制成侧柏叶混合液;将侧柏叶混合液在-20℃下进行冰冻,24h后取出室温融化,如此反复三次;水液放置于冻干机中进行冻干处理,得到粗品;将粗品准确配制浓度为3mg/mL的溶液,滴加到D-101大孔树脂柱中进行饱和吸附,最大上样量为1.5倍柱体积,先用5倍柱体积的水洗脱除去杂质,再用5倍柱体积的80%乙醇洗脱,收集洗脱液、浓缩、冻干,即得侧柏叶黄酮类物质样品1.16g。
测定方法同实施例1:侧柏叶黄酮类物质提取率5.8%,提取物中黄酮类物质含量为83.9%;
实施例5-1
准确称量20g侧柏叶粉,加入100mL水,制成侧柏叶混合液;将侧柏叶混合液在-20℃下进行冰冻,24h后取出室温融化,如此反复二次;然后再次在-20℃下进行冰冻,24h后取出在超声环境下进行融化,由于超声的热效应,温度自然升高至35℃,约80min融化后,水液放置于冻干机中进行冻干处理,得到粗品;将粗品准确配制浓度为3mg/mL的溶液,滴加到D-101大孔树脂柱中进行饱和吸附,最大上样量为1.5倍柱体积,先用5倍柱体积的水洗脱除去杂质,再用5倍柱体积的80%乙醇洗脱,收集洗脱液、浓缩、冻干,即得侧柏叶黄酮类物质样品2.38g。
测定方法同实施例1:侧柏叶黄酮类物质提取率11.9%,提取物中黄酮类物质含量为84.1%;
实施例4-1
准确称量20g侧柏叶粉,加入100mL水,制成侧柏叶混合液;将侧柏叶混合液在-20℃下进行冰冻,24h后取出室温融化,如此反复二次;然后再次在-20℃下进行冰冻,24h后取出在超声环境下进行融化,由于超声的热效应,温度自然升高至36℃,约80min融化后,加入无水乙醇100mL,充分混匀,浸泡2h后,进行超声波提取:超声功率100W;超声时间40min;超声温度70℃;离心分离,取上清液。将残渣按上述方法进行处理1次,合并上清液;将上清液放置于冻干机中进行冻干处理,得到粗品;将粗品准确配制浓度为3mg/mL的溶液,滴加到D-101大孔树脂柱中进行饱和吸附,最大上样量为1.5倍柱体积,先用5倍柱体积的水洗脱除去杂质,再用5倍柱体积的80%乙醇洗脱,收集洗脱液、浓缩、冻干,即得侧柏叶黄酮类物质样品3.64g。
测定方法同实施例1:测定侧柏叶黄酮类物质提取率为18.2%,提取物中黄酮类物质含量为84.3%。
试验结果见下表:
表2
从表2中可见在冰冻-融化过程中,在超声环境下进行融化,可以有效的提高侧柏叶黄酮类物质的提取率。这是因为在超声的环境下融化,由于超声波的热效应使水温基本维持在35~40℃,使得混合液快速融化,同时其空化作用可以促进黄酮类化合物的释放与溶出,提高了侧柏叶黄酮类物质的提取率。