CN104521943A - 一种云斑尖塘鳢***超低温冷冻保存及复苏方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种云斑尖塘鳢***超低温冷冻保存及复苏方法，其步骤是：1、一种云斑尖塘鳢***超低温保存的方法：(1)云斑尖塘鳢***的采集；(2)***活力检测；(3)***的稀释；(4)***的冻前平衡；(5)加抗冻剂及分装；(6)程序降温；(7)进入液氮。2、一种云斑尖塘鳢***超低温保存的复苏方法：(1)从液氮罐中取出冻精；(2)解冻；(3)冻精存放与备用；(4)人工授精。本发明的方法对云斑尖塘鳢***进行超低温保存及复苏，从而为进一步开展云斑尖塘鳢的杂交育种、人工繁殖以及种质保存提供优质***，为云斑尖塘鳢遗传改良奠定基础。本发明的方法操作简单，快捷，费用低廉，实用性强。

Description

一种云斑尖塘鳢***超低温冷冻保存及复苏方法

技术领域

本发明属于水产养殖学领域，涉及鱼类种质保存技术，具体涉及一种云斑尖塘鳢***超低温冷冻保存及复苏方法。

背景技术

目前，鱼类种质保存主要以***保存为主。***的保存可分为常温保存、低温保存以及超低温冷冻保存三种。***的寿命随其能量的消耗殆尽而结束。其能量消耗主要在两个方面：一个是运动(摆尾游动)；第二是调节细胞内外渗透压平衡(非主动运输耗能)。因此，减缓***的能量消耗，就可以将之寿命延长。常温保存是根据***的生理特性，配制一定浓度的稀释液，从而减少***用来调节渗透压平衡时的能量消耗进而延长***的寿命，通常能够延长几十分钟至几小时之久。低温保存的原理是：低温能降低***代谢活动(低温酶类效率降低)，通常能够延长几天至几十天。超低温保存则是让***在超低温(-196℃)条件下，其运动和代谢几乎完全停止，***处于类假死状态，生命以接近静止状态保存下来。***在理想状态下能够无限期的保存，解冻后又会“复活”。

云斑尖塘鳢(Oxyeleotrismarmorata)是我国引种并养殖的名贵淡水鱼品种，由于其体形似笋壳，故俗名为笋壳鱼。该鱼原产于东南亚泰国一带，最大个体可达5～6公斤，其肉质细嫩、营养价值高、味道鲜美且刺少，是一种名贵食用鱼，在东南亚各国和港澳、台湾等地区及日本深受消费者欢迎，是这些东南亚国家大宗出口的主要淡水鱼产品。由于产地国笋壳鱼仍停留在依靠自然资源捕获养殖的水平上，无法满足市场强劲的消费需求，导致目前该商品鱼市场批发价上涨到160～200元/kg。由此可见，云斑尖塘鳢的市场前景好，是一种新兴的、高产值、高效益的水产养殖新品种。为了能进一步开展云斑尖塘鳢的新品种选育、人工繁殖以及种质保存，为市场提供更加优质的云斑尖塘鳢新品种和苗种，需要进行云斑尖塘鳢***超低温保存和人工繁殖。然而，无论是***的超低温保存，还是进行人工繁殖，都需要一种稀释液对云斑尖塘鳢鲜精进行稀释，而且需要一种激活液对鲜精或冻精(经超低温保存后的***再解冻)进行激活。

云斑尖塘鳢***中所含***的密度很高，一般可以达到1.8×10⁹个/mL以上，当对云斑尖塘鳢***进行超低温保存时，含高密度***的精原液是不能直接进行超低温冷冻保存的，这是因为在冷冻过程中，当温度降到0℃～-20℃区间时，被保存的***中会形成冰晶，冰晶像锋利的刀一样刺向四周的***，将***刺破，***中的***密度越高，***被刺破的概率也越高，这种在冷冻过程中冰晶对***的物理损伤将直接导致***超低温冷冻保存的失败。因此，冷冻前必须要对***进行稀释。而在进行云斑尖塘鳢人工繁殖时，由于***中含***密度很高，若不稀释就用，不仅对该鱼***是一种浪费，而且鲜精黏稠度大，使***不易与卵子混合均匀，从而导致授精效果也不好。如果对***进行稀释后，再用来进行人工授精，可大大降低人工授精的成本，同时还能起到很好的授精效果，获得较高的受精率。因此，云斑尖塘鳢***稀释液的作用就是在不激活***的前提下，对***进行稀释，使***尽可能的保持其原有的生物学特性。

当***被超低温保存时，为了提高***的抗冻能力，除了对***进行稀释外，还需要在稀释的***中添加一定量的抗冻剂，如二甲亚砜(DMSO)等。由于抗冻剂具有很强的吸水性，当被添加到***中后，可以使***细胞内的一部分水被吸出。***细胞的水分流失导致***细胞内的细胞液浓度升高，***的冰点也随之升高，从而提升了***的抗冻能力。也正是由于***细胞内的细胞液浓度升高，***的渗透压也会随之升高。这样，冻精的渗透压与鲜精相比会高出30～40％。含如此高内部渗透压的冻精，如果直接用淡水激活进行人工授精，在巨大的渗透压差作用下，其冻精一遇见水就可能破裂，从而使人工授精失败。解决这一问题的办法就是用具有一定渗透压的***激活液来替代淡水对云斑尖塘鳢冻精进行激活，以减少这种渗透压差。因此，云斑尖塘鳢***激活液的作用就是减少这种渗透压差，使得云斑尖塘鳢冻精在激活时不会破裂，顺利实现用冻精进行该鱼的人工授精。另外，***激活液除了减少冻精与激活液间的渗透压差，保护冻精在激活过程中不破裂的作用外，对一般云斑尖塘鳢鲜精也有使***活力优化的作用。这是因为激活液是由不同离子或大分子物质组成的，这些离子和大分子物质对***的运动可以起到一定的优化作用。

目前，由于环境恶化、近亲繁殖等引起的物种灭绝、种质退化、品质下降以及病害频发等现象日趋严重，超低温冷冻保存技术作为基因长期保存的有效工具逐渐成为解决这些问题的首选。此外，超低温保存技术还可以为遗传育种研究长期不断的提供***材料，这在雌雄核发育、性别控制及以***作为载体生产转基因生物等方面均有应用价值。

迄今对塘鳢科鱼类***保存及复苏方法报道很少，未见对云斑尖塘鳢***超低温冷冻保存及复苏方法的报道。由于云斑尖塘鳢属于热带鱼类，其原始祖先来自海洋，后来移居淡水生活，其***保存及复苏方法既不同于淡水鱼类也不同于海水鱼类，按照已公开的淡水鱼类或海水鱼类***保存及复苏方法对云斑尖塘鳢***超低温冷冻保存及复苏均不成功；有待于进一步研究。

发明内容

一种云斑尖塘鳢***超低温冷冻保存及复苏方法的发明内容包括云斑尖塘鳢***超低温保存和复苏方法两大部分，其具体发明内容如下：

一种云斑尖塘鳢***超低温保存的方法，其步骤是：

(1)云斑尖塘鳢***的采集：选择性腺发育成熟的云斑尖塘鳢雄鱼，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水。用手轻轻挤压雄鱼腹部，待能挤出***后，用干燥的滴管吸取***，开始3-5滴***不要采集，然后将***挤入干燥的容器中，混匀。

(2)***活力检测：在10×20倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到90％以上，平均曲线运动速度(VCL)达到35微米/秒以上，平均直线运动速度达到20微米/秒以上，该***便可用于超低温冷冻保存。将镜检合格的***放入4℃冰箱保存备用。

(3)***的稀释：准确量取需要被冷冻的云斑尖塘鳢***，加入***约3倍体积(为了分装方便，稀释液的量可适当增减一点，增减的量一般不超过总量的10％)的***稀释液，使***与稀释液的稀释比达到约1∶3。***与稀释液混匀，备用。

所述的***稀释液为云斑尖塘鳢特有的***稀释液，其配方为：7.0g/L氯化钠(NaCl)，1g/L氯化钾(KCl)，15g/L葡萄糖(C₆H₁₂O₆)。该稀释液盐度7.3，pH为7.5。放置在4℃冰箱保存，备用。

(4)***的冻前平衡：将稀释后的***放入4℃冰箱，进行冻前平衡。云斑尖塘鳢***的冻前平衡时间为15～45分钟。15分钟为最少平衡时间，如果平衡时间不到15分钟，则冷冻效果会下降。45分钟为最长平衡时间，15分钟到45分钟以内，冷冻效果没有差异，超过45分钟，则冷冻效果随着时间的延长逐渐降低。

(5)加抗冻剂及分装：在平衡好的云斑尖塘鳢***中直接加入抗冻剂，使抗冻剂在***中的终浓度达到10％。抗冻剂加入后，立即混匀，分装至0.5mL麦管，6支麦管装入1个麦管套中，1个冷冻架上可放2个麦管套。注意所有的管内不能留有气泡，分装过程必须在冰面完成，分装完成的管子在没有进入程序降温仪前，应全部埋在冰里，确保管内的***不会升温。

所述的抗冻剂为二甲亚砜(DMSO)，无需配制，直接用原液。抗冻剂是利用其吸水作用，使***中的部分水脱出，细胞质浓度升高，从而达到降低***冰点的目的，防止***在冷冻过程中***内部形成冰晶。放置在4℃冰箱保存，备用。

(6)程序降温：降温是在程序降温仪中进行，程序降温仪由计算机控制，当计算机被输入自行设计的降温程序后，程序降温仪会按照设计好的程序开始降温。将分装好的***以最快的速度放入程序降温仪的冷冻室中。云斑尖塘鳢的降温程序从0℃开始，以5℃/分钟的速度降至-15℃，在-15℃停留5分钟，然后再以25℃/分钟速度从-15℃降至-85℃，最后在-85℃处平衡10分钟。

所述的降温程序为：从0℃开始，以5℃/分钟的速度降至-15℃，在-15℃停留5分钟，然后再以25℃/分钟速度从-15℃降至-85℃，最后在-85℃处平衡10分钟。

(7)进入液氮：降温完成后，直接将装有***的麦管或冷冻管连同冷冻支架一起从程序降温仪中取出，立即放入液氮罐中，在-196℃温度中保存。

一种云斑尖塘鳢***超低温保存的复苏方法，其步骤是：

(1)从液氮罐中取出冻精：首先在液氮表面平衡15分钟，然后用长镊子从液氮罐中冷冻支架上取下1支麦管套的冻精(1支麦管套内装6支麦管，每支麦管装有0.5mL冻精，共3mL冻精)。在液氮罐口放置30～60秒后，从麦管套中取出麦管，准备解冻。

(2)解冻：将麦管直接放入30℃水浴中，在水浴中不断晃动麦管，10秒后见麦管内气泡可上下移动时，即说明麦管内冻精已经解冻。

(3)冻精存放与备用：将解冻后的***集中到一个干燥的容器中，放入4℃冰箱备用。冰箱存放时间最多不超过30分钟就必须用于人工授精。

(4)人工授精：将解冻备用的3mL冻精倒入挤出的卵中，用羽毛轻轻搅匀。然后加入50mL预先配制好的***通用激活液，轻轻搅拌3分钟，静置1分钟后，再加入500mL以上清水激活***以达到受精，即可将卵移入孵化器中孵化。

所述的***激活液为云斑尖塘鳢通用激活液，其配方为：2.6g/L氯化钠(NaCl)，0.4g/L氯化钾(KCl)，2.4g/L Tris-HCl。该激活液pH为8.2。放置在4℃冰箱保存，备用。

具体实施方式

本发明具体实例如下，具体参数为说明本发明技术方案所需，不应理解为对本发明保护范围的限制。

一、云斑尖塘鳢***的超低温冷冻保存

1、配备***稀释液：配方为7.0g/L氯化钠(NaCl)，1g/L氯化钾(KCl)，15g/L葡萄糖(C₆H₁₂O₆)。该稀释液盐度为7.3，pH为7.5。放置在4℃冰箱保存，备用。

2、***准备：选择体重500克以上且性腺发育成熟的云斑尖塘鳢雄鱼，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水。用手轻轻挤压雄鱼腹部，待能挤出***后，用干燥的滴管吸取***，开始3-5滴***不采集，然后将***挤入干燥的容器中，混匀。将***用清水激活后，在10×20倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到90％以上，平均曲线运动速度(VCL)达到35微米/秒以上，平均直线运动速度达到20微米/秒以上。

3、准备超低温冷冻保存：准确量取需要被冷冻的云斑尖塘鳢0.75mL×6***，加入2.25mL×6***稀释液，混匀。将稀释后的***放入4℃冰箱进行冻前平衡，30分钟后加如抗冻剂二甲亚砜(DMSO)，使抗冻剂在***中的终浓度达到10％。

4、程序降温：抗冻剂加入后，立即混匀，分装至0.5mL麦管，6支麦管装入1个麦管套中，1个冷冻架上可放2个麦管套。将分装好的***以最快的速度放入程序降温仪的冷冻室中。所述的降温程序为：从0℃开始，以5℃/分钟的速度降至-15℃，在-15℃停留5分钟，然后再以25℃/分钟速度从-15℃降至-85℃，最后在-85℃处平衡10分钟。降温完成后，直接将装有***的麦管或冷冻管连同冷冻支架一起从程序降温仪中取出，立即放入液氮罐中，在-196℃温度中保存。

二、云斑尖塘鳢超低温保存***的复苏：

1、配备***激活液：其配方为：2.6g/L氯化钠(NaCl)，0.4g/L氯化钾(KCl)，2.4g/L Tris-HCl。该激活液pH为8.2。放置在4℃冰箱保存，备用。

2、挤卵：对体重400克以上的云斑尖塘鳢雌鱼进行催产，达到效应期后，采用腹部挤压法将卵轻轻挤入小陶瓷碗中。

3、解冻及复苏：从液氮罐中取出冷冻1个月以上的云斑尖塘鳢冻精：首先在液氮表面平衡15分钟，然后用长镊子从液氮罐中冷冻支架上取下1支麦管套的冻精(1支麦管套内装6支麦管，每支麦管装有0.5mL冻精，共3mL冻精)。在液氮罐口放置30～60秒后，从麦管套中取出麦管，将麦管直接放入37℃水浴中，在水浴中不断晃动麦管，10秒后见麦管内气泡可上下移动时，即说明麦管内冻精已经解冻。

4、人工授精：将解冻备用的3mL冻精倒入挤出的云板尖塘鳢的卵中，用羽毛轻轻搅匀。然后加入50mL预先配制好的***通用激活液，轻轻搅拌3分钟，静置1分钟后，再加入500mL以上清水激活***以达到受精，即可将受精卵移入孵化器中孵化，受精率超过85％，同时利用小部分复苏后的冻精进行镜检，平均存活率达到90％以上。

Claims (8)

1.一种云斑尖塘鳢***超低温保存的方法，其步骤是：

(1)云斑尖塘鳢***的采集：选择性腺发育成熟的云斑尖塘鳢雄鱼，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水；用手轻轻挤压雄鱼腹部，待能挤出***后，用干燥的滴管吸取***，开头3-5滴***不要，然后将***挤入干燥的容器中，混匀；

(2)***活力检测：在10×20倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到90％以上，平均曲线运动速度(VCL)达到35微米/秒以上，平均直线运动速度达到20微米/秒以上，该***便可用于超低温冷冻保存；将镜检合格的***放入4℃冰箱保存备用；

(3)***的稀释：准确量取需要被冷冻的云斑尖塘鳢***，加入***3倍体积的***稀释液，使***与稀释液的稀释比达到1∶3；***与稀释液混匀，备用；

(4)***的冻前平衡：将稀释后的***放入4℃冰箱，进行冻前平衡；云斑尖塘鳢***的冻前平衡时间为15～45分钟；

(5)加抗冻剂及分装：在平衡好的云斑尖塘鳢***中直接加入抗冻剂二甲亚砜(DMSO)，使抗冻剂在***中的终浓度达到10％；抗冻剂加入后，立即混匀，分装至麦管；所有的管内不能留有气泡，分装过程必须在冰面完成，分装完成的管子在没有进入程序降温仪前，应全部埋在冰里；

(6)程序降温：将分装好的***以快速放入程序降温仪的冷冻室中；云斑尖塘鳢的降温程序从0℃开始，以5℃/分钟的速度降至-15℃，在-15℃停留5分钟，然后再以25℃/分钟速度从-15℃降至-85℃，最后在-85℃处平衡10分钟；

(7)进入液氮：降温完成后，直接将装有***的麦管或冷冻管取出，立即放入液氮罐中，在-196℃温度中保存。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)所用的雄鱼为云斑尖塘鳢(Oxyeleotris marmorata)，且体重在500克以上。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述的***稀释液配方为：7.0g/L氯化钠(NaCl)，1g/L氯化钾(KCl)，15g/L葡萄糖(C6H12O6)；该稀释液盐度为7.3，pH为7.5；放置在4℃冰箱保存，备用。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中***的冻前平衡步骤为：将稀释后的***放入4℃冰箱，进行冻前平衡；云斑尖塘鳢***的冻前平衡时间为15～45分钟。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中所述的抗冻剂二甲亚砜(DMSO)在***中的终浓度达到10％。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中所述的降温程序为：从0℃开始，以5℃/分钟的速度降至-15℃，在-15℃停留5分钟，然后再以25℃/分钟速度从-15℃降至-85℃，最后在-85℃处平衡10分钟。

7.一种云斑尖塘鳢***超低温保存后的复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从液氮罐中取出冻精：首先在液氮表面平衡15分钟，然后用长镊子从液氮罐中取下装有冻精的麦管；在液氮罐口放置30～60秒后，准备解冻；

(2)解冻：将麦管直接放入37℃水浴中，在水浴中不断晃动麦管，10秒后见麦管内气泡可上下移动时，即说明麦管内冻精已经解冻；

(3)冻精存放与备用：将解冻后的***集中到一个干燥的容器中，放入4℃冰箱备用；冰箱存放时间最多不超过30分钟就必须用于人工授精；

(4)人工授精：将解冻备用的3mL冻精倒入挤出的卵中，用羽毛轻轻搅匀；然后加入50mL预先配制好的***通用激活液，轻轻搅拌3分钟，静置1分钟后，再加入500mL以上清水激活***以达到受精，即可将受精卵移入孵化器中孵化。

8.如权利要7所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)所述的***激活液配方为：2.6g/L氯化钠(NaCl)，0.4g/L氯化钾(KCl)，2.4g/L Tris-HCl；该激活液pH为8.2，放置在4℃冰箱保存，备用。