CN104520714A - 与对人双微体2(mdm2)抑制剂的敏感性相关的标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了监测生物标志物的差异性基因表达以确定患者对人双微体抑制剂(MDM2i)的敏感性的方法、通过测量生物标志物确定细胞对MDM2i的敏感性的方法和筛选候选MDM2i的方法。

Description

与对人双微体2(MDM2)抑制剂的敏感性相关的标志物
发明领域
本发明涉及药物基因组学领域以及可用于治疗之前确定患者敏感性、治疗后跟随患者响应、癌敏感性和化合物筛选的生物标志物的用途。
背景
p53，也称作肿瘤蛋白53，是参与预防癌症的肿瘤抑制基因，经常被称作基因组的看门人或保护人(Levine,Cell 1997,88:323-331)。P53基因编码一种正常情况下静止并且当细胞应激或受损时(如当因诱变剂遭致DNA损伤时)变得激活的转录因子。如果细胞应激或受损，p53发挥作用以限制损伤或若无这种作用，则触发凋亡途径，从而受损细胞被消除并且不再威胁生物(Vogelstein等人,Nature 2000,408:307-310)。对不同癌的分析显示p53在约50％的人类癌症中突变(Hollstein等人,Nucleic Acids Res.1994,22:3551-3555:Hollstein等人,Science 1991,253(5015):49-53)。p53杂合(仅具有单个有功能拷贝)的人将在成年早期形成肿瘤，一种称作Li-Fraumeni综合征的病症(Varley等人,Hum.Mutat.2003,21(3):313-320)。然而，尽管p53调节细胞命运，p53受另一种称作MDM2的蛋白质调节。
发现双微体2蛋白(MDM2)作为p53的负向调节物(Fakharzadeh等人,EMBO J.1991,10(6):1565-1565)。MDM2编码含有p53结合结构域和核输出信号序列的E3连接酶，并且与p53复合时，将它从胞核移出并使其泛素化，这促进p53蛋白经泛素-蛋白体途径降解(Haupt等人,Nature 1997,387(6630):296-299；Piette等人,Oncogene 1997 15(9):1001-1010)。此外，通过与p53反式激活结构域结合，MDM2直接抑制p53的活性，还阻止p53介导的基因表达(Wu等人,Genes Dev.1993,7:1126-1132)。因此，MDM2以多种方式调节p53。
MDM2在许多癌例如脂肪肉瘤、胶质母细胞瘤和白血病中过量表达(Momand等人,Nucleic Acids Res.1998,26(15):3453-3459)。MDM2的过量表达能干扰p53的活性，从而阻止肿瘤的凋亡和生长停滞(de Rozieres等人,Oncogene 2000,19(13):1691-1697)。MDM2过量表达与神经胶质瘤和急性淋巴细胞性白血病的不良预后相关(Onel等人,Mol.Cancer Res.2004,2(1):1-8)。
由于MDM2是p53的抑制剂，阻止MDM2与p53结合的治疗剂将防止p53降解，从而允许游离p53在癌细胞中结合并介导基因表达，导致细胞周期停滞和凋亡。先前报道了p53-MDM2相互作用的小分子抑制剂(Vassilev等人,Science,2004,303(5659):844-888；Zhang等人,Anticancerdrugs,2009 20(6):416-424；Vu等人,Curr.Topics Microbiol.Immuno.,2011,348:151-172)。也已知这些化合物结合模式和人MDM2–Nutlin复合物的晶体结构以及MDM2上p53结合位点的支架和口袋(Vassilev，上文)。这类MDM2抑制剂的第一种(称作Nutlin)结合MDM2并占据p53结合口袋，阻止MDM2-p53复合物形成。这导致p53蛋白较少降解和p53靶基因的表达。用Nutlin处理的癌细胞系显示生长停滞和凋亡增加。例如，SJSA-1骨肉瘤系含有MDM2基因的扩增拷贝。用Nutlin-3处理这个细胞系减少增殖并增加凋亡(Vassilev等人,Science,2004,303(5659):844-888)。SJSA-1细胞系在小鼠中用于产生异种移植物。Nutlin-3的施用减少异种移植物生长90％。为了调查Nutlin化合物对非癌细胞所拥有的作用，将人和小鼠的正常成纤维细胞用Nutlin-3处理，并且尽管细胞增殖减慢，但它们保留其活力(Vassilev，上文)。
找到指示哪位患者应当接受治疗剂的生物标志物是有用的，特别对癌症而言。与试错法相比，这允许更及时和激进的治疗。此外，发现显示细胞在施用后持续对治疗敏感的生物标志物也是有用的。这些生物标志物可以用来监测接受治疗剂的那些患者的反应。如果生物标志物显示患者已经变得对治疗不敏感，则可以增加、减少、完全停用施用的剂量或施用额外的治疗剂。因而，需要开发与MDM2抑制剂相关的生物标志物。这种方法确保正确的患者接受适宜治疗并且在治疗过程期间可以对患者监测持续的MDM2抑制剂敏感性。
在开发MDM2抑制剂时，特定生物标志物将有助于理解施用时的作用机制。这种作用机制可能涉及细胞周期方面的复杂调节机制级联和差异性基因表达。这项分析在药物开发的前临床阶段进行，以确定癌细胞对候选MDM2抑制剂的具体敏感性和候选物的活性。药效学研究中特别有意义的是鉴定特定的敏感性和活性标志物，如本文中公开的那些。
发明简述
本发明涉及以下分析：表2中鉴定的许多基因在确定细胞对MDM2抑制剂(下文称作“MDM2i”)的敏感性方面充当特定生物标志物。本发明涉及以下分析：表2中的至少一种生物标志物提供MDM2i的“基因标签”，所述基因标签在预测哪些癌细胞对MDM2i敏感方面具有增加的准确度和特异性。该方法在取自患者的癌样品中分析表2中至少一种生物标志物的基因表达或蛋白质水平，这预测了癌样品对MDM2i的敏感性。表达水平变化的模式可以指示有利反应或不利反应。此外，表2中提供的基因标签具有增加的预测值，因为它还指示p53通路有功能。这是出乎意料的结果，因为许多肿瘤含有突变型p53和为肿瘤提供生长优势的无功能通路。本发明是“个体化医疗”的例子，其中患者基于对该个体特异性的功能性基因组标签接受治疗。
表2中至少一种生物标志物的预测值也可以在用MDM2i治疗后使用以确定患者是否仍对治疗敏感。一旦已经施用MDM2i治疗剂，则生物标志物用来监测患者对MDM2i治疗的持续敏感性。本公开还涉及上调或下调MDM2i治疗后所鉴定基因的表达。这可用于确定患者接受了正确的治疗过程。本发明包含一种预测和监测患者对MDM2i治疗的敏感性的方法。该方法包括步骤：向患者施用MDM2i并对从患者获得的生物样品测量生物标志物基因表达。基于检测来自表2的至少一种生物标志物的基因表达评价患者的反应。检出至少一种生物标志物的表达水平和/或其改变指示患者对治疗的敏感性。表达水平的模式可以指示患者有利反应或不利反应。
附图简述
图1A显示MDM2i在破坏p53-MDM2相互作用方面的体外效力。图1B显示MDM2i在癌细胞增殖方面的体外效力。
图2显示p53状态(突变型或野生型)和癌细胞对MDM2i(2)的敏感性。X轴是敏感性的交叉点并且Y轴是Amax值。图2表明细胞对MDM2i(2)的敏感性和p53突变状态，mt(突变型)或野生型(wt)。mt组显示p53突变型CCLE细胞系的MDM2i(2)敏感性图，wt组显示p53野生型CCLE细胞系的MDM2i(2)敏感性图。Amax定义为最大效应水平(对参照抑制剂校准，在检验的最高MDM2i(2)浓度时的抑制作用)，并且IC50定义为MDM2i(2)反应相对于参照抑制剂达到-50绝对抑制作用时的μM浓度的IC50。细胞系计数按MDM2i(2)化学敏感性和p53突变状态，以及相关的统计划分。数据还显示为具有相关统计的列联表。
图3是显示表达倍数变化的生物标志物和过量表达值的统计显著性。图3显示选择的MDM2i化学敏感性预测性生物标志物和它们的相关统计结果。基因身份是官方HUGO符号。‘Expr’前缀表示这些生物标志物是转录物表达型的。
图4是敏感和不敏感代表性细胞的Western印迹法，其中所述细胞用MDM2i(1)在多种浓度处理4小时并且随后探测作为药效学生物标志物代表的选择的p53靶基因。
图5是与较大生物标志物集合对比，显示基因标签的预测值增加的图。图5显示MDM2i(2)化学敏感性预测模型的交叉验证性能。使用灵敏度(正确预测的敏感细胞系的分数)、特异性(正确预测的不敏感细胞系的分数)、PPV(正预测值，如此预测的敏感细胞系的分数)和NPV(负预测值、如此预测的不敏感细胞系的分数)，评价从三个预测性特征集合衍生的模型的性能。误差条是5次重复的5倍交叉验证范围内均值的一个标准偏差。使用表2中所示的13种所选择生物标志物的模型实现对MDM2i(2)化学敏感性的更好预测，并且这与性能度量无关，但是当将PPV视为性能指示物时最醒目。
图6是各自分析其基因标签的一列细胞系和所述细胞系是否敏感或不敏感的预测以及用MDM2i处理时的IC50。
图7A-C显示用MDM2i(1)处理后SJSA-1异种移植模型(由基因标签预测为敏感)中肿瘤生长的剂量-依赖性抑制作用，和作为代表性药效学生物标志物的p21(CDKN1A)表达的伴随诱导。
图8显示以有效剂量处理MDM2i(1)敏感细胞后p21(CDKN1A)在蛋白质水平的表达。
图9是使用OncExpress数据库和Primary Tumor Bank中的基因标签被预测为敏感的肿瘤样品的模型。图9显示MDM2i化学敏感性预测在人原发肿瘤集合和CCLE细胞系数据中的谱系特异相关性。左小图显示在自人原发肿瘤样品集合的预测敏感的样品的分数和细胞系数据中观察到的敏感性比率之间的相关性。右小图显示在自人原发肿瘤样品集合的预测敏感的样品的分数和原发肿瘤异种移植物集合中预测敏感的比率之间的相关性。样品/异种移植物/细胞系按谱系组织。短划线是身份系。
图10表示通过从表2中描述的生物标志物多个组合建立的MDM2i(2)敏感性预测模型所实现的正预测值(PPV)。图10显示通过从生物标志物多个组合建立的MDM2i(2)敏感性预测模型所实现的正预测值(PPV)。
组合和单-基因模型PPV显示为箱线图并且与通过两个p53突变状态和13个生物标志物模型给出的PPV比较(须延长1.5倍四分位距，黑线是中位数，凹槽是中位数置信区间的估计值，箱宽度与数据点的数目成比例，不显示离群值；‘bm(s’)：生物标志物；‘allExMt’：p53全部外显子突变模型；‘ex5to8mt’：p53外显子5至8突变模型)。
图11表示通过从表2中描述的生物标志物多个组合建立的MDM2i(2)敏感性预测模型所实现的特异性。图11显示通过从生物标志物多个组合建立的MDM2i(2)敏感性预测模型所实现的特异性。组合和单-基因模型特异性显示为箱须图并且与通过两个p53突变状态和13个生物标志物模型给出的PPV比较(须延长1.5倍四分位距，黑线是中位数，凹槽是中位数置信区间的估计值，箱宽度与数据点的数目成比例，不显示离群值；‘bm(s’)：生物标志物；‘allExMt’：p53全部外显子突变模型；‘ex5to8mt’：p53外显子5至8突变模型)。
图12表示通过从表2中描述的生物标志物多个组合建立的MDM2i(2)敏感性预测模型所实现的灵敏度。图12显示通过从生物标志物多个组合建立的MDM2i(2)敏感性预测模型所实现的灵敏度。组合和单-基因模型灵敏度显示为箱须图并且与通过两个p53突变状态和13个生物标志物模型给出的PPV比较(须延长1.5倍四分位距，黑线是中位数，凹槽是中位数置信区间的估计值，箱宽度与数据点的数目成比例，不显示离群值；‘bm(s’)：生物标志物；‘allExMt’：p53全部外显子突变模型；‘ex5to8mt’：p53外显子5至8突变模型)。
图13表示通过从表2中描述的生物标志物多个组合连同p53突变状态一起建立的MDM2i敏感性预测模型所实现的PPV。图13显示通过从生物标志物与p53突变状态组合建立的MDM2i(2)敏感性预测模型所实现的正预测值(PPV)。关于图的说明，参考图10、图11或图12；‘bm(s’)：生物标志物；‘mt’：p53外显子5至8突变；‘allExMt’：p53全部外显子突变模型；‘ex5to8mt’：p53外显子5至8突变模型)。
图14表示通过从表2中描述的生物标志物多个组合连同p53突变状态一起建立的MDM2i敏感性预测模型所实现的特异性。图14表示通过从生物标志物与p53突变状态组合建立的MDM2i(2)敏感性预测模型所实现的特异性。关于图的说明，参考图10、图11或图12；‘bm(s’)：生物标志物；‘mt’：p53外显子5至8突变；‘allExMt’：p53全部外显子突变模型；‘ex5to8mt’：p53外显子5至8突变模型)。
图15表示通过从表2中描述的生物标志物多个组合连同p53突变状态一起建立的MDM2i敏感性预测模型所实现的灵敏度。图15表示通过从生物标志物与p53突变状态组合建立的MDM2i(2)敏感性预测模型所实现的灵敏度。关于图的说明，参考图10、图11或图12；‘bm(s’)：生物标志物；‘mt’：p53外显子5至8突变；‘allExMt’：p53全部外显子突变模型；‘ex5to8mt’：p53外显子5至8突变模型)。
图16是显示人原发性异种移植模型对MDM2i(1)的反应和它们的预测敏感性/不敏感性的图。图16表示使用表2中公开的生物标志物时据预测对MDM2i敏感的人原发性异种移植模型经证实对每日给药100mg/kgMDM2i(1)敏感，从而支持所述预测模型用于癌症患者群体中(HMEX＝黑色素瘤；HCOX＝结直肠癌；HSAX＝脂肪肉瘤；HKIX＝肾细胞癌；CHLI或HLIX＝肝癌；HBRX＝乳腺癌；HPAX＝胰腺癌；HLUX＝肺癌)。
图17是显示针对野生型p53预先选择并且随后被预测为敏感/不敏感的人原发性异种移植模型对MDM2i(1)的反应的图。图17显示使用表2中公开的生物标志物时据预测对MDM2i敏感的野生型p53人原发性异种移植模型经证实对每日给药100mg/kg MDM2i(1)敏感，从而支持所述预测模型用于野生型p53预先选择的癌症患者群体中(HMEX＝黑色素瘤；HCOX＝结直肠癌；HSAX＝脂肪肉瘤；HKIX＝肾细胞癌；CHLI＝肝癌；HPAX＝胰腺癌；HLUX＝肺癌)。
发明概述
本发明的各方面、特征和实施方案总结于以下项中并且可以分别单独或按组合使用：
1.一种预测癌症患者对人双微体2抑制剂(MDM2i)治疗的敏感性的方法，所述方法包括：测量从该患者获得的癌样品中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并且至少一种生物标志物的基因表达表示该患者对MDM2i治疗敏感。
2.一种治疗癌症患者的方法，包括：测量从该患者获得的癌样品中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达；确定该患者对MDM2i的敏感性；并且向该患者施用MDM2i。
3.一种治疗癌症患者的方法，包括测定从该患者获得的癌样品中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达；至少一种生物标志物的存在显示该患者对MDM2i的敏感性；并且向该患者施用MDM2i。
4.一种预测癌细胞对人双微体2抑制剂(MDM2i)的敏感性的方法，所述方法包括：测定从患者癌样品获得的癌细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并且选自表2的至少一种生物标志物的基因表达表示癌细胞对MDM2i治疗敏感。
5.一种预测癌细胞对人双微体2抑制剂(MDM2i)的敏感性的方法，所述方法包括：测量细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达；并且选自表2的至少一种生物标志物的基因表达表示癌细胞对MDM2i治疗敏感。
6.一种筛选MDM2i候选物的方法，所述方法包括：
a)使细胞与MDM2i候选物接触；
b)测量与MDM2i候选物接触的细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并且至少一种生物标志物的表达显示对MDM2i的敏感性；和
c)将来自与MDM2i候选物接触的细胞的细胞增殖减少与接触于取自表1的MDM2i的细胞的细胞增殖和未处理或安慰剂处理的细胞的细胞增殖的减少比较。
7.一种确定癌细胞对人双微体2抑制剂(MDM2i)的敏感性的方法，所述方法包括：a)使癌细胞与至少一种MDM2i接触；b)测量与MDM2i接触的细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达；c)将用至少一种MDM2i处理的癌细胞的细胞增殖与未处理或安慰剂处理的癌细胞的细胞增殖比较，其中与未处理或安慰剂处理的癌细胞相比时，存在处理的癌细胞的细胞增殖减少。
8.项1至项7中任一项的方法，其中多于一种生物标志物选自表2。
9.项1或项8的方法，其中至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种或全部13种生物标志物选自表2。
10.项1至项9中任一项的方法，其中选择p53作为除选自表2的任何生物标志物之外的生物标志物。
11.项1至项10中任一项的方法，包括生物标志物MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和/或AEN。
12.项1至项11中任一项的方法，其中比较至少一种生物标志物的基因表达与对照样品的基因表达指示有功能的p53基因通路。
13.根据1至项4或项8至项12中任一项的方法，其中癌样品选自***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜。
14.项1至项13中任一项的方法，其中测量至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质。
15.项1、项2或项5至项11中任一项的方法，其中与对照相比，在癌样品中至少一种生物标志物的表达增加。
16.项1至项15中任一项的方法，其中MDM2i选自表1。
17.项1至项16中任一项的方法，其中MDM2i是与MDM2的p53结合口袋结合的化合物。
18.项1至项16中任一项的方法，其中MDM2i是与来自表1的Nutlin-3a或MDM2i结合基本上相同的MDM2的p53结合口袋的化合物。
19.项1至项18中任一项的方法，其中MDM2i是阻止p53和MDM2之间蛋白质-蛋白质相互作用的化合物。
20.项1至项19中任一项的方法，其中MDM2i是通过诱导p53通路活性抑制细胞增殖的化合物。
21.项2至项20中任一项的方法，还包括从施用MDM2i之前的患者获得生物样品。
22.项2至项21中任一项的方法，其中MDM2i以治疗有效量施用。
23.项4至项14或项16至项22中任一项的方法，其中至少一种生物标志物的基因表达在癌细胞中增加。
24.项3至项5或项7至项23中任一项的方法，其中与至少一种MDM2i接触的癌细胞的IC50小于1μM。
25.项3至项5或项7至项25中任一项的方法，其中细胞至少在两个不同时间点与MDM2i接触。
26.项3至项5或项7至项26中任一项的方法，其中细胞与两种不同的MDM2i接触。
27.项26的方法，其中在相同时间使细胞与两种不同的MDM2i接触。
28.项26的方法，其中在不同时间点使细胞与两种不同的MDM2i接触。
29.项1至项28中任一项的方法，其中MDM2i是异喹啉酮(isoquinolinone)。
30.一种筛选MDM2i候选物的方法，所述方法包括：a)使细胞与MDM2i候选物接触；b)在与MDM2i候选物接触的细胞中测量选自表2的至少一种生物标志物的基因表达；c)至少一种生物标志物的基因表达指示对MDM2i的敏感性；和d)将来自与MDM2i候选物接触的细胞的细胞增殖减少与接触取自表1的MDM2i的细胞的细胞增殖和未处理或安慰剂处理的细胞的细胞增殖的减少比较。
31.项30的方法，其中MDM2i候选物的基因表达与选自表1的MDM2i的基因表达比较。
32.项30或项31的方法，其中MDM2i候选物增加来自表2的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种或全部13种生物标志物的基因表达。
33.项30至项32中任一项的方法，其中细胞是选自***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜的癌细胞。
34.项30至项33中任一项的方法，其中测量表2的至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质的表达。
35.项30至项34中任一项的方法，包括生物标志物MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
36.包含MDM2i的组合物，用于治疗选择的癌症患者群体中的癌症，其中癌症患者群体是基于从所述患者获得的癌细胞样品中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达来选择的。
37.项36的组合物，其中至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种或全部13种生物标志物选自表2。
38.项36或项37的组合物，其中选择p53作为除选自表2的任何生物标志物之外的生物标志物。
39.项36至项38中任一项的组合物，其中生物标志物是MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和/或AEN。
40.项36至项39中任一项的组合物，其中MDM2i选自表1。
41.项36至项40中任一项的组合物，其中MDM2i是与MDM2的p53结合口袋结合的化合物。
42.项36至项41中任一项的组合物，其中MDM2i是与来自表1的Nutlin-3a或MDM2i结合基本上相同的MDM2的p53结合口袋的化合物。
43.项36至项42中任一项的组合物，其中MDM2i是阻止p53和MDM2之间蛋白质-蛋白质相互作用的化合物。
44.项36至项43中任一项的组合物，其中MDM2i是通过诱导p53通路活性抑制细胞增殖的化合物。
45.项36至项44中任一项的组合物，其中MDM2i是异喹啉酮
46.项36至项45中任一项的组合物，其中癌细胞样品选自***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜。
47.项36至项46中任一项的组合物，其中患者基于以下生物标志物的基因表达来选择：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
48.项36、项37或项39至项47中任一项的组合物，用于治疗选择的癌症患者群体中的癌症，其中癌症患者群体选自野生型p53预先选择的癌症患者群体。
49.一种预测癌症患者对人双微体2抑制剂(MDM2i)治疗的敏感性的试剂盒，所述试剂盒包含：i)用于检测来自表2的任一种生物标志物的表达，优选地多于一种，特别地至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种或全部13种选自表2的生物标志物的表达的工具；和ii)如何使用所述试剂盒的说明书。
50.项49的试剂盒，其中生物标志物是MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B或/和AEN。
51.项49或项50的试剂盒，还包含用于检测p53表达的工具。
52.项49至项51的试剂盒的用途，用于项1至项32的任何方法。
在一个方面，本公开提供在含有癌细胞的样品中分析表2中鉴定的至少一种生物标志物的方法，其中至少一种生物标志物的表达指示癌细胞是否将对MDM2i治疗敏感。表达变化的模式可以指示有利患者反应或不利患者反应并且可以基于来自表2的至少一种生物标志物的表达选择或拒绝患者。备选地，表2中的全部生物标志物可以作为单个集合被测定。
在MDM2i治疗后，本公开提供在含有癌细胞的样品中分析表2中鉴定的至少一种生物标志物的方法，其中MDM2i治疗后该生物标志物的表达指示患者仍然对MDM2i治疗敏感。检出至少一种生物标志物的表达水平和/或其改变指示MDM2i敏感性，并且这与患者对治疗的反应相关。备选地，表2中的全部生物标志物可以作为单个集合被测定。表达的模式可以指示患者有利反应或不利反应。
因此，本公开提供一种预测癌症患者对人双微体2抑制剂(MDM2i)治疗的敏感性的方法，所述方法包括：测定从该患者获得的癌样品中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达；并且至少一种生物标志物的基因表达指示该患者对MDM2i治疗敏感。
所述的方法，其中多于一种生物标志物选自表2。
所述的方法，包括测定以下生物标志物的基因表达：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
所述的方法，其中在测定至少一种生物标志物之前测定p53的突变，并且p53突变的存在指示降低的对MDM2i敏感性。
所述的方法，其中癌样品选自***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜。
所述的方法，其中测量至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质。
所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
所述的方法，其中MDM2i选自表1。
一种治疗癌症患者的方法，包括：测定从患者获得的癌样品中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达；至少一种生物标志物的存在指示患者对MDM2i敏感；并且向患者施用MDM2i。
所述的方法，其中多于一种生物标志物选自表2。
所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
所述的方法，其中在测定至少一种生物标志物之前测定p53的突变，并且p53突变的存在指示降低的对MDM2i敏感性。
所述的方法，还包括从施用MDM2i之前的患者获得生物样品，并且将MDM2i未治疗的癌样品与MDM2i治疗的癌样品中来自表2的至少一种生物标志物的差异性基因表达比较，其中增加的基因表达指示持续的患者敏感性。
所述的方法，其中癌样品选自***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜。
所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
所述的方法，其中MDM2i选自表1。
所述的方法，其中MDM2i以治疗有效量施用。
一种预测癌细胞对人双微体2抑制剂(MDM2i)的敏感性的方法，所述方法包括：测定从患者样品获得的癌细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并且选自表2的至少一种生物标志物的基因表达指示癌细胞对MDM2i治疗敏感。
所述的方法，其中多于一种生物标志物选自表2。
所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
所述的方法，其中在测定至少一种生物标志物之前测定p53的突变，并且p53突变的存在指示降低的对MDM2i敏感性。
所述的方法，其中癌样品选自***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜。
所述的方法，其中测量至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质。
所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
所述的方法，其中MDM2i选自表1。
所述的方法，其中MDM2i以治疗有效量施用。
一种确定癌细胞对人双微体2抑制剂(MDM2i)的敏感性的方法，所述方法包括：a)使癌细胞与至少一种MDM2i接触；b)测量与MDM2i接触的细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并且至少一种生物标志物的表达指示对MDM2i的敏感性；和c)比较用至少一种MDM2i处理的癌细胞与未处理或安慰剂处理的癌细胞的细胞增殖；其中与未处理或安慰剂处理的癌细胞相比时，存在处理的癌细胞的减少的细胞增殖。
所述的方法，其中与至少一种MDM2i接触的癌细胞的减少的细胞增殖具有小于1μM的IC50。
所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
所述的方法，其中MDM2i选自表1。
所述的方法，其中在至少两个不同时间点使细胞与MDM2i接触。
所述的方法，其中在步骤a)使细胞与两种不同的MDM2i接触。
所述的方法，其中在相同时间使细胞与两种不同的MDM2i接触。
所述的方法，其中在不同时间点使细胞与两种不同的MDM2i接触。
所述的方法，其中癌细胞选自***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜。
所述的方法，其中测量至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质。
所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
所述的方法，其中在选自以下的时间点重复步骤b)和c)：施用每剂量的MDM2i后的4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3日、1周、1月和几个月。
一种筛选MDM2i候选物的方法，所述方法包括：a)使细胞与MDM2i候选物接触；b)测量与MDM2i候选物接触的细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并且至少一种生物标志物的表达指示对MDM2i的敏感性；和c)将来自与MDM2i候选物接触的细胞的细胞增殖减少与接触取自表1的MDM2i的细胞的细胞增殖和未处理或安慰剂处理的细胞的细胞增殖的减少比较。
所述的方法，其中测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
所述的方法，其中MDM2i候选物增加表2的至少一种生物标志物的基因表达。
所述的方法，其中细胞是选自***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜的癌细胞。
所述的方法，其中测量表2的至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质的表达。
所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
包含MDM2i的组合物，用于治疗选择的癌症患者群体中的癌症，其中癌症患者群体是基于从所述患者获得的癌细胞样品中显示选自表2的至少一种生物标志物的基因表达来选择的。
所述的组合物，其中癌细胞样品选自***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜。
所述的组合物，其中患者基于以下生物标志物的基因表达来选择：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
一种预测癌症患者对人双微体2抑制剂(MDM2i)治疗的敏感性的试剂盒，所述试剂盒包含：
i)用于检测以下生物标志物表达的工具：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN；和ii)如何使用所述试剂盒的说明书。
所述的试剂盒的用途，用于上述列出的任何方法。
定义
除非上下文明确说明，如说明书和权利要求中所用，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数参考。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
所有的数字名称，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围均是近似值，其以0.1的增量(+)或(-)变化。应理解，尽管不总是明确说明，所有数字名称前面具有术语“约”。还应理解，尽管不总是明确说明，本文描述的试剂仅是示例性的并且其等同物为本领域所知。
术语“标志物”或“生物标志物”在本文中互换地使用。生物标志物是核酸或多肽，并且该核酸或多肽的存在、不存在或差异性表达用来确定对任何MDM2i的敏感性。例如，CDKN1A是一种生物标志物。
“MDM2”指介导p53泛素化、允许p53核输出并触发p53降解的E3泛素-蛋白质连接酶。除非另外特别声明，否则，如本文所用的MDM2指人MDM2登录号NM_002392/NP_002383(SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2)。
“p53”指肿瘤抑制蛋白并指人p53(p53登录号：DNA-NM_000546，蛋白质-NP_000537)。
当表2中公开的至少一种生物标志物差异性表达时，细胞对采用MDM2i抑制“敏感”或显示“敏感性”。备选地，当表2中公开的全部生物标志物作为一个集合差异性表达时，细胞对采用MDM2i抑制“敏感”。在一个实施方案中，当MDM2i减少细胞增殖的IC50小于10μM，优选地小于1μM时，细胞“敏感”或显示“敏感性”，或“对敏感治疗”。
“对照细胞”、“对照组织”和“对照样品”指基线对照，或分别指癌细胞、组织或样品，即其对MDM2i不敏感(即MDM2i减少细胞增殖的IC50大于10μM；或当“敏感”用MDM2i减少细胞增殖的IC50小于1μM定义时，则“不敏感“”指MDM2i减少细胞增殖的IC50大于1μM)。
“正常样品“”指非癌组织或细胞。
术语“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用并且指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针，和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多聚体组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。所述术语还指双链和单链分子。除非另外指明或要求，本发明的任何多核苷酸的实施方案包括双链形式和已知的或预测构成双链形式的两条互补的单链形式的每一条链。
“基因”指含至少一个可读框(ORF)的多核苷酸，其在转录和翻译后能编码特定的多肽或蛋白质。能将多核苷酸序列用于鉴定与其相关的基因的较大片段或全长编码序列。分离较大片段序列的方法是本领域技术人员已知的。
“基因表达”或备选地“基因产物”指基因转录和翻译时产生的核酸或氨基酸(例如，肽或多肽)。
术语“多肽”可与术语“蛋白质”互换使用，并在广义上指两个或多个亚基氨基酸(subunit amino acid)的化合物、氨基酸类似物或拟肽。亚基能通过肽键连接。在另一个实施方案中，亚基可以通过其他键，例如酯、醚等连接。
如本文中所用，术语“氨基酸”指天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，以及D和L旋光异构体、氨基酸类似物和拟肽。如果肽链很短，那么通常将三个或三个以上氨基酸的肽称为寡肽。如果肽链很长，那么通常将肽称为多肽或蛋白质。
术语“分离的”意为是自天然状态下与多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段通常相关的组分、细胞组分及其他分离的。例如，分离的多核苷酸与在自然或天然环境，例如在染色体上通常与其相关的3'和5'连续核苷酸分离。本领域技术人员显而易见的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段并不需要“分离”，以将其与其天然存在的对应物区分开来。此外，“浓缩的”、“分离的”或“经稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段可与其天然存在的对应物区分开来，因为与天然存在的对应物相比，每一体积的浓缩物或者分子数在“浓缩的”形式中更多或者在“分离的”形式中更少。在一级序列或者例如糖基化模式上不同于天然存在的对应物的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段并不需要以分离形式存在，因为可以通过一级序列或者备选地，通过另一特征如糖基化模式与其天然存在的对应物区分开来。因此，将非天然存在的多核苷酸提供为不同于分离的天然存在的多核苷酸的单独实施方案。将在细菌细胞中产生的蛋白质提供为区别于从真核细胞分离的天然存在的蛋白质的单独实施方案，其中在天然状态下所述真核细胞产生所述蛋白质。
当在多核苷酸操作的上下文中使用时，“探针”指寡核苷酸，其提供为通过与靶标杂交，检测可能存在于目的样品中的靶标的试剂。通常，探针包含标记或者杂交反应之前或之后标记可以结合的方法。合适的标记包括但不限于，放射性同位素、荧光色素、化学发光化合物、染料和蛋白质包括酶。
“引物”是通常具有游离的3'-OH基的短的多核苷酸，其通过与靶标杂交，与目的样品中可能存在的靶标或“模板”结合，从而促进与靶标互补的多核苷酸的聚合。“聚合酶链反应”(“PCR”)是这样的反应：使用由“上游”和“下游”引物组成的“一对引物”或“一套引物”，聚合的催化剂如DNA聚合酶以及一般热稳定聚合酶，复制组成靶多核苷酸的拷贝。PCR方法是本领域熟知的，并且例如在PCR：A Practical Approach，M.MacPherson等人，IRL Press at Oxford University Press(1991)中教导。产生多核苷酸的复制拷贝的全部过程，例如PCR或基因克隆在本文中总称为“复制”。还可以将引物用作杂交反应，例如DNA或RNA印迹分析中的探针(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989))。
如本文中所用，“表达”指DNA转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。
当将“差异表达”应用于基因时，指从该基因转录和/或翻译的mRNA或者由该基因编码的蛋白质产物的差异产生。与对照细胞的表达水平相比，差异表达基因可以是过表达或者低表达(underexpress)。然而，如本文所用，过表达是基因表达的增加并且一般是在对照对应物细胞或组织中检测到的至少1.25倍或，备选地至少1.5倍或，备选地至少2倍，或备选地至少3倍或备选地，至少4倍表达。如本文所用，低表达是基因表达的降低并且一般低于在对照对应物细胞或组织中检测到的至少1.25倍或备选地，至少1.5倍或备选地，至少2倍或备选地，至少3倍或备选地，至少4倍表达。术语“差异表达的”还指其中在癌细胞或癌组织中检测到表达并且该表达存在，但在对照细胞中不能检测到表达。
由于基因的过量表达或基因拷贝数目的增加可以出现基因的高表达水平。由于负调节物的失调或缺失，基因还可以被翻译至增加的蛋白质水平。。
“基因表达谱”指至少一个生物标志物的表达模式，其在多个样品中重现并且反映那些样品共有的性质，如组织类型、对特定治疗的反应、或细胞中特定生物学过程或通路的激活。此外，基因表达谱区分共有共同性质的样品和没有共同性质的那些样品，这比通过将样品随机分配成两组实现的准确性更高。基因表达谱可以用于预测未知状态的样品是否共有共同的性质。将预测至少一种生物标志物的水平和典型谱之间的一些变异，但是表达水平与典型谱的整体相似性是这样的，在不共有表达谱反映的共同性质的样品中偶然观察到相似性在统计学上是不太可能。
术语“cDNA”指互补DNA，即用酶如逆转录酶将细胞或生物中存在的mRNA分子制备成cDNA。“cDNA”文库是细胞或生物中存在的全部mRNA分子的集合，用逆转录酶将所述mRNA全部转变成cDNA分子，然后***到“载体”(在添加外源DNA后可以继续复制的其他DNA分子)中。用于文库的示例性载体包括噬菌体、感染细菌的病毒，如λ噬菌体。然后可以针对特定的目的cDNA(和由此得到的mRNA)探测文库。
如本文中所用，可互换使用的“固相支持物”或“固相支持体”并不限于特定类型的支持体。相反，本领域普通技术人员可以获得并且已知大量的支持体。固相支持体包括硅胶、树脂、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、塑料珠、氧化铝凝胶、微阵列和芯片。如本文中所用，“固相支持体”还包括合成的抗原呈递基质、细胞和脂质体。基于期望的最终用途和不同方案的适用性，可以选择合适的固相支持体。例如，对于肽合成，固相支持体可以涉及树脂，例如聚苯乙烯(例如，获自Bachem Inc.，Peninsula Laboratories的PAM-r树脂)、polyHIPE(R)TM树脂(获自Aminotech，加拿大)、聚酰胺树脂(获自Peninsula Laboratories)、用聚乙二醇嫁接(graft)的聚苯乙烯树脂(TentaGelRTM，Rapp Polymere，Tubingen，德国)或者聚二甲基丙烯酰胺树脂(获自Milligen/Biosearch，California)。
还可以将多核苷酸与固相支持体连接，用于高通量筛选测定。例如，PCT WO 97/10365公开了高密度寡核苷酸芯片的构建。也参见，美国专利No.5,405,783；5,412,087和5,445,934。使用该方法，在衍生的玻璃表面上合成探针，以形成芯片阵列。将光保护的核苷亚磷酰胺偶联至玻璃表面，经光刻用掩模通过光解选择性去保护，并与第二个所保护的核苷亚磷酰胺反应。重复偶联/去保护过程，直到完成期望的探针。
作为实例，通过使用基因芯片如HG-U133-Plus-2GeneChips来测量信使RNA的水平，可以评估转录活性。因此，在可重复的***中，有可能高通量、实时定量大量目的基因的RNA。
术语“严格杂交条件”指这样的条件，在所述条件下核酸探针可以与其靶序列特异性杂交，而不与其他序列杂交。确定杂交的严格性的条件包括：温度、离子强度和变性剂如甲酰胺的浓度。改变这些因素之一会影响另一因素，并且本领域技术人员理解，可以改变条件以维持期望的严格水平。高度严格杂交的实例是：65℃-68℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或者42℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺(参见Sambrook，上文)。“中等严格”杂交的实例是条件：50℃-65℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或者37℃-50℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和20％甲酰胺。当期望适量的核酸错配时，使用中等严格条件。本领域技术人员理解，洗涤是杂交条件的一部分。例如，洗涤条件可以包括02.X-0.1X SSC/0.1％SDS和42℃-68℃的温度，其中增加温度增加了洗涤条件的严格性。
当在两条单链多核苷酸之间以反向平行构型发生杂交时，称该反应为“退火”，并且将这些多核苷酸描述为“互补”。如果在第一多核苷酸的链之一和第二多核苷酸之间发生杂交，那么双链多核苷酸与另一多核苷酸可以是“互补的”或者“同源的”。根据通常公认的碱基配对规则，按照相对链中期望彼此形成氢键的碱基的比例，可以量化“互补性”或“同源性”(一种多核苷酸与另一多核苷酸互补的程度)。
多核苷酸或多核苷酸区(多肽或多肽区)与另一序列具有“序列同一性”的确定百分比(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)指的是，当比对时，在比较的两个序列中，碱基(或氨基酸)的百分比是相同的。可以使用本领域已知的软件程序，例如Current Protocols in MolecularBiology,Ausubel等人,eds.,(1987)Supplement 30,section 7.7.18,Table7.7.1中描述的那些程序进行这种比对并确定同源性和序列同一性百分比。优选地，将默认参数用于比对。优选的比对程序是BLAST，并使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，且使用以下的默认参数：遗传密码＝标准；过滤＝无；链＝两条；截断＝60；期望值＝10；Matrix＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝高得分；数据库＝非冗余的。
术语“细胞增殖性病症”应当包括表征为异常细胞生长和/或***或者功能丧失的正常生理功能的调节异常。“细胞增殖性病症”的实例包括但不限于，增生、瘤形成、组织转化或多种自身免疫病症，例如以T细胞凋亡的调节异常为特征的那些疾病。
如本文中所用，术语“赘生性细胞”、“肿瘤性疾病”、“瘤形成”、“肿瘤”、“肿瘤细胞”、“癌症”、“癌细胞”(可互换使用)指表现出相对自主生长的细胞，以致它们表现出以细胞增殖控制(即，下调细胞***)的显著丧失为特征的异常生长表型。赘生性细胞可以是恶性的或者良性的。“转移的细胞或组织”指的是细胞可以侵入并破坏邻近的机体结构。
术语“癌症”指癌疾病，例如包括乳腺、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜的癌疾病。
术语“PBMC”指外周血单核细胞，并包括“PBL”-外周血淋巴细胞。
“抑制”肿瘤生长表示当与未与MDM2i化合物接触的肿瘤生长相比，与MDM2i接触时肿瘤细胞生长的降低。可以通过本领域已知的任何方法评估肿瘤细胞生长，其包括但不限于测量肿瘤大小、使用3H-胸苷掺入测定法确定肿瘤细胞是否正在增殖、通过FDG-PET(氟代脱氧葡萄糖正电子成像术)成像测量葡萄糖吸收、或者计数肿瘤细胞。“抑制”肿瘤细胞生长指的是以下状态的任一种或者全部：减缓、延迟和终止肿瘤生长，以及肿瘤缩小。
“组合物”是活性剂和另一载体的组合，所述载体例如惰性的(例如，可检测的试剂或标记)或者有活性的化合物或组合物，如佐剂、稀释剂、结合剂、稳定剂、缓冲液、盐、亲脂溶剂、防腐剂、辅助剂等。载体还可以包含单独的或者组合的按重量或体积为1-99.99％的药物赋形剂和添加剂，例如：可以单独或者组合存在的蛋白质、肽、氨基酸、脂和糖(例如，糖，包括单糖和寡糖；衍生的糖如糖醇、糖醛酸、酯化的糖等；以及多糖或糖聚合物)。糖赋形剂包括例如，单糖如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖如蜜三糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、拉克替醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)和肌醇。
示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可以在缓冲容量中发挥功能的代表性氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。
术语“载体”还包括缓冲剂或pH调整剂；一般地，缓冲剂是由有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐如柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或苯二甲酸的盐；Tris、氨丁三醇盐酸盐(tromethamine hydrochloride)或磷酸盐缓冲液。其他载体包括聚合的赋形剂/高分子添加剂如聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖(聚合的糖)、葡聚糖结合剂(例如，环糊精，如2-羟丙基-正交(quadrature)-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯如TWEEN 20TM和TWEEN 80TM)、脂(例如，磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如，胆固醇)和螯合剂(例如，EDTA)。
如本文中所用，术语“可药用载体”包括任一种标准的可药用载体，例如磷酸缓冲盐水溶液、水和乳剂，如油/水或水/油乳剂，以及多种类型的润湿剂。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂，以及可应用于体内的任何上述载体。载体、稳定剂和佐剂的实例参见Remington’s PharmaceuticalScience.,15th Ed.(Mack Publ.Co.,Easton(1975)和the Physician’s DeskReference,52nd ed.,Medical Economics,Montvale,N.J.(1998)中。
“有效量”是足以实现有益或期望结果的量。可以在一次或多次施用或应用或给药时施用有效量。
“受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，其指脊椎动物，优选地哺乳动物，更优选地人类。哺乳动物包括但不限于，小鼠、猿猴、人、家畜、运动动物和宠物。
如本文所用的MDM2的“抑制剂”减少了p53与MDM2的结合。该抑制可以包括，例如，在它们结合到一起之前减少p53与MDM2的结合，或在它们结合到一起之后减少p53与MDM2的结合，因此释放两个分子。
现在已经将许多基因鉴定为MDM2i的生物标志物。存在本文中和表2中鉴定的一个或多个生物标志物的基因表达的存在或减少或增加可以用来确定患者对任何MDM2i的敏感性，例如，生物标志物的表达指示癌症患者对MDM2i施用敏感并将有利地响应于MDM2i施用。作为另一个例子，在MDM2i治疗后，可以获得患者样品并且可以对样品测定敏感性以发现患者是否仍然对MDM2i治疗敏感。备选地，表2中的全部生物标志物可以作为单个集合被测定。
MDM2抑制剂(MDM2i)是这样的化合物，其作为p53-MDM2结合的抑制剂并且与本发明方法或用途一起是有用的。MDM2i可用于其中指明了p53-MDM2结合抑制的人用途或兽医用途的药物组合物中，例如在***和/或癌细胞生长时。特别地，这类化合物可用于治疗人的癌症，因为这些癌症的进展可能至少部分地依赖于使p53的“看门人”功能无效，例如MDM2过量表达。MDM2i化合物可用于例如治疗癌(例如，***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤癌、肾、软组织肉瘤和胸膜)。一系列示例性MDM2i化合物可见于表1中(参见WO2011076786)。表1中存在的MDM2i化合物属于异喹啉酮类分子。结合MDM2的p53结合口袋、特别与Nutlin-3a结合基本上相同的MDM2的p53结合口袋、或者基本上结合来自表1的示例性MDM2i所结合处的其他MDM2i也可以应用于本发明的方法或用途中。根据本发明实施方案使用的MDM2i可以与表1中描述的MDM2i(即MDM2i(1)和MDM2i(2))或与Nutlin3a在结构上相关(例如，取代的异喹啉酮，或喹唑啉酮)。本文中包括的方法也可以与其他化合物如螺-羟吲哚、咪唑基吲哚和顺-咪唑啉一起使用(参见Shangary等人,Mol.Cancer Ther.20087(6):1533-1542:Furet等人,BioOrg.Med.Chem.Let.2012 22:3498-3502和Carol等人,Pediatr.BloodCancer 2012第1-9页，在纳入期刊之前2012年7月2日在线发表)。如本文所用的MDM2i通过诱导p53通路活性，阻止p53和MDM2之间的蛋白质-蛋白质相互作用和/或抑制细胞增殖。
表1-MDM2i化合物
MDM2i(1)
MDM2i(2)
基因表达的测量
可以通过任何合适的方法检测基因表达，其包括例如检测由基因转录的mRNA的量或者由基因转录出的mRNA逆转录产生的cDNA的量或者由基因编码的多肽或蛋白质的量。基于样品或者改良的高通量分析，可以在样品上进行这些方法。例如，使用AffymetrixTM U133微阵列芯片。
在一个方面，通过与探针杂交来检测和定量基因表达，所述探针与该生物标志物的合适探针特异地杂交。使用本领域已知的方法，还可以将探针与用于高通量筛选测定的固相支持体连接。例如，WO 97/10365和美国专利No.5,405,783、5,412,087和5,445,934公开了可以含有本文中所公开的一个或多个序列的高密度寡核苷酸芯片的构建。使用美国专利No.5,405,783、,412,087和5,445,934中公开的方法，在衍生的玻璃表面合成本发明探针。将光保护的核苷亚磷酰胺偶联至玻璃表面，经光刻用掩模通过光解选择性地去保护，并与第二个所保护的核苷亚磷酰胺反应。重复偶联/去保护过程，直到完成期望的探针。
在一个方面，通过将核酸样品暴露于经探针修饰的芯片，来测定基因的表达水平。例如用荧光标记，优选地在扩增步骤期间标记提取的核酸。在合适的严格水平进行经标记的样品的杂交。使用检测设备定量测量探针-核酸杂交的程度。参见美国专利No.5,578,832和5,631,734。
备选地，使用已知技术可以测定基因拷贝数、转录或翻译中的任一种。例如，可以使用扩增方法如PCR。PCR的一般步骤教导于MacPherson等人，PCR：A Practical Approach,(IRL Press at Oxford University Press(1991))中。然而，用于每一应用反应的PCR条件是由经验确定的。许多参数都影响反应的成功。尤其是退火温度和时间、延伸时间、Mg 2+和/或ATP浓度、pH和引物的相对浓度、模板，以及脱氧核糖核苷酸。扩增后，可以通过琼脂糖凝胶电泳，之后用溴化乙锭染色和紫外照明来显示，检测得到的DNA片段。
在一个实施方案中，通过检测与样品核酸连接的一个或多个标记，来检测杂交的核酸。能通过本领域技术人员熟知的任意的多种方法掺入标记。然而，在一个方面，在制备样品核酸的扩增步骤期间，同时掺入标记。因此，例如使用经标记的引物或经标记的核苷酸进行的聚合酶链反应(PCR)可以提供经标记的扩增产物。在分离的实施方案中，使用经标记的核苷酸(例如，荧光素标记的UTP和/或CTP)进行如上所述的转录扩增，将标记掺入到转录的核酸中。
备选地，可以将标记直接加入到最初的核酸样品(例如，mRNA、多聚A、mRNA、cDNA等)中或者在扩增完成后直接加入到扩增产物中。将标记与核酸连接的方法是本领域技术人员熟知的，并包括例如，通过核酸的激酶的作用进行切口平移或末端标记(例如，使用经标记的RNA)，随后将结合了样品核酸的核酸接头与标记(例如，荧光团)结合(连接)。
适用于本发明的可检测标记包括可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学工具检测的任何组合物。用于本发明的标记包括用经标记的链霉亲和素缀合物染色的生物素、磁珠(例如，DynabeadsTM)、荧光染料(例如，荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和在ELISA中常用的其他酶)，以及热量标记如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)珠。教导此类标记的用途的专利包括美国专利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。
标记的检测是本领域技术人员熟知的。因此，例如可以使用胶片或者闪烁计数器检测放射性标记、可以使用检测发射光的光检测器检测荧光标记。通常通过提供酶和底物，并检测由于酶对底物作用而产生的反应产物来检测酶标记，以及通过简单的可视化颜色标记来检测量热标记。
如在WO 97/10365中所述，可以在杂交之前或之后，将可检测标记加入到靶(样品)核酸中。这些可检测标记在杂交之前直接与靶(样品)核酸连接或者掺入到靶(样品)核酸中。相反，“间接标记”是在杂交后与杂种双链体结合。通常，在杂交后间接标记与结合部分连接，所述结合部分已经与靶核酸连接。例如，可以在杂交之前生物素化靶核酸。杂交后，亲和素缀合的荧光团会结合携带生物素的杂种双链体，其提供的标记是容易检测的。标记核酸和检测经标记的杂交核酸方法的详细综述参见Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，第24卷：Hybridization with Nucleic Acid Probes，P.Tijssened，Elsevier，N.Y.(1993)。
多肽的检测
还可以通过检查表2中列出的生物标志物的至少一种的蛋白质表达或蛋白质产物确定所述生物标志物的表达水平。确定蛋白质水平涉及测量从患者获得的样品中发生在抗体(其选择性识别并结合生物标志物的多肽)上的任何免疫特异性结合的量并将其与对照样品中至少一个生物标志物的免疫特异性结合的量进行比较。当与对照表达比较时，生物标志物的蛋白质表达量可以是增加或减少的。备选地，表2中的全部生物标志物可以作为单个集合被测定。
在本领域中多种技术可以用于蛋白质分析。它们包括但不限于放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射量测定、原位免疫测定(使用例如，胶体金、酶或放射性同位素标记)、western印迹分析、免疫沉淀测定、免疫荧光测定、流式细胞术、免疫组织化学、共聚焦显微镜、酶促测定、表面等离振子共振和PAGE-SDS。
测定生物标志物和MDM2i治疗
一旦已经预测患者对MDM2i敏感，那么向所述患者施用任何MDM2i可以在整个治疗过程中以一次剂量、连续或间歇地实现。确定施用的最有效工具和剂量的方法为本领域技术人员所熟知并且将根据用于治疗的组合物、治疗目的、治疗的靶细胞和治疗的受试者而变化。可以以治疗医师选择的剂量水平和模式进行单次或多次施用。可以根据经验调整合适的剂量制剂和施用活性剂的方法。
可以在MDM2i施用后测定表2中提供的至少一种生物标志物，以确定患者是否仍对MDM2i治疗敏感。此外，可以在单次MDM2i施用后的多个时间点测定至少一种生物标志物。例如，施用MDM2i的初始推注，在首次治疗后的1小时、2小时、3小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3日、1周或1月或几个月测定来自表2的至少一种生物标志物。备选地，表2中的全部生物标志物可以作为单个集合测定。
可以在每次MDM2i施用后测定表2中的至少一种生物标志物，如果存在多次MDM2i施用，则可以在每次施用后测定至少一种生物标志物以确定持续的患者敏感性。患者可能接受多次MDM2i施用并且随后在不同时间点测定生物标志物。例如，治疗过程可以需要施用初始剂量的MDM2i，稍后指定的时间段施用第二剂量，并且在第二剂量后数小时仍施用第三剂量。可以在施用每次剂量的MDM2i后1小时、2小时、3小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3日、1周或1月或几个月测定表2的至少一种生物标志物。备选地，表2中的全部生物标志物可以作为单个集合测定。
在不同时间点测定不同生物标志物也处于本发明的范围内。不受任一项理论约束，由于MDM2i或生物标志物的作用机制，对MDM2i的反应被延迟并且在施用后的任何时间测定来自表2的至少一种生物标志物以确定患者是否仍对MDM2i施用敏感。对于工具、剂量和治疗过程，在每次施用MDM2i后对表2中至少一种生物标志物的测定将提供指导。备选地，表2中的全部生物标志物可以作为单个集合测定。
最后，施用不同MDM2i并随后测定表2中的至少一种生物标志物。在这一实施方案中，选择多于一种MDM2i并施用至患者。随后可以在施用每种不同的MDM2i后测定来自表2的至少一种生物标志物。这种测定也可以在施用不同MDM2i后的多个时间点进行。例如，可以将第一MDM2i施用至患者并且可以在施用后1小时、2小时、3小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3日、1周或1月或几个月测定至少一种生物标志物。随后可以施用第二MDM2i并且可以在施用第二MDM2i后1小时、2小时、3小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3日、1周或1月或几个月再次测定至少一种生物标志物。在每种情况下，表2中的全部生物标志物可以作为单个集合测定。
本发明的另一个方面提供一种评估合适的MDM2i剂量水平的方法，所述方法包括在施用MDM2i后监测表2中鉴定的至少一种基因的差异性表达。例如，在施用MDM2i的第一推注后，分析表2的至少一种生物标志物并且基于这个结果，推荐增加或减少MDM2i剂量。在施用调整的MDM2i剂量后，至少一种生物标志物的分析结果将决定患者是否仍然对调整的剂量敏感并且调整的剂量总是提供预期的益处，例如，抑制肿瘤生长。备选地，表2中的全部生物标志物可以作为单个集合被测定以用于评估对MDM2i剂量敏感性。
可以产生用于评估任何MDM2i的活性的试剂盒。例如，下述试剂盒可以用于评估MDM2i敏感性，所述试剂盒包含用于PCR或用于微阵列杂交的用于表2中所列生物标志物的核酸引物。备选地，下述试剂盒将可用于测定MDM2i敏感性，所述试剂盒配有针对表2中所列的至少一种生物标志物的抗体。
本领域熟知癌症可以变得耐受化疗治疗，特别地当这种治疗延长时。可以在延长任何化疗药治疗后测定表2中至少一种生物标志物的差异性表达以确定该癌症是否对MDM2i敏感。例如，激酶抑制剂如将强烈地抑制特定激酶，但是还可以微弱抑制其他激酶。还存在其他MDM2i，例如，Nutlin家族化合物。如果患者已经事先用另一种化疗药或另一种MDM2i治疗过，则对患者而言有用的信息是测定表2中的至少一种生物标志物以确定该肿瘤是否对MDM2i敏感。如果该癌症进入缓解并且随后再生长或已经转移至不同部位，则这个测定法可能对患者特别有益。
筛选MDM2抑制剂
可以测定表2中列出的至少一种生物标志物以筛选其他MDM2i。这种方法包括测定细胞的来自表2的至少一种生物标志物，这预测该细胞是否对MDM2i候选抑制剂敏感，该细胞随后与候选MDM2i接触并且比较处理细胞与接触已知MDM2i的敏感细胞的IC50。例如，对于据预测对任何MDM2i敏感的细胞(如通过表2中至少一种生物标志物的差异性表达所确定的)，候选MDM2i将具有IC50≤3μM。可以通过先前描述的方法(例如，PCR或微阵列分析)，测量来自表2的至少一种生物标志物表达。备选地，表2中的全部生物标志物可以作为单个集合被测定。
表2
基因名称 登录号 SEQ ID NO.(核苷酸/蛋白质)
MDM2 NM_002392/NP_002383 SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2
CDKN1A NM_000389/NP_000380 SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4
ZMAT3 NM_022470/NP_071915 SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6
DDB2 NM_000107/NP_000098 SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8
FDXR NM_004110/NP_004101 SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10
RPS27L NM_015920/NP_057004 SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12
BAX NM_004324/NP_004315 SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14
RRM2B NM_015713/NP_056528 SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16
SESN1 NM_014454/NP_055269 SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18
CCNG1 NM_004060/NP_004051 SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20
XPC NM_004628/NP_004619 SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22
TNFRSF10B NM_003842/NP_003833 SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24
AEN NM_022767/NP_073604 SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26
实施例
实施例1：在生物化学测定和细胞测定中MDM2i(1)和MDM2i(2)均是 同等有力的p53-MDM2抑制剂。
用于IC50确定的TR-FRET测定法：标准测定条件包括白色384孔板(Greiner Bio-One：Frickenhausen，德国)中含有125mM NaCl，0.001％Novexin，0.01％明胶，0.2％Pluronic F-127，1mM DTT和1.7％终浓度DMSO的PBS缓冲液中的60μL总体积。将MDM2i(1)和MDM2i(2)均按不同浓度添加至0.1nM生物素化MDM2(人MDM2氨基酸2-188，内部制备物)、0.1nM铕标记的链霉亲和素(Perkin Elmer：Waltham，MA，美国)和10nM Cy5-p53肽(Cy5-p53氨基酸18-26，内部制备物)。在室温温育15分钟后，在GeniosPro读数仪(Tecan：Mannedorf，德国)上测量样品。从按时间解析模式测量的两个区分性荧光信号的原始数据计算FRET测定读数(荧光665nm/荧光620nm x1000)。使用(Fit模型#205)，通过曲线拟合计算IC50值。该数据在图1A中显示。
确定结合速率常数(Kon,Koff)：GeniosPro读数仪(Tecan：Mannedorf，德国)的快速混合工具用来研究快速结合动力学(单孔模式)。将含有在50μl测定缓冲液中的抑制剂和20nM Cy5标记的p53肽的微量平板置于读数仪中。在25℃平衡10分钟后，通过按475μl/s注射50μl含有0.2nM生物素化MDM2和0.2nM铕-链霉亲和素的缓冲液，启动结合反应。在665nM和在多个时间间隔测量荧光，第一次测量在注射后0.6秒。在不存在抑制剂的情况下，Cy5荧光在0.6秒时已经最大并且保持稳定至少15分钟。在MDM2i(1)和MDM2i(2)存在下，荧光缓慢减少并且进行测量直至实现稳态。将对照荧光作为含有1％DMSO的孔和含有10μM Nutlin-3作为对照的孔之间的差异取得。将每个时间点处的抑制效果计算为相应对照的百分数。将不同浓度的抑制剂存在下获得的进程曲线合并并按整体拟合。基于以下各个等式，使用设计成获得精确Kon值和Koff值的新拟合方法学，用实施非线性回归：
Fit＝[Imin+((Imax-(((Ki^nH)*Imax)/((y^nH)+(Ki^nH))))*(1-exp(((-1)*(koff+((y*koff)/Ki)))*x)))]和
Fit＝[Imin+((Imax-(((Ki^nH)*Imax)/((y^nH)+(Ki^nH))))*(1-exp(((-1)*(kon*(Ki+y)))*x)))]，其中Ki表示抑制常数，Imin表示最小抑制作用(以％计)，Imax表示最大抑制作用(以％计)，nH表示Hill系数，x表示时间并且y表示抑制剂浓度)。该数据在图1A中显示。
细胞增殖抑制和GRIP p53易位测定法：使用基于DNA相互作用性荧光染料YOPRO的标准增殖测定法(Invitrogen：Lucern，瑞士)，在p53野生型细胞系(SJSA-1和HCT116p53wt/wt细胞)和p53突变细胞系(SAOS2和HCT116p53-/-细胞)中测量MDM2i(1)和MDM2i(2)对细胞生长和活力丧失的影响。简而言之，将细胞铺种在96孔板中在37℃过夜并用渐增浓度的MDM2i(1)或MDM2i(2)处理72小时。随后使用DNA相互作用性荧光染料YOPRO，根据制造商的说明书确定每个孔中的细胞浓度，并且使用Gemini-EM标准平板读数仪(Molecular Devices：Sunnyvale,CA,USA)测量荧光信号。使用(Fit模型#201)，通过曲线拟合计算IC50值，并且该数据在图1A中显示。
机理性p53-MDM2再分布测定法(GRIP测定法)用来直接监测细胞中化合物调节p53-MDM2蛋白质-蛋白质相互作用的能力。在这种完全工程化的测定法中，p53蛋白用荧光GFP-标记加标签并且与细胞的细胞质中锚定的MDM2蛋白结合。用特定化合物处理细胞造成这两种蛋白质之间的相互作用解离和释放的p53-GFP蛋白从细胞质易位至胞核。使用ArrayScan-VTi(Cellomics)，使用高容量成像平台检测并定量这种效应，跟踪随时间推移的荧光信号(参见图1B，GRIP p53易位测定法)。
总之，使用体外测定法和细胞测定法，图1A和图1B中展示的结果显示，MDM2i(1)和MDM2i(2)均是可比较的体外强力p53-MDM2蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂，抑制p53-MDM2蛋白质-蛋白质相互作用，以p53-依赖性方式阻碍肿瘤细胞增殖，并且诱导p53积累并易位至胞核。该数据在图1B中显示；注意，在细胞系之间存在IC50的巨大不一致性。这还表明两个细胞系之间存在对MDM2i敏感性的差异，并且因此敏感性的确定可以用于确定哪些患者接受治疗剂。
实施例2：p53突变状态与细胞系中的MDM2i化学敏感性相关
通过Fisher’s Exact Test测试p53突变与一组癌相关细胞系中MDM2i(2)化学敏感性的关联性。细胞系组是Cancer Cell LineEncyclopedia(CCLE)创制涵盖的一个组(Barretina J.,Caponigro G.,Stransky N.,Venkatesan K.等人,The Cancer Cell Line Encyclopediaenables predictive modeling of anticancer drug sensitivity.Nature483:603-7,2012)。对CCLE细胞系实施详细的基因组学、遗传学和药理学表征。
CCLE细胞系中的p53突变状态取自从Sanger中心COSMIC数据和内部来源(包括Exome Capture Sequencing)编纂的基因水平的遗传改变，例如，点突变、***、缺失和复合遗传改变，的数据来源。这包括来自CCLE细胞系范围内大约1,600个癌相关基因的数据。对CCLE组的分析揭示了含有突变p53的244个细胞系和表达野生型p53的112个细胞系(p53登录号：DNA-NM_000546，蛋白质-NP_000537)。
从CCLE细胞系的药理学表征确定MDM2i(2)化学敏感性。根据MDM2i(2)敏感性，将细胞系分成两个组。一个组含有对MDM2i(2)化合物敏感的细胞系，而另一个组涵盖化学上对MDM2i(2))化合物不敏感的那些细胞系。这类分层产生分别具有47个敏感细胞系和309个不敏感细胞系的两个组。从这类体外化学敏感性数据中，估计细胞将对MDM2i处理敏感的预测值是13％。
p53突变与敏感组关联性的统计检验显示p53突变(mt)和MDM2i(2)化学敏感性之间的关联性(图2)。图2中的mt组显示p53突变型CCLE细胞系的MDM2i(2)敏感性曲线，野生型(wt)组显示p53野生型CCLE细胞系的MDM2i(2)敏感性曲线。Amax被定义为最大效果水平(针对MG132(如上文提到的CCLE出版物中所述作为参照物使用的蛋白酶体抑制剂)校准的在最高的测试MDM2i(2)浓度时的抑制作用)，并且IC50定义为MDM2i(2)反应相对于参照抑制剂达到-50的绝对抑制作用时的μM浓度。
细胞系计数按MDM2i(2)化学敏感性和p53突变状态，以及相关的统计划分。数据还显示为具有相关统计的列联表。
该数据表明如果细胞系的p53状态是野生型，则该细胞系更可能显示对MDM2i(2)敏感。实际上，发现p53突变的大部分细胞系对该化合物不敏感，而超过三分之二的p53野生型细胞系敏感。
从该数据，我们可以得出结论，p53野生型基因型是MDM2i敏感性的首个指标，并且因此它是待考虑用于选择可响应于MDM2i的癌症患者的第一阶层生物标志物。
实施例3：从基因组数据和临床意义预测细胞系对MDM2i的化学敏 感性。
比较通过MDM2i(2)处理产生的两个细胞系敏感组，旨在任何MDM2i治疗之前鉴定出区分敏感细胞系与不敏感细胞系的生物标志物。这类生物标志物用来预测任何MDM2i治疗的敏感性。分析的生物标志物是以下类型：1)基因水平表达值，用HG-U133plus 2阵列通过AffymetrixGeneChipTM技术生成，根据RMA归一化方法总结；2)基因水平染色体拷贝数值，用Affymetrix SNP6.0技术(Affymetrix Santa Clara，CA，美国)获得并使用Affymetrix apt软件处理，并且表示为log2转换的相对于HapMap参照正常样品集合的比例；3)基因水平遗传改变或突变，如实施例2中上文所述；4)通路水平表达值，通过标准化平均方案在有助于该通路的基因范围内总结通路表达水平，如GeneGo知识库中提到；5)细胞系谱系(细胞系组织来源)；6)基因水平肿瘤抑制基因状态，通过整合遗传改变、拷贝数和表达信息总结选定肿瘤抑制基因的活化状态。这类基因组数据在CCLE细胞系基因组学和遗传学表征的背景下生成，并涵盖总计约45,000个基因组特征。
根据特征类型，将Wilcoxon符号秩检验或Fisher精确检验用来比较两个细胞系组的基因组特征。为了在敏感细胞系组和不敏感细胞系组之间进行差异谱评价，具有连续值的特征(基因表达和拷贝数、通路表达特征)接受Wilcoxon符号秩检验，具有离散值的那些特征(遗传改变、肿瘤抑制子状态和谱系特征)接受Fisher精确检验。区分敏感细胞系组与不敏感细胞系组的显著特征是通过控制错误发现率的p-值截断值的那些特征。与p-值限量无关，还要求每个特征类型的最小或最大特征数目。为了使得特征之间高度相关性对特征选择步骤的影响最小化，将特征数据在统计检验作之前聚类作为预处理步骤。使用Frey's和Dueck's Affinity Propagation法(Clustering by Passing Messages Between Data Points.Frey B.和Dueck D.Science 315:972-6,2007)在特征类型水平上进行该步骤，并且恢复代表最大变异性的特征集合。
对于旨在生物标志物鉴定的这种双类别比较，将细胞系敏感组或类别定义如下：具有47个敏感细胞系的敏感组和具有204个不敏感细胞系的不敏感组。构成这个不敏感组的204个细胞系是来自实施例2中提到的309个不敏感细胞系集合的最不敏感细胞系。这个特征选择步骤产生总计约200个显著特征，具有区分敏感细胞系组与不敏感细胞系组的明显差异谱，并且因此具有被考虑为标志物的所需特性来预测样品对MDM2i的化学敏感性。如上文实施例2中所述，相关生物标志物是p53突变状态本身。特征选择步骤的统计结果(p-值：1.17E-21)证实它在预测对MDM2i敏感性中的作用。另外，与p53状态(0.024)相关的比值比显示在MDM2i不敏感细胞系中更多呈现p53突变。仍然值得注意并且仍然根据特征选择步骤的统计结果，发现大多数预测性生物标志物是p53转录性靶基因的子集。这些在表2/图3中显示。它们的倍数改变表示，这些生物标志物转录物在MDM2i敏感细胞系群体中更多表达，如图3中所显示。这可能指示对MDM2i敏感的细胞系中任何治疗之前预先存在的p53功能活性的水平。
图4中验证了表2/图3中的生物标志物反映MDM2i敏感细胞中的功能性p53通路。在图4中，细胞在细胞裂解之前已经用渐增浓度的MDM2i(1)处理4小时。使用含有50mM Tris-HCl pH7.5、120mM NaCl、1mM EDTA、6mM EGTA pH8.5、1％NP-40、20mM NaF、1mM PMSF和0.5mMNa-Vanadat的细胞裂解缓冲液，制备完整细胞裂解物，将蛋白质在NuPAGE 4-12％Bis-Tris Gel(Invitrogen#NP0322BOX，Lucerne；瑞士)上分离，使用半干式印迹***以1.5mA/cm2膜持续2小时转移到硝酸纤维素膜BA85(Whatman#10401261：Piscataway，NJ，美国)上，并且用抗磷酸-p53(Ser15)(1/1000；Cell Signaling Technology#9284:Beverly，MA，美国)兔多克隆抗体或抗-p53(Ab-6)小鼠单克隆抗体(Pantropic，克隆DO-1)(1/1000；Calbiochem#OP43San Diego，CA，美国)、抗-MDM2小鼠单克隆抗体(Ab-1，克隆IF2)(1/1000；Calbiochem#OP46)，抗-p21WAF1小鼠单克隆抗体(Ab-1，克隆EA10)(1/500；Calbiochem#OP64：San Diego，CA，美国)或抗-α-微管蛋白小鼠单克隆抗体(Sigma#T5168:St.Louis，MO，美国)，如所示免疫印迹。如图4中所示，渐增浓度的MDM2i(1)引起p53蛋白水平稳定，C3A细胞和COLO792细胞中磷酸p53均无显著增加。有趣地，MDM2i(1)处理还在C3A敏感细胞中但不在COLO-792不敏感细胞系中引起p53靶基因p21(CDKN1A)和MDM2二者的强烈从头表达。总之，该数据表明对MDM2i抑制剂的敏感性与内在有功能的p53通路的存在直接相关，其中表2/图3中的生物标志物，作为集合一起或者单独取得，在治疗之前直接指向p53通路功能性，并且表明这些生物标志物具有预测与p53作用机制相关的患者敏感性的强大能力。
使用明显基因组特征作为两个MDM2i化学敏感组或类别的朴素贝叶斯概率建模的基础特征。建模步骤的目的是推导以某个可信度预测未知样品的患者反应(敏感或不敏感)的分类方案或分类器。通过以下定义该预测模型：在分层为上文提到的两个敏感性类别的整个化学表征的CCLE细胞系群体范围内训练朴素贝叶斯算法。通过用来训练该模型的数据的5次重复5倍交叉验证，评价分类器的表现。模型表现用以下类别水平量值总结：灵敏度、特异性、正预测值和负预测值。使用敏感类别作为灵敏度和正预测值计算的参照物。朴素贝叶斯算法的默认输出是待归属至一个类别或另一个类别的每份预测样品的评分或概率。定义概率阈值以将概率评分转化成敏感类别水平或不敏感类别水平预测。将概率阈值定义为使对全部预测样品范围内计算的灵敏度和特异性最大化的概率。在实施例2中参考的CCLE出版物中更详细地描述整个和几乎相同的流程。
为了说明可以从存在于表2中的至少一种生物标志物和备选地从作为集合的表2中生物标志物比从单独p53突变状态或从约200个基因的整体预测特征集合实现更好的预测力，训练来自这些特征集合中每一个特征的朴素贝叶斯模型，并且如上文提到那样，通过交叉验证评估它们的表现，并比较(图5)。图5显示存在于表2中的选定生物标志物表现胜过p53突变状态和约200个显著特征的更大组，并且在预测患者对MDM2i的反应性方面提供明显改善。当通过正预测值(PPV)评价表现时，这是特别惊人的。
正预测值(PPV)76％表明76％的预测敏感细胞系将对MDM2i治疗敏感。作为对临床环境的外推，PPV76％还表明76％从肿瘤活组织检查样品预测为对MDM2i(2)敏感的癌症患者将显示MDM2i(2)治疗时的临床反应。将使用表2中的生物标志物并与朴素贝叶斯预测模型关联的通过患者分层的临床反应富集与患者事先不分层情况下的基线临床反应率比较。从化学敏感性数据估计的基线临床反应率是19％。因此以临床观点看，表2的生物标志物在预测的敏感患者群体中具有清晰的临床反应增加。预测的这种增加比测定仅p53状态或初始选择的全部大约200个基因组特征更大和更特异。可以在图5中见到这点，其中“全部200个生物标志物”特征棒是初始选择的大约200个基因组特征的PPV。对“全部200个生物标志物”特征报道的PPV是59％。使用单独p53的PPV是56％(图5)。表2中公开的生物标志物集合的PPV是76％(“表2选择的生物标志物”)。这是个令人惊讶的结果，因为一般而言，200个基因组特征的较大数据集合将提供更多数据点并且对预测MDM2i敏感性提供更多深刻认识。但是，情况并非如此，因为表2中的生物标志物，作为集合看待时，提供17％的预测值增加。这在在临床是重要的，因为现在将预测100位患者中的17位额外患者接受正确治疗。
为了检验表2生物标志物的预测值，在增殖测定法中对先前在作为CCLE项目构成部分的药理学表征中未检查的52个细胞系测定它们对MDM2i的敏感性。简而言之，将细胞铺种在96孔板中在37℃过夜并用渐增浓度的MDM2i处理72小时。随后使用CellTiter-Glo Luminescent CellViability(Promega目录号G7571/2/3：Madison WI，美国)，根据制造商说明书确定每个孔中的细胞浓度，并且使用SYNERGY HT平板读数仪(BioTek：Winooski，VT，USA)测量发光信号。使用通过曲线拟合计算IC50值(图6)。通过比较在如实施例1中所述的细胞增殖抑制测定法中检验的全部细胞的观察IC50，确定细胞系对MDM2i的敏感性。对于MDM2i(1)和MDM2i(2)，均在IC50≤3μM确定敏感性的截断值。使用如上文所述的预测模型，预测每个细胞系的敏感性，以证实图5中公开的值。细胞系来自多种肿瘤。例如黑色素瘤(COLO-829、COLO-849、IGR-1、MEL-JUSO、SK-MEL-1、SK-MEL-31、UACC-62、UACC-257)、白血病(BV173、EOL-1、GDM-1、HuNS1、L-540、MV-4-11、OCI-LY3、RS4:11、SUP-B15、HDLM2、JM1)、乳腺癌(CAL51、EFM-192、HCC202)、胰腺癌(DAN-G)、肝癌(JHH-5)和肺癌(RERF-LCK-KJ)。这种测定法用表2中公开的全部生物标志物作为单个集合进行。总体上，预测52个细胞系中36个细胞系对MDM2i敏感，并且这36个细胞系当中24个细胞系敏感，产生正预测值66％，再次预测值(PPV)明显增加胜过仅测定p53。对于筛选不反应的细胞而言，预测52个细胞系中16个细胞系对p53-MDM2抑制剂不敏感，并且发现这16个细胞系中13个细胞系确实不敏感，产生明显负预测值(NPV)81％。总体上，这些数据与图5中描述的预测模型表现相似。对不相关性细胞系的实际体外检验允许MDM2i化学敏感性预测模型的检验，因此验证了表2中公开的生物标志物。
实施例4：MDM2i治疗在体内抑制肿瘤生长抑制，这与肿瘤中 p21(CDKN1A)mRNA和蛋白质水平的剂量依赖性增加相关。
为了进一步验证图3中公开的预测性生物标志物，直接注射来自人原代样品或来自细胞系的体内人异种移植模型并且将其在小鼠中皮下培育肿瘤并且随后评估MDM2i敏感性。允许全部动物适应4天并且圈养在病原体受控的环境中(5只小鼠/III型笼具)，随意摄取食物和饮水。用应答器确定动物。研究根据KantonalesBasel-Stadt颁发的允许编号1975所包括的流程进行并严格遵守Tierschutzgesetz和theTierschutzverordnung。通过在100μl PBS(不含Ca2+和Mg2+)中浓缩3.0×106个SJSA-1骨肉瘤细胞并在Harlan裸鼠右侧腹注射，诱导皮下肿瘤。12-14天细胞注射后开始施用MDM2i。在每次施用之前即刻制备MDM2i。将MDM2i化合物溶解于0.5％HPMC(羟丙基甲基纤维素)中并且以25、50或100mg/kg每日一次(q24h)注射。每周3次测量肿瘤体积(TVol)，从卡尺测量确定(使用公式l×w×h×π/6)。通过肿瘤体积变化(终点减去初始值，以mm3计)，将肿瘤反应定量为T/C，即在肿瘤消退情况下，肿瘤反应由初始TVol即的消退百分数定量。每周3次测量小鼠体重(BW)，允许在相对于开始治疗日(第0日)的任何特定时间点计算BW两种百分数的变化(Δ％BW)。如图7A中所示，为期10天用MDM2i(1)治疗SJSA-1异种移植肿瘤导致剂量依赖性肿瘤生长抑制，在a24h 25mg/kg具有50％的明显T/C和在q24h 50mg/kg具有3％的明显T/C(静止)。在q24h 100mg/kg持续10日，MDM2i(1)治疗引起明显肿瘤消退65％(图7B)。在q24h方案，全部剂量均耐受良好，如通过随时间推移的平均体重曲线所示。
MDM2i(1)的抗肿瘤活性与肿瘤中p21(CDKN1A)mRNA水平的显著剂量依赖性诱导相关(图7C)。简而言之，根据制造商的说明书，使用(79654，Qiagen：Valencia CA，美国)和RNeasy Mini(74106，Qiagen：Valencia CA，美国)，从细胞沉淀物纯化总RNA，例外是不进行DNA消化。总RNA用50μL无RNA酶水洗脱。使用分光光度计ND-1000(Wilmington DE，美国)对总RNA定量。使用一步法RT qPCR Master Mix Plus(RT-QPRT-032X,Eurogentec:Seraing,比利时)，连同对照引物和人p21(CDKN1A)(Hs00355782_m1，Applied Biosystems:Carlsbad CA，美国)引物或小鼠p21(CDKN1A)(Mm00432448_m1，Applied Biosystems:Carlsbad CA，美国)引物，即TaqMan基因表达试剂盒测定法(20x探针染料FAMTM(或VIC)-TAMRA(或MGB)；Applied Biosystems:Carlsbad CA,美国)，每份样品一式三份建立qRT-PCR(定量性逆转录酶聚合酶链反应)。更具体地，在冰上针对如下终浓度制备主混合物：1xMaster Mix缓冲液、1x引物溶液和1xEuroscript逆转录酶，合并H2O，总体积：8μl/孔。MicroAmp Optical 384孔反应板(4309849，Applied Biosystems)固定在试验台上，并将2μLmRNA(浓度：10或20ng/μl)(或对于阴性对照，水)一式三份吸入，随后添加8μl/孔的主混合物。随后将平板用MicroAmp Optical Adhesive膜试剂盒(4313663，Applied Biosystems：Carlsbad CA，美国)覆盖，在4℃以1000转/分钟离心5分钟并置于7900HT Fast Real-Time PCR***(AppliedBiosystems：Carlsbad CA,USA)。程序以如下方式运行：一个循环48℃30分钟，一个循环95℃10分钟，和交替95℃15秒和60℃1分钟的最终40个循环。确定循环次数(CT)，计算2-CT值，并且通过除以从GAPDH对照获得的2-CT值使数值归一化。计算相对于对照(即DMSO处理的或溶媒处理的动物)的倍数增加并且以柱状图作图。
此外，MDM2i(1)的抗肿瘤活性与肿瘤中p21(CDKN1A)蛋白水平的显著剂量依赖性诱导相关，如通过免疫组织化学判定(图8)。采集SJSA-1异种移植肿瘤并且从肿瘤中部取出3-4mm切片，转移至预标记的histo盒并在在4℃预冷却的中性缓冲***(NBF)10％(v/v)(pH 6.8-7.2)(J.T.Baker,Winter Garden,FL，美国)中浸没固定。肿瘤随后在室温固定24小时，接着在TPC15Duo(Tissue Processing Center，Medite)中处理以便石蜡化。随后，将肿瘤切片包埋于石蜡中并且在轮转切片机(MikromInternational AG，瑞士)上从每个石蜡块切出几个3μm厚的切片，在48℃水浴中展开，在玻璃载片(SuperFrost Plus，Thermo Scientific：WalthamMA，美国)上封装，并且在烘箱中在37℃干燥过夜或在60℃干燥30分钟。处理干的组织切片用于免疫组织化学(IHC)染色。已经使用1:50稀释的来自Dako(目录号M7202Dako：Carpenteria CA，美国)的小鼠单克隆抗体克隆SX118进行p21(CDKN1A)免疫组织化学。已经使用N-HistofineMousestain Kit(Nichirei Bioscience Inc，日本)联合DABMapKit色原***，省略SA-HRP溶液(Ventana/Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，德国)，在Ventana Discovery XT自动化免疫染色仪上进行免疫组织化学。通过使用Cell Conditioning(Ventana/RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，德国)以轻微(95℃8分钟+100℃20分钟)条件进行抗原提取。遵循制造商说明书，通过在第一抗体温育之前和之后使用来自N-Histofine Mousetain(Nichirei Bioscience Inc，日本)的阻断试剂A和B，阻断小鼠交叉反应性。手动应用Dako抗体稀释剂(AbD)中处于所需稀释的第一抗体，接着在环境温度温育1小时。相应阴性对照仅与AbD温育。随后使用来自N-HistofineMousestain(Nichirei)的标记的聚合物***Simple Stain Mouse MAX PO(M)和来自DABMap试剂盒(Ventana/Roche Diagnostics)的DAB底物，对切片染色。使用苏木精(Ventana/Roche Diagnostics)进行切片复染。在自动化染色运行后，载玻片在梯度系列的乙醇中脱水，在二甲苯中透化并且用封装基质封装。
实施例5：预测人原发肿瘤小鼠异种移植模型中和人原发肿瘤中的 MDM2i(2)敏感性
表2中的生物标志物与朴素贝叶斯预测模型联合使用以预测人原发肿瘤样品和异种移植模型集合中的MDM2i敏感性，以说明生物标志物及其相关的预测力是否在体外细胞系体系外部存在。
使用表2的全部生物标志物的基因水平表达值作为朴素贝叶斯概率建模的特征基础。它们如实施例3中所述那样生成，唯一差异在RMA总结步骤中，其中归一化靶向针对正常样品和肿瘤样品的参照集合。如实施例3中所述那样实施朴素贝叶斯建模。
为敏感性预测所提交的人原发肿瘤样品和异种移植模型是分别具有约18,000份样品和503样品的集合，对所述集合，可获得采用Affymetrix技术生成的基因表达谱(Human Genome U133plus 2.0阵列)。该集合的样品用样本本体的受控词汇表内部注释，所述词汇表包括病理学、组织学和原发性部位。相关的基因芯片数据从公共来源和内部来源采集，并且如上文所述那样针对相同的参照样品集合就一致性而归一化。
来自该集合的预测MDM2i敏感的样品的比例与如借助上文实施例3中描述的MDM2i(2)化学敏感性数据给出的敏感细胞系的比例比较。期望良好相关性以表明图3中公开的生物标志物在人原发肿瘤样品中预测MDM2i敏感性的能力。为清晰起见以及为了潜在鉴定其中敏感细胞系比例在细胞系化学敏感性数据中低估的谱系，将敏感预测比率与敏感细胞系比率比较用组织来源分开。
图9(左小图)显示来自该集合的预测敏感的人原发肿瘤样品和来自MDM2i化学敏感性数据的敏感细胞系之间的相关性。它表明表2中公开的生物标志物及其在体外细胞系样品外部预测敏感性的用途是有效的。它还表明表2中公开的生物标志物可以用来预测人原发肿瘤样品中的MDM2i化学敏感性。它揭示了先前未曾研究过的新肿瘤适应证并且证实本研究中发现的结果。新适应证，例如，肝(肝细胞癌)和肾(肾细胞癌)，潜在代表用表2中公开的生物标志物就MDM2i治疗被临床前和临床评价的新疾病适应证。图9A还表明，表2中公开的生物标志物可以用来预测原发性黑色素瘤肿瘤中的MDM2i化学敏感性，与本研究中发现的结果相符。
图9(右小图)显示在预测敏感的人原发肿瘤样品的分数和原发肿瘤异种移植物集合中预测敏感的比率之间的相关性。肿瘤样品/异种移植物/细胞系按谱系组织。两幅小图中的短划线是身份系。它显示，从体内小鼠异种移植模型中产生的数据与来自其它体内采集样品的数据相符，在所述模型中可以研究并验证例举的标签和相关的预测分类器。它证实了小鼠异种移植模型作为材料源来验证基于p53下游靶基因的分类器方法来在体内前临床环境下预测癌症患者和疾病适应证的临床结果。
实施例6：单个生物标志物和鉴定的13个生物标志物的任何组合预测 对MDM2i的化学敏感性
与朴素贝叶斯预测模型框架联合使用时，表2中所示的13个生物标志物在两种体外***中并在体内预测MDM2i敏感性，如实施例3和5中示例。为了研究这13个生物标志物的子集是否还将预测MDM2i敏感性，使用单个生物标志物和它们的多个组合作为预测模型的特征基础。随后，将它们的预测表现与用全部13种生物标志物或用作为MDM2i敏感性预测的预测特征使用时p53突变状态实现的预测表现比较。
在实施例6中考虑p53突变状态的两个事例。这两个事例从如实施例2中提到的CCLE细胞系的Exome Capture Sequencing数据定义，并意在代替临床环境，所述临床环境中对p53基因测序用于患者分层或临床注释。
p53突变状态的第一事例从跨越p53外显子5至外显子8的突变限定。外显子5至外显子8涵盖p53的DNA结合结构域，其含有大部分所描述的p53突变，并且是临床环境下共同靶向用于测序的p53外显子(例如，Rapid sequencing of the p53gene with a new automated DNA sequencer.Bharaj B.,Angelopoulou K.和Diamandis E.,Clinical Chemistry 44:71397-1403,1998)。第二事例考虑主要p53转录物的完整可读框，并且因此从全部编码性外显子突变限定。
多种生物标志物组合可以从表2中公开的13个生物标志物列表产生。来自2个至12个生物标志物的全部组合类型作为MDM2i化学敏感性预测模型的特征基础评价。当对于给定组合类型存在多于50种不同组合时，所评价的组合的数目限于50。每种组合类型中全部50种组合都是随机挑选的。
大体上如实施例3中所述训练并评价与上述特征集合相关的全部预测模型(单个生物标志物、2个至12个生物标志物组合，p53突变状态事例)。不同于实施例3的如下：训练用数据略微大于实施例3中所用的数据并涵盖264个细胞系(47个细胞系来自敏感类别，并且217细胞系来自不敏感类别)；在5倍交叉验证方案中在朴素贝叶斯概率建模时使用p-值阈值0.5以将细胞系认为敏感或不敏感。另外，通过交叉验证过程产生的全部样本层随机选择并彼此独立。图10至图12中显示组合预测模型的表现和它们与p53突变状态事例和13个生物标志物模型的比较结果。
图10描述通过单个生物标志物模型、组合模型、13个生物标志物模型和p53突变模型实现的正预测值(PPV)。PPV是在临床试验中采用所考虑的建模过程时基于患者选择期望的临床疗效的评估值。为了方便，当每个特征集合存在多于5个作图数据点时，将数据绘制为箱须图。
图10显示来自少到两个生物标志物和三个生物标志物的组合分别优于外显子5至8p53突变(“ex5to8mt”)特征和全外显子p53突变特征(“allExMt”)。事实上，须末端限定的上限和下限涵盖约99％的数据点，假定数据正态分布。因此，大部分评价的2-生物标志物组合和3-生物标志物组合显示比通过p53突变状态事例实现的PPV更高的PPV。另外，即使全部单基因模型不优于两个p53突变事例，但它们大部分(约75％，箱加上须)优于p53全外显子突变。值得注意地，全部单基因模型产生高于所考虑样品群体中敏感细胞系比例(约18％)的PPV，这表明从少至一个生物标志物中建立的MDM2i敏感性预测模型能够在敏感样品中富集选择的样品。
另外，在这个模型练***均化的PPV是48％。它显著低于实施例3中公开的p53突变PPV(56％)。这表示，在其中p53外显子5至8测序用于患者选择(这是常见实践)的临床环境下，例举的基于13个生物标志物的患者选择具有比从实施例3所期望的甚至更高的净增值。
图11显示由所评价的几个模型实现的特异性。就图10中的PPV而言，从少至2个生物标志物产生的每种组合足以实现比从仅突变事例获得的特异性更高的特异性。当特异性用来监测模型表现时，全部单个生物标志物模型优于突变。
图12显示灵敏度。灵敏度也称作回应(recall)，并且是选择患者时留下的真正敏感的患者群体的评估值。9生物标志物组合作为MDM2i敏感性预测模型的特征基础足以获得与全部13种生物标志物列表实现的灵敏度可比较的灵敏度。但是，仅一些9生物标志物组合将实现比2个p53突变状态预测模型给出的灵敏度更高的灵敏度。但是值得注意的，来自少至2个生物标志物的全部所评价组合，以及大部分单个生物标志物模型显示比随机分类时偶然期望的灵敏度更高的灵敏度(约18％)。
从图10、图11和图12得出结论，单个生物标志物，在预测MDM2i化学敏感性的模型中作为特征基础使用时，足以实现样品敏感性预测，其将在临床环境下导致潜在的响应MDM2i的患者的显著富集。另外，相对于采用基于p53突变的患者选择所获得的临床疗效，从任何2个或更多个生物标志物产生的组合增加期望的临床疗效。从表2中列出的任何生物标志物组装8个生物标志物足以实现与13生物标志物模型给出的患者回应等同的患者回应。对13基因标签和相关组合获得的预测模型表现矩阵可以通过优化模型的朴素贝叶斯概率步骤中所用的类别归属p-值阈值在进一步优化，如实施例3中所进行那样。
在又一个实施方案中，研究了表2中所示的生物标志物是否可以与p53突变状态协作预测MDM2i化学敏感性。单个生物标志物和2种及更多种生物标志物的组合与p53突变状态在特征列表中组合。随后利用特征列表作为敏感性预测模型的基础，如先前和上文描述。如上文所述那样评价多个所得模型的表现。
作为例子使用的p53突变状态事例是p53外显子5至8突变。图13、图14和图15分别描述将p53突变与生物标志物合并的那些模型的PPV、特异性和灵敏度，并且与仅突变模型和完整13生物标志物模型所给出的结果比较。
图13显示与p53突变状态协作时，来自13生物标志物列表的至少单个生物标志物足以实现比数据中基础敏感性比率(18％)更高的PPV。它还显示当作为预测模型中特征使用时，仍与p53突变状态组合情况下，单个生物标志物至少实现比采用两个上文提到的p53突变状态事例获得的PPV更高的PPV。并且最终，与p53突变组合的任何5个生物标志物概括了通过13生物标志物模型实现的PPV。
当考虑特异性和灵敏度作为模型表现矩阵时，从图14和15得出相同结论。从图15值得注意地是，与p53突变一起建模时，高灵敏度可以从少至一个生物标志物获得。
综上所述，来自表2的单个或多个生物标志物与p53突变状态组合使得预测MDM2i敏感性成为可能，并且在治疗性环境或临床环境下应用于患者选择时，将产生显著富集，而丢失潜在MDM2i响应的患者则有限。
实施例7：鉴定的13种生物标志物在体内和在预先选择的野生型p53 人原发性异种移植模型中预测对MDM2i的化学敏感性
为了进一步验证图3中公开的预测性生物标志物，将人原发肿瘤在小鼠中直接移植并皮下培育并且随后评估MDM2i敏感性。允许全部动物适应4天并且圈养在病原体受控的环境中(5只小鼠/III型笼具)，随意摄取食物和饮水。用应答器确定动物。研究根据KantonalesBasel-Stadt颁发的允许编号1975所涵盖的流程进行并严格遵守Tierschutzgesetz和Tierschutzverordnung。通过在Harlan裸鼠的右侧腹移植人类患者肿瘤的肿瘤片(3x 3x 3mm3)，诱导皮下肿瘤。当肿瘤处于尺寸150-200mm3时，开始施用MDM2i(1)持续至多4周治疗时间。对于每次施用，新鲜制备MDM2i(1)。将MDM2i(1)溶解于0.5％HPMC(羟丙基甲基纤维素)中并且以100mg/kg每日一次(q24h)注射。每周3次测量肿瘤体积(TVol)，从卡尺测量确定(使用公式l×w×h×π/6)。通过肿瘤体积变化百分数，即对肿瘤反应定量。每周3次测量小鼠体重(BW)，允许在相对于开始治疗日(第0日)的任何特定时间点计算BW两种百分数的变化(Δ％BW)。
用于MDM2i敏感性的截断值基于针对完整肿瘤体积量值(而非最长直径总和)修改的RECIST，即认为是敏感或响应的模型展示完全反应(完全消退)或部分反应(肿瘤体积缩减>50％)或疾病稳定(在肿瘤体积缩减50％和肿瘤体积增加35％之间)。将显示疾病进展(肿瘤体积增加>35％)的体内模型视为不响应于MDM2i治疗。在治疗阶段期间的最大作用时间点作出敏感性呼应(sensitivity call)，以避免误导性呼应，所述误导性响应可以例如因MDM2i持续治疗期之后抗性机制出现引起。用于本研究的人原发性异种移植肿瘤模型来自多种肿瘤，并且根据图9选择谱系组成，例如，黑色素瘤(19)、结直肠癌(17)、脂肪肉瘤(3)、肾细胞癌(3)、肝癌(7)、乳腺癌(1)、胰腺癌(2)和肺癌(3)。使用表2中公开的全部生物标志物作为单个集合以及主要如实施例3和5中所示例的预测模型，预测针对每个人原发性异种移植肿瘤模型的灵敏度。在这个特定例子中，通过比较77个MDM2i(2)敏感细胞系与557个不敏感细胞系，训练朴素贝叶斯概率原理，并将朴素贝叶斯预测模型概率阈值设定成0.2，预测高于所述阈值的异种移植肿瘤模型为对MDM2抑制作用敏感。另外，将训练细胞系按化学敏感性归属为敏感类别和不敏感类别，如实施例2中示例的，唯一差异是，当针对给定的细胞系重复药理学表征时，细胞系敏感性度量值的中位数值用于总结重复的敏感性。
如16图中所示，预测55个人原发性异种移植肿瘤模型中27个对MDM2i敏感，并且这27个体内模型中，19个模型以实验方式证实为敏感，产生正预测值70.5％，改善了基础响应率49％。另外，预测55个体内模型中28个对MDM2i不敏感，并且这28个体内模型中20个模型以实验方式证实为不敏感，产生显著负预测值(NPV)71.5％。总体上，这些数据与图5中描述的预测模型表现是可比较的。使用小鼠中患者衍生的异种移植肿瘤，评估人原发性异种移植肿瘤模型对MDM2i治疗的反应允许体内验证MDM2i化学敏感性预测模型，因此证实表2中公开的生物标志物的有效性(图16)。
对于在这项研究中使用的全部55人原发性异种移植肿瘤模型可获得p53突变呼应。它们当中34个是野生型p53。如17图中所示，预测34个野生型p53人原发性异种移植肿瘤模型中22个对MDM2i敏感，并且这22个体内模型中，18个模型以实验方式证实为敏感，产生正预测值82％，再次显著改善基础响应率65％。预测34模型中12个对MDM2i不敏感，并且这12个模型中8个模型以实验方式证实为不敏感，产生显著负预测值(NPV)66.5％。总体上，这些数据与图5中描述的预测模型表现是同等可比较的，再一次地，使用小鼠中野生型p53选择的患者衍生异种移植肿瘤验证了表2中公开的生物标志物(图17)。
综上所述，使用人原发性异种移植肿瘤模型证实了图5中描述的体外预测模型表现，进一步在体内环境下验证了表2中公开的生物标志物。重要地，本文描述的发现支持MDM2i化学敏感性预测模型在未选择的癌症患者或野生型p53预先选择的癌症患者群体中的用途。

Claims (49)

1.一种预测癌症患者对人双微体2抑制剂(MDM2i)治疗的敏感性的方法，所述方法包括：测定从该患者获得的癌样品中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达；并且至少一种生物标志物的基因表达指示该患者对MDM2i治疗敏感。
2.权利要求1所述的方法，其中多于一种生物标志物选自表2。
3.权利要求1所述的方法，包括测定以下生物标志物的基因表达：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
4.权利要求1所述的方法，其中在测定至少一种生物标志物之前测定p53的突变，并且p53突变的存在指示降低的对MDM2i敏感性。
5.权利要求1所述的方法，其中癌样品选自***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜。
6.权利要求1所述的方法，其中测量至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质。
7.权利要求1所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
8.权利要求1所述的方法，其中MDM2i选自表1。
9.一种治疗癌症患者的方法，包括：测定从患者获得的癌样品中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达；并且至少一种生物标志物的存在指示患者对MDM2i敏感；并且向患者施用MDM2i。
10.权利要求9所述的方法，其中多于一种生物标志物选自表2。
11.权利要求9所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
12.权利要求9所述的方法，其中在测定至少一种生物标志物之前测定p53的突变，并且p53突变的存在指示降低的对MDM2i敏感性。
13.权利要求9所述的方法，还包括从施用MDM2i之前的患者获得生物样品，并且将MDM2i未治疗的癌样品与MDM2i治疗的癌样品中来自表2的至少一种生物标志物的差异性基因表达比较，其中增加的基因表达指示持续的患者敏感性。
14.权利要求9所述的方法，其中癌样品选自***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜。
15.权利要求9所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
16.权利要求9所述的方法，其中MDM2i选自表1。
17.权利要求9所述的方法，其中MDM2i以治疗有效量施用。
18.一种预测癌细胞对人双微体2抑制剂(MDM2i)的敏感性的方法，所述方法包括：
测定从患者样品获得的癌细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并且选自表2的至少一种生物标志物的基因表达指示癌细胞对MDM2i治疗敏感。
19.权利要求18所述的方法，其中多于一种生物标志物选自表2。
20.权利要求18所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
21.权利要求18所述的方法，其中在测定至少一种生物标志物之前测定p53的突变，并且p53突变的存在指示降低的对MDM2i敏感性。
22.权利要求18所述的方法，其中癌样品选自***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜。
23.权利要求18所述的方法，其中测量至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质。
24.权利要求18所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
25.权利要求18所述的方法，其中MDM2i选自表1。
26.权利要求18所述的方法，其中MDM2i以治疗有效量施用。
27.一种确定癌细胞对人双微体2抑制剂(MDM2i)的敏感性的方法，所述方法包括：
a)使癌细胞与至少一种MDM2i接触；
b)测量与MDM2i接触的细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并且至少一种生物标志物的表达指示对MDM2i的敏感性；和
c)比较用至少一种MDM2i处理的癌细胞与未处理或安慰剂处理的癌细胞的细胞增殖；其中与未处理或安慰剂处理的癌细胞相比时，存在处理的癌细胞的减少的细胞增殖。
28.权利要求27所述的方法，其中与至少一种MDM2i接触的癌细胞的减少的细胞增殖具有小于1μM的IC50。
29.权利要求27所述的方法，其中MDM2i是异喹啉酮。
30.权利要求27所述的方法，其中MDM2i选自表1。
31.权利要求27所述的方法，其中在至少两个不同时间点使细胞与MDM2i接触。
32.权利要求27所述的方法，其中在步骤a)使细胞与两种不同的MDM2i接触。
33.权利要求27所述的方法，其中在相同时间使细胞与两种不同的MDM2i接触。
34.权利要求27所述的方法，其中在不同时间点使细胞与两种不同的MDM2i接触。
35.权利要求27所述的方法，其中癌细胞选自***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜。
36.权利要求27所述的方法，其中测量至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质。
37.权利要求27所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
38.权利要求27所述的方法，其中在选自以下的时间点重复步骤b)和c)：施用每剂量的MDM2i后的4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3日、1周、1月和几个月。
39.一种筛选MDM2i候选物的方法，所述方法包括：
a)使细胞与MDM2i候选物接触；
b)测量与MDM2i候选物接触的细胞中选自表2的至少一种生物标志物的基因表达，并且至少一种生物标志物的表达指示对MDM2i的敏感性；和
c)将来自与MDM2i候选物接触的细胞的细胞增殖减少与接触取自表1的MDM2i的细胞的细胞增殖和未处理或安慰剂处理的细胞的细胞增殖的减少比较。
40.权利要求39所述的方法，其中测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
41.权利要求39所述的方法，其中MDM2i候选物增加表2的至少一种生物标志物的基因表达。
42.权利要求39所述的方法，其中细胞是选自***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜的癌细胞。
43.权利要求39所述的方法，其中测量表2的至少一种生物标志物的mRNA或蛋白质的表达。
44.权利要求39所述的方法，包括测定以下生物标志物：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
45.包含MDM2i的组合物，用于治疗选择的癌症患者群体中的癌症，其中癌症患者群体是基于从所述患者获得的癌细胞样品中显示选自表2的至少一种生物标志物的基因表达来选择的。
46.权利要求45所述的组合物，其中癌细胞样品选自***、肺、胰脏、卵巢、中枢神经***(CNS)、子宫内膜、胃、大肠、结肠、食道、骨、泌尿道、造血、淋巴样、肝、皮肤、黑色素瘤、肾、软组织肉瘤和胸膜。
47.权利要求45或46所述的组合物，其中患者基于以下生物标志物的基因表达来选择：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN。
48.一种预测癌症患者对人双微体2抑制剂(MDM2i)治疗的敏感性的试剂盒，所述试剂盒包含：
i)用于检测以下生物标志物表达的工具：MDM2、CDKN1A、ZMAT3、DDB2、FDXR、RPS27L、BAX、RRM2B、SESN1、CCNG1、XPC、TNFRSF10B和AEN；和
ii)如何使用所述试剂盒的说明书。
49.权利要求48所述的试剂盒的用途，用于权利要求1至37的任何方法。
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