CN104513820A - DNA片段及其在制备H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒中的应用 - Google Patents

DNA片段及其在制备H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104513820A
CN104513820A CN201310461215.9A CN201310461215A CN104513820A CN 104513820 A CN104513820 A CN 104513820A CN 201310461215 A CN201310461215 A CN 201310461215A CN 104513820 A CN104513820 A CN 104513820A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
virus
phw2000
subtype influenza
subtype
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310461215.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104513820B (zh
Inventor
户义
祝庆余
李靖
吴晓燕
孙伟
韩鹏飞
杨银辉
康晓平
李裕昌
张雨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Original Assignee
Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS filed Critical Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority to CN201310461215.9A priority Critical patent/CN104513820B/zh
Publication of CN104513820A publication Critical patent/CN104513820A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104513820B publication Critical patent/CN104513820B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种DNA片段及其在制备H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒中的应用。所述DNA片段的核苷酸序列由如下序列依次串联组成：H5N1亚型流感病毒NA节段3’端非编码区编码基因序列、H5N1亚型流感病毒NA基因编码区编码序列、PTV-1病毒2A肽编码基因序列、Gaussia荧光素酶编码基因序列、H5N1亚型流感病毒NA节段5’端包装信号编码基因序列和H5N1亚型流感病毒NA节段5’端非编码区的编码序列组成。利用所述DNA片段制备得到的重组H5N1亚型流感报告病毒，可通过细胞上清或动物血清中的荧光素酶活性，快速、准确、客观地对样品中包含的病毒进行定量检测，既节约了时间，也提高了检测结果的准确性和可靠性，从而为抗H5N1亚型流感病毒药物筛选和疫苗评估提供新的便捷、有效的工具。

Description

DNA片段及其在制备H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒中的应用
技术领域
本发明涉及一种DNA片段及其在制备H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒中的应用。
背景技术
H5N1亚型流感病毒是甲型流感病毒的一种，主要在禽类传播。近年来，H5N1亚型流感病毒感染人类的报道逐年增多，截至2012年8月，全球已有15个国家和地区报告608人感染，其中359人死亡，死亡率高达59%。感染滴度是病毒相关基础研究以及药物、疫苗研发所需的基础数据。目前，H5N1亚型流感病毒的感染滴度主要依靠测定病毒的半数组织培养感染剂量（TCID50）或空斑形成单位（PFU）来确定，操作复杂且准确程度易受到主观经验影响。
Gaussia荧光素酶是新近发现的一种由海洋桡脚类动物产生的荧光素酶，具有分子量小、检测灵敏度高、半衰期短等优点。由于Gaussia荧光素酶自身具有分泌肽,细胞中80%以上的酶分子能分泌至细胞外，可通过检测细胞培养上清或血液中荧光素酶活性指示体内荧光素酶表达情况。例如，Thomas、Chung等成功通过测定血液中Gaussia荧光素酶活性定量评价了体内肿瘤生长过程；Griesenbach等利用支气管肺泡灌洗液和血清中的Gaussia荧光素酶活性对阳离子脂质体GL67A的呼吸道载体投递效果等进行了定量测定等。
目前，还没有表达Gaussia荧光素酶的重组H5N1亚型流感报告病毒及其相关的应用研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA片段及其在制备H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒中的应用。
本发明所提供的DNA片段，其核苷酸序列由如下序列依次串联组成：首端限制性内切酶BsaⅠ的保护碱基及其识别位点、H5N1亚型流感病毒NA（神经氨酸酶）节段3’端非编码区序列、H5N1亚型流感病毒NA基因序列（不含终止子）、猪捷申病毒（porcine teschovirus–1，PTV-1）2A肽编码序列、Gaussia荧光素酶基因序列、H5N1亚型流感病毒NA基因3’端包装信号、H5N1亚型流感病毒NA节段5’端非编码区以及末端限制性内切酶BsaⅠ的识别位点及其保护碱基。
在上述DNA片段中，所述首端限制性内切酶BsaⅠ的保护碱基及其识别位点为序列表序列1的第1-14位；
所述H5N1亚型流感病毒NA节段3’端非编码区序列为序列表序列1的第15-34位；
所述H5N1亚型流感病毒NA基因序列（不含终止子）为序列表序列1的第35-1381位；
所述PTV-1病毒2A肽编码序列为序列表序列2的第16-81位；
所述Gaussia荧光素酶编码基因序列为序列表序列2的第82-636位；
所述H5N1亚型流感病毒NA基因3’端包装信号序列为序列表序列3的25-181位；
所述H5N1亚型流感病毒NA节段5’端非编码区编码基因序列为序列表序列3的第182-210位；
所述末端限制性内切酶BsaⅠ的保护碱基及其识别位点为序列表序列3的第211-225位
在上述DNA片段中，所述DNA片段的核苷酸序列为序列表序列4。
本发明保护含有上述DNA片段的重组载体、重组菌、重组细胞或重组病毒。
所述重组载体具体可通过在载体pHW2000的BsaI位点处***上述DNA片段得到。
上述DNA片段、重组载体、重组菌、细胞在制备H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒中的应用。
本发明还提供一种重组载体组合，由权利要求5所述重组载体、pHW2000-VN-PB2、pHW2000-VN-PB2、pHW2000-VN-PB1、pHW2000-VN-PA、pHW2000-VN-HA、pHW2000-VN-NP、pHW2000-VN-M、pHW2000-VN-NS组成；该重组载体组合可用于制备H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒。
实验证明，将Gaussia荧光素酶基因通过PTV-1病毒2A肽连接至H5N1亚型流感病毒NA基因编码区末端后获得的重组载体pHW2000-VN-NA-GLUC，与VN1194病毒其他7个节段的双向表达质粒共同转染HEK293T细胞，取细胞培养上清接种鸡胚尿囊腔后，获得的鸡胚尿囊液上清中Gaussia荧光素酶活性可达9.6×108。利用RT-PCR可从上清中同时检测到报告病毒NA基因编码区、NP基因以及Gaussia荧光素酶基因的表达。空斑测定报告病毒滴度的可达3.5×107PFU/ml。将报告病毒按MOI=1接种MDCK细胞，通过绘制生长曲线，表明报告病毒的复制能力略低于野生病毒，但最高滴度仍可达到5×106PFU/ml。同时，实验结果显示，细胞培养上清中病毒滴度与Gaussia荧光素酶活性成显著正相关，其相关系数R可达0.97，从而说明上清Gaussia荧光素酶活性能够可靠地反映病毒的复制水平。利用报告病毒测定广谱抗病毒药利巴韦林的体外抑制活性，获得其半数抑制浓度（IC50）为29.8±0.43μM，与空斑减少实验计算结果（31.2±2.05μM）相符，但其操作更为简便，且重复性高于空斑减少实验。
本发明具有以下优点：Gaussia荧光素酶是分泌性荧光素酶，其上清中的酶活性与该基因的表达量之间具有很好的线性浓度范围，因此仅通过培养上清或血液中的酶活性即可对病毒的增殖情况进行定量检测，不需要裂解细胞，也不需观察细胞病变，极大地简化了病毒滴定的程序。此外，相对于细胞病变的判断，荧光素酶活性的检测具有更好的客观性和可重复性，更能真实的反应病毒的增殖状况。本发明为抗H5N1亚型流感病毒药物筛选和疫苗评估提供新的便捷、有效的工具。
附图说明
图1为引物对A、B、C、D和E的PCR扩增产物电泳图。其中，M为分子量标准，从上到下的条带大小依次为1401bp、661bp、225bp、840bp、2206bp；泳道1为引物对A的PCR产物，泳道2为引物对B的PCR产物，泳道3为引物对C的PCR产物，泳道4为引物对D的PCR产物，泳道5为引物对E的PCR产物。
图2为重组载体pHW2000-VN-NA-GLUC的结构示意图。其中，3’NCR为H5N1亚型流感病毒NA（神经氨酸酶）节段3’端非编码区，NA为H5N1亚型流感病毒NA基因编码区，PTV-12A为PTV-1病毒2A肽编码序列，Gluc为Gaussia荧光素酶编码基因，Sig为H5N1亚型流感病毒NA节段5’-包装信号序列，5’NCR为H5N1亚型流感病毒NA节段5’端非编码区。PolⅡ表示Ⅱ型RNA聚合酶启动子，tⅡ表示Ⅱ型RNA聚合酶终止子；PolⅠ表示Ⅰ型RNA聚合酶启动子，tⅠ表示Ⅰ型RNA聚合酶终止子。
图3为H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒的空斑测定结果。
图4为H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒的RT-PCR检测结果。
图5为H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒的荧光素酶活性测定结果。其中，纵坐标RLU表示相对光单位（Relative Light Unit）。
图6为H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒在MDCK的生长曲线。
图7为荧光素酶活性或病毒滴度之间的关系
图8为利巴韦林对H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒的抑制活性
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
质粒pHW2000（Hoffmann E,G Neumann,Y Kawaoka,G Hobom,and R Webster.ADNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000,97:6108–6113.）；质粒pHW2000-VN-PB2、pHW2000-VN-PB1、pHW2000-VN-PA、pHW2000-VN-HA、pHW2000-VN-NP、pHW2000-VN-NA、pHW2000-VN-M和pHW2000-VN-NS，是以pHW2000为出发质粒，按照文献：Li J,LiY,Hu Y,Chang G,Sun W,Yang Y,Kang X,Wu X,Zhu Q.PB1-mediated virulenceattenuation of H5N1influenza virus in mice is associated with PB2.J Gen Virol.2011Jun;92(Pt6):1435-44，采用常规方法得到的。其中pHW2000-VN-PB2是在pHW2000的BsmBI位点***了H5N1亚型流感病毒A/VietNam/1194/2004株（以下简称VN1194）PB2节段的cDNA；pHW2000-VN-PB1是在pHW2000的BsmBI位点***了VN1194病毒PB1节段的cDNA；pHW2000-VN-PA是在pHW2000的BsmBI位点***了VN1194病毒PA节段的cDNA；pHW2000-VN-HA是在pHW2000的BsmBI位点***了VN1194病毒HA节段的cDNA；pHW2000-VN-NP是在pHW2000的BsmBI位点***了VN1194病毒NP节段的cDNA；pHW2000-VN-NA是在pHW2000的BsmBI位点***了VN1194病毒NA节段的cDNA；pHW2000-VN-M是在pHW2000的BsmBI位点***了VN1194病毒M节段的cDNA；pHW2000-VN-NS是在pHW2000的BsmBI位点***了VN1194病毒NS节段的cDNA。上述质粒都可以自中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
实施例1、重组载体pHW2000-VN-NA-GLUC的构建
1、NA基因编码区（含3’非编码区）的PCR扩增
以VN1194病毒NA节段的双向表达质粒pHW2000-VN-NA为模板，利用引物对A（由引物A-F和引物A-R组成，引物A-F的序列如序列表序列5所示，引物A-R的序列如序列表序列6所示）进行PCR扩增，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（图1中的泳道1），回收1.4kb DNA片段（命名为片段a）进行测序，结果表明，片段a的序列如序列表中序列1所示，其中，第1-14位为限制性内切酶Bsa I的保护碱基及其识别位点；第15-34位为H5N1亚型流感病毒NA节段3’端非编码区序列；第35-1381位为H5N1亚型流感病毒NA基因序列（不含终止子）；第1381-1401位为PTV-1病毒2A肽序列首端20位碱基。
2、Gluc基因的PCR扩增
以质粒pTK-Gluc（购自NEB公司）为模板，利用引物对B（由引物B-F和引物B-R组成，引物B-F的序列如序列表序列7所示，引物B-R的序列如序列表序列8所示）进行PCR扩增，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（图1中的泳道2），回收0.66kbDNA片段（命名为片段b）进行测序，结果表明，片段b的序列如序列表中序列2所示，其中第1-15位为H5N1亚型流感病毒NA基因（不含终止子）末端15个碱基、第16—81位为PTV-1病毒2A肽编码序列，第82—639位为Gaussia荧光素酶基因序列，第640-661位为H5N1亚型流感病毒NA基因3’端包装信号序列首端22位碱基。
3、5’-包装信号编码基因的PCR扩增
以质粒pHW2000-VN-NA为模板，利用引物对C（由引物C-F和引物C-R组成，引物C-F的序列如序列表序列9所示，引物C-R的序列如序列表序列10所示）进行PCR扩增，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（图1中的泳道3），回收225bp DNA片段（命名为片段c）进行测序，结果表明，片段c的序列如序列表序列3所示，其中，第1-24位为Gaussia荧光素酶基因末端24位碱基，第25-181位为H5N1亚型流感病毒NA基因3’端包装信号序列，第182-210位为H5N1亚型流感病毒NA节段5’非编码区序列、第211-225位为限制性内切酶Bsa I酶切的识别序列及保护碱基。
4、融合PCR
1）将步骤2获得的片段b和步骤3获得的片段c混合作为模板，利用引物对D（由所述引物B-F和引物C-R组成）进行PCR扩增，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（图1中的泳道4），回收840bp DNA片段（命名为片段d）进行测序，结果表明，片段d的序列为将序列2和序列3依次串联的序列。
2）将步骤1）获得的片段d和步骤1获得的片段a混合作为模板，利用引物对E（由所述引物A-F和引物C-R组成）进行PCR扩增，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（图1中的泳道5），回收2.2bp DNA片段（命名为片段e）进行测序，结果表明，片段e的序列如序列表序列4所示，该序列由如下序列依次串联组成：首端限制性内切酶BsaⅠ的保护碱基及其识别位点（即序列表序列4第1-14位）、H5N1亚型流感病毒NA节段3'端非编码区序列（即序列表序列4第15-34位）、H5N1亚型流感病毒NA基因序列（不含终止子，即序列表序列4第35-1381位）、PTV-1病毒2A肽编码序列（即序列表序列4第1382-1447位）、Gaussia荧光素酶基因序列（即序列表序列4第1448-2005位）、H5N1亚型流感病毒NA基因3'端包装信号（即序列表序列4第2006-2162位）、H5N1亚型流感病毒NA节段5'端非编码区（即序列表序列4第2163-2191位）以及末端限制性内切酶Bsa Ⅰ的识别位点及其保护碱基及Bsa I酶切识别序列（即序列表序列4第2192-2206位）。
5、获得重组载体pHW2000-VN-NA-GLUC
将步骤4获得的片段e用限制性内切酶Bsa I酶切后，与经Bsa I酶切的质粒pHW2000的线性片段连接，获得重组载体pHW2000-VN-NA-GLUC，经测序证实，重组载体pHW2000-VN-NA-GLUC（其结构示意图如图2所示）是在质粒pHW2000的Bsa I位点处依次连入了具有如下序列的DNA片段：H5N1亚型流感病毒NA节段3'端非编码区序列（即序列表序列4第15-34位）、H5N1亚型流感病毒NA基因序列（不含终止子，即序列表序列4第35-1381位）、PTV-1病毒2A肽编码序列（即序列表序列4第1382-1447位）、Gaussia荧光素酶基因序列（即序列表序列4第1448-2005位）、H5N1亚型流感病毒NA基因3'端包装信号（即序列表序列4第2006-2162位）、H5N1亚型流感病毒NA节段5'端非编码区（即序列表序列4第2163-2191位）。
实施例2、H5N1亚型流感Guassia素荧光酶报告病毒的拯救与荧光素酶活性鉴定
1、病毒拯救
取人肾上皮细胞系HEK293T细胞（购自美国ATCC公司，目录号CRL-11268）接种于6孔板中用含10%胎牛血清（购自美国Invitrogen公司，目录号1122050）的高糖DMEM培养基（Invitrogen购自美国Invitrogen公司，目录号12100-046）进行培养。次日，取pHW2000-VN-NA-GLUC质粒与VN1194病毒其他7个节段的双向表达质粒pHW2000-VN-PB2、pHW2000-VN-PB2、pHW2000-VN-PB1、pHW2000-VN-PA、pHW2000-VN-HA、pHW2000-VN-NP、pHW2000-VN-M、pHW2000-VN-NS各1μg，混匀后加入到500μL opti-MEM培养液中，再加入10μL Lipofectamine LTX（Invitrogen），轻轻混匀，室温放置30min，获得质粒与脂质体的混合液。转染前，用opti-MEM洗涤293T细胞一遍，然后将质粒与脂质体的混合液加入到293T细胞中，并用opti-MEM将体积补至1mL，37℃5%CO2培养48小时，取培养上清离心，弃沉淀，取离心后的上清100μL接种至9日龄鸡胚的尿囊腔，37℃继续培养48小时后，取鸡胚尿囊液1500g离心5min，弃沉淀，取上清（应含可表达Gaussia荧光素酶的H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒NA-Gluc，此时命名为待测H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒液）分装后冻存于-70℃备用。
2、空斑测定
取MDCK细胞（购自美国ATCC公司，目录号CCL-34)接种于六孔板中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基进行培养。次日，用含2%胎牛血清的DMEM培养基将步骤1获得的待测H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒液按十倍进行系列稀释，获得病毒稀释液；弃六孔板中MDCK细胞的培养液，用PBS洗涤细胞一遍。按每孔200μL将不同浓度的病毒稀释液加至六孔板中，37℃吸附1小时。弃病毒稀释液，用PBS洗涤MDCK细胞一遍，加盖琼脂糖胶37℃培养48小时，加入0.1%中性红染色，其中，待测H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒稀释10000倍的结果如图3a所示；野生型VN1194病毒对照的结果如图3b所示。
结果：报告病毒在MDCK细胞上形成的空斑（图3a）与野生VN1194病毒（图3b）相似，且滴度可达3.5×107PFU/ml。
3、RT-PCR鉴定
分别提取步骤1获得的待测H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒液和野生H5N1亚型流感病毒A/VietNam/1194/2004株（Li J,Li Y,Hu Y,Chang G,Sun W,Yang Y,Kang X,Wu X,Zhu Q.PB1-mediated virulence attenuation of H5N1influenza virus inmice is associated with PB2.J Gen Virol.2011Jun;92(Pt6):1435-44.。可自中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得）的总RNA，并用引物C-R进行反转录获得cDNA。以该cDNA为模板，用序列表序列11和12所示的引物对D对Gaussia荧光素酶编码基因进行PCR扩增，目的产物大小为661bp，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
结果：如图4所示，步骤1获得的待测H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒表达了Gaussia荧光素酶编码基因（图4中的泳道2），而野生型VN1194病毒不表达Gaussia荧光素酶编码基因（图4中的泳道1）。
4、荧光素酶活性测定
取步骤1获得的待测H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒液10μL，加入Gaussia荧光素酶底物（购自NEB公司，产品目录编号为E3300S）50μL，迅速放入Promega公司的GloMax20/20发光检测仪中，integration time设置为5秒，测定相对发光值（RLU，Relative Luminescence Units），重复3次结果。同时取野生H5N1亚型流感病毒A/VietNam/1194/2004株感染的鸡胚尿囊液作为阴性对照。
结果如图5所示：阴性对照（图5中的VN）几乎没有Gaussia荧光素酶活性，而步骤1获得的待测H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒液（图5中的VN-Gluc）中的Gaussia荧光素酶活性很高，说明步骤1获得的待测H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒液中的H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒可表达Gaussia荧光素酶。
实施例3、生长曲线测定
取MDCK细胞接种于12孔板中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基进行培养。次日，弃培养液，用含2%胎牛血清的DMEM培养基分别将步骤1获得的H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒液及野生VN1194病毒稀释一定浓度后，按MOI=1接种至细胞孔中，每孔200μl，37℃吸附1小时。之后每孔加入含2%胎牛血清的DMEM培养基800μl，置37℃，5%CO2培养，分别在感染后第3、6、12、24、48小时取上清，用空斑法测定病毒滴度，用回归分析计算病毒滴度与Gaussia荧光素酶活性之间相关性。
结果如图6所示，报告病毒的增殖能力略低于野生病毒，但两者生长曲线相似，其滴度均在感染后24小时达到最高值，分别为5×106PFU/ml和3.5×107PFU/ml。同时，回归分析表明，细胞培养上清中病毒滴度与Gaussia荧光素酶活性成显著正相关，其相关系数R可达0.97（图7），说明上清Gaussia荧光素酶活性能够可靠地反映病毒的复制水平。
实施例4、利用报告病毒测定利巴韦林的半数有效剂量（Effect Dose50，ED50）
取MDCK细胞接种于96孔板中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基进行培养。次日，弃培养液，用维持液（含2%胎牛血清的高糖DMEM培养基）将利巴韦林（购自美国Sigma公司，目录号R9644）稀释成200、180、160、140、120、100、80、60、40、20μM，每个浓度加入8孔，每孔加入100μl，37℃孵育1小时。同时用维持液将野生VN1194病毒和Gaussia荧光素酶报告病毒稀释至5×105/ml。1小时后，将稀释好的病毒加入到96孔板中，每种病毒每个药物浓度各加入4孔，每孔加入100μl，同时设置病毒对照（药物浓度为0）和细胞对照（药物和病毒浓度均为0）。37℃，5%CO2培养24小时后，取报告病毒上清10μL，加入Gaussia荧光素酶底物迅速放入GloMax20/20发光检测仪中读取发光数值。同时取野生VN1194病毒，按实施例2进行空斑滴定。分别利用公式1和公式2计算药物抑制率，利用SPSS软件中的Probit回归模型计算药物的半数有效浓度。
公式1：
公式2：
结果：利用报告病毒测定广谱抗病毒药利巴韦林的体外抑制活性，如图8所示，用时约为1天，如图8显示，获得其半数抑制浓度（IC50）为29.8±0.43μM；利用空斑减少实验测定广谱抗病毒药利巴韦林的体外抑制活性，用时约为4天，获得其半数抑制浓度（IC50）为31.2±2.05μM。二者结果一致。

Claims (8)

1.一种DNA片段，其核苷酸序列由如下序列依次串联组成：首端限制性内切酶BsaⅠ的保护碱基及其识别位点、H5N1亚型流感病毒NA节段3’端非编码区序列、不含终止子的H5N1亚型流感病毒NA基因序列、猪捷申病毒2A肽编码序列、Gaussia荧光素酶基因序列、H5N1亚型流感病毒NA基因3’端包装信号、H5N1亚型流感病毒NA节段5’端非编码区以及末端限制性内切酶BsaⅠ的识别位点及其保护碱基。
2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于：所述首端限制性内切酶BsaⅠ的保护碱基及其识别位点为序列表序列1的第1-14位；
和/或，所述H5N1亚型流感病毒NA节段3’端非编码区序列为序列表序列1的第15-34位；
和/或，所述不含终止子的H5N1亚型流感病毒NA基因序列为序列表序列1的第35-1381位；
和/或，所述猪捷申病毒2A肽编码序列为序列表序列2的第16-81位；
和/或，所述Gaussia荧光素酶编码基因序列为序列表序列2的第82-636位；
和/或，所述H5N1亚型流感病毒NA基因3’端包装信号序列为序列表序列3的25-181位；
和/或，所述H5N1亚型流感病毒NA节段5’端非编码区编码基因序列为序列表序列3的第182-210位；
和/或，所述末端限制性内切酶BsaⅠ的保护碱基及其识别位点为序列表序列3的第211-225位。
3.根据权利要求1或2所述的DNA片段，其特征在于：所述DNA片段的核苷酸序列为序列表序列4。
4.含有权利要求1—3中任一所述DNA片段的重组载体、重组菌、重组细胞或重组病毒。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：是将权利要求1—3中任一所述DNA片段***到载体pHW2000的BsaI位点处得到的。
6.权利要求1—5中任一所述DNA片段、重组载体、重组菌、重组细胞或重组病毒在制备表达Guassia荧光素酶的H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒的应用。
7.重组载体组合，由权利要求5所述重组载体、pHW2000-VN-PB2、pHW2000-VN-PB2、pHW2000-VN-PB1、pHW2000-VN-PA、pHW2000-VN-HA、pHW2000-VN-NP、pHW2000-VN-M、pHW2000-VN-NS组成。
8.权利要求7所述重组载体在制备表达Guassia荧光素酶的H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒中的应用。
CN201310461215.9A 2013-09-30 2013-09-30 DNA片段及其在制备H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒中的应用 Expired - Fee Related CN104513820B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310461215.9A CN104513820B (zh) 2013-09-30 2013-09-30 DNA片段及其在制备H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310461215.9A CN104513820B (zh) 2013-09-30 2013-09-30 DNA片段及其在制备H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104513820A true CN104513820A (zh) 2015-04-15
CN104513820B CN104513820B (zh) 2017-08-04

Family

ID=52789692

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310461215.9A Expired - Fee Related CN104513820B (zh) 2013-09-30 2013-09-30 DNA片段及其在制备H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104513820B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108815203A (zh) * 2018-05-28 2018-11-16 山东中医药大学 基于流感荧光素酶报告病毒的动物模型的建立方法和应用
CN110184284A (zh) * 2019-05-22 2019-08-30 华南农业大学 携带NanoLuc基因的重组禽流感病毒及其在活体成像小鼠模型中的应用
CN110205321A (zh) * 2019-05-13 2019-09-06 华南农业大学 一种dna片段及其在构建表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1471583A (zh) * 2000-08-29 2004-01-28 ���Ͽعɹ�˾ 正链rna病毒复制子颗粒的包装
CN101693894A (zh) * 2009-10-15 2010-04-14 北京大学深圳研究生院 禽流感病毒h5n1假病毒及其制备方法与专用dna片段
CN102080068A (zh) * 2009-11-27 2011-06-01 中国科学院上海生命科学研究院 荧光素酶活性片段及其应用
CN102191223A (zh) * 2010-03-05 2011-09-21 中国科学院上海生命科学研究院 H5n1亚型禽流感假病毒的制备方法及其用途
CN102234635A (zh) * 2010-12-01 2011-11-09 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 高感染力拟似流感病毒制作与专用编码序列及其应用
CN103305479A (zh) * 2013-06-09 2013-09-18 中国人民解放军疾病预防控制所 鼠痘病毒的荧光素酶标记***及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1471583A (zh) * 2000-08-29 2004-01-28 ���Ͽعɹ�˾ 正链rna病毒复制子颗粒的包装
CN101693894A (zh) * 2009-10-15 2010-04-14 北京大学深圳研究生院 禽流感病毒h5n1假病毒及其制备方法与专用dna片段
CN102080068A (zh) * 2009-11-27 2011-06-01 中国科学院上海生命科学研究院 荧光素酶活性片段及其应用
CN102191223A (zh) * 2010-03-05 2011-09-21 中国科学院上海生命科学研究院 H5n1亚型禽流感假病毒的制备方法及其用途
CN102234635A (zh) * 2010-12-01 2011-11-09 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 高感染力拟似流感病毒制作与专用编码序列及其应用
CN103305479A (zh) * 2013-06-09 2013-09-18 中国人民解放军疾病预防控制所 鼠痘病毒的荧光素酶标记***及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JASMINE T. PEREZ ET AL.: "Insertion of a GFP Reporter Gene in Influenza Virus", 《CURRENT PROTOCOLS IN MICROBIOLOGY》 *
M. SARAH ET AL.: "Enhanced Gaussia Luciferase Blood Assay for Monitoring of in Vivo Biological Processes", 《 ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
WENFEI ZHU ET AL.: "A reporter system for assaying influenza virus RNP functionality based on secreted Gaussia luciferase activity", 《VIROLOGY JOURNAL》 *
周勇: "水动力转染技术在IFNβ-Luc小鼠模型与HBV树鼩模型研究中的应用", 《中国博士学位论文全文数据库》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108815203A (zh) * 2018-05-28 2018-11-16 山东中医药大学 基于流感荧光素酶报告病毒的动物模型的建立方法和应用
CN110205321A (zh) * 2019-05-13 2019-09-06 华南农业大学 一种dna片段及其在构建表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒中的应用
CN110205321B (zh) * 2019-05-13 2021-02-19 华南农业大学 一种dna片段及其在构建表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒中的应用
CN110184284A (zh) * 2019-05-22 2019-08-30 华南农业大学 携带NanoLuc基因的重组禽流感病毒及其在活体成像小鼠模型中的应用
CN110184284B (zh) * 2019-05-22 2021-02-19 华南农业大学 携带NanoLuc基因的重组禽流感病毒及其在活体成像小鼠模型中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN104513820B (zh) 2017-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Heaton et al. In vivo bioluminescent imaging of influenza a virus infection and characterization of novel cross-protective monoclonal antibodies
Breen et al. Replication-competent influenza A viruses expressing reporter genes
Qiu et al. Newcastle disease virus V protein targets phosphorylated STAT1 to block IFN-I signaling
Nogales et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter influenza A virus to evaluate viral infections
Scott et al. Defective interfering influenza A virus protects in vivo against disease caused by a heterologous influenza B virus
Gao et al. Prevailing I292V PB2 mutation in avian influenza H9N2 virus increases viral polymerase function and attenuates IFN-β induction in human cells
Wen et al. Development of a novel thermostable Newcastle disease virus vaccine vector for expression of a heterologous gene
Wang et al. Characterization of a new member of alphacoronavirus with unique genomic features in Rhinolophus bats
Nogales et al. The K186E amino acid substitution in the canine influenza virus H3N8 NS1 protein restores its ability to inhibit host gene expression
Mizuta et al. Molecular evolution of the haemagglutinin–neuraminidase gene in human parainfluenza virus type 3 isolates from children with acute respiratory illness in Yamagata prefecture, Japan
Rangaswamy et al. Newcastle disease virus establishes persistent infection in tumor cells in vitro: contribution of the cleavage site of fusion protein and second sialic acid binding site of hemagglutinin-neuraminidase
Wedde et al. Evolution of the hemagglutinin expressed by human influenza A (H1N1) pdm09 and A (H3N2) viruses circulating between 2008–2009 and 2013–2014 in Germany
Meng et al. Unexpected complexity in the interference activity of a cloned influenza defective interfering RNA
Yu et al. Biological characterizations of H5Nx avian influenza viruses embodying different neuraminidases
Fulton et al. The influenza B virus hemagglutinin head domain is less tolerant to transposon mutagenesis than that of the influenza A virus
CN104513820A (zh) DNA片段及其在制备H5N1亚型流感Guassia荧光素酶报告病毒中的应用
Dimmock et al. In vivo antiviral activity: defective interfering virus protects better against virulent Influenza A virus than avirulent virus
Vigeveno et al. Outbreak severity of highly pathogenic avian influenza A (H5N8) viruses is inversely correlated to polymerase complex activity and interferon induction
Abdelwhab et al. Prevalence of the C-terminal truncations of NS1 in avian influenza A viruses and effect on virulence and replication of a highly pathogenic H7N1 virus in chickens
Mostafa et al. Pa from a recent h9n2 (g1-like) avian influenza a virus (aiv) strain carrying lysine 367 confers altered replication efficiency and pathogenicity to contemporaneous h5n1 in mammalian systems
CN110184284B (zh) 携带NanoLuc基因的重组禽流感病毒及其在活体成像小鼠模型中的应用
Merour et al. Completion of the full-length genome sequence of the infectious salmon anemia virus, an aquatic orthomyxovirus-like, and characterization of mAbs
Muraki et al. Identification of an amino acid residue on influenza C virus M1 protein responsible for formation of the cord-like structures of the virus
Hussain et al. Reduced sialidase activity of influenza A (H3N2) neuraminidase associated with positively charged amino acid substitutions
Nidzworski et al. Detection and differentiation of Newcastle disease virus and influenza virus by using duplex real-time PCR

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20170804

Termination date: 20190930

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee