CN104513787B - 用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片及*** - Google Patents

Abstract

针对现有技术中尚无能够同时实现单细胞的捕获、培养和批量化差异给药的集成微流控芯片，本发明提供了一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片及***，属于微流控芯片技术在细胞药理分析领域的应用。微流控芯片由自上而下依次封接的细胞捕获与培养单元、药物扩散单元和药物供给单元组成。微流控芯片的***包括微流控芯片，荧光显微镜，图像处理设备和数字注射泵。其制备方法为，将三个单元分别在硅板上光刻出底板平面图形蚀出凹槽，再将液态的芯片材料倒入槽中，凝固后得到各个单元；再封接键合打孔，得到微流控芯片。本发明在一块集成微流控芯片上实现了对单细胞的捕获、培养和批量化差异给药三种功能于一身，且有效地避免了样品污染。

Description

用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片及***

技术领域

本发明属于微流控芯片技术在细胞药理分析领域的应用，尤其是涉及一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片及***。

背景技术

当今社会，各种疾病尤其是癌症严重威胁着人类的健康。而单细胞级的研究对于癌症、血液病、帕金森症、老年痴呆等重大疾病的研究十分重要，因此，实现单细胞的捕获、培养、批量化差异给药，对于研究药物高通量筛选，癌细胞等细胞的生长、转移、扩散以及术后判断等都具有重要的意义。

近年来，随着微机电技术与生命科学、分析化学等学科的迅猛发展，生物MEMS技术以及基于Bio-MEMS技术的微全分析***(u-TAS)正在逐渐成为科学家研究的热点。微流控芯片将化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测，细胞的分选、捕获、培养、给药、融合、裂解等基本操作单元集成在一小块芯片上，用以实现常规化学或生物实验室的各种功能，具有体积小、消耗试剂少、结果准确可靠、反应快速、轻便快捷、用后易于处理等优点。

Dino Di Carlo等在Lab Chip，2006，6，1445-1449中，利用软光刻技术和PDMS材料，设计制作了一种在单方向上带有U形微阱结构的多阵列单细胞捕获装置，该装置实现了单细胞的快速捕获；但是该研究者对细胞捕获后的长期培养、批量化差异给药等方面的研究没有指明。

Alison M Skelley等在Nature Methods，2009，6(2)，147-152中，利用软光刻技术和PDMS材料，设计制作了一种前后两个方向各带有一个U形微阱的多阵列细胞捕获、配对、融合装置，该装置和荧光示踪技术相结合，可以观察捕获的细胞在U微阱内部进行配对和融合的动态全过程；但是该研究者对于细胞的后续长期培养和批量化差异给药等方面的研究没有给以指明。

Jing Zhu等在Sensors and Actuators A.215(2014)，197-203中，通过对PDMS微流控芯片中微阱几何结构和应力分布的调整，对单细胞或者多细胞捕获芯片中微阱的可调节性进行了研究；但是该研究者没有进行单细胞捕获后批量化差异给药方面的研究。

申请号为CN201410141283.1的专利：一种单细胞分析用微流控芯片和***及单细胞分析方法，设计了一种实现单细胞捕获、裂解、胞内成分分析的芯片***；但是该集成芯片对于单细胞捕获的实现是通过设置垂直方向的捕获孔，靠的是重力驱动，过程不易操纵且容易对细胞造成损伤；该芯片在功能上不能实现单细胞捕获后的培养和批量化差异给药。

申请号为CN201110224663.8的专利：一种全血癌细胞捕获集成微流控芯片，设计了一种可以实现全血癌细胞分离、捕获的微流控芯片；该微流控芯片是一层单元结构，可以实现对多细胞的分离捕获，不能够实现单细胞的捕获、培养和批量化差异给药。

申请号为CN201180072343的专利：用于高通量分析的微流控细胞捕获和分析设备，设计了一种用于多细胞捕获和分析的微流控芯片单元，但是缺点在于该芯片在设计尺寸和结构原理上不能确保实现单细胞的捕获。

公开号为US8475730B2的专利：Apparatus for single cell seperation andposition fixing，设计了一种三层单元结构的集成微流控芯片，但是该芯片的功能主要是对单个细胞进行分离和位置定位，该芯片的缺陷是在此结构上不能再设置扩散微孔和给药腔，因此不能够实现对单细胞的批量化差异给药。

公开号为US005821073A的专利：Method and apparatus for single stepassays of whole blood，设计了一种三层单元结构集成微流控芯片，但是该集成芯片的主要功能是对血液中的细胞团以及其他物质进行分离分析，分离的不是单细胞，而是多细胞团和一些蛋白质分子团等大尺寸团状物；在设计尺度上和捕获结构不能够实现对单细胞的捕获。

公开号为WO2014066888(A1)的专利：High-Throughput Mutagenized CellScreening Systerm For Selective Single Cell Extraction，设计了一种多层单元的集成微流控芯片，但是该集成芯片的主要功能是用于筛选单个细胞，进行细胞物质的提取，并且该集成芯片内部通道的设计情况使它不能用于单细胞的培养和批量化差异给药。

目前已经公开的技术中，涉及对捕获单细胞后续培养、给药的文献资料少之又少，目前尚没有通过设计制作一种集成微流控芯片来同时实现单细胞的捕获、培养和批量化差异给药的报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述技术存在的缺陷，提供一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片及***，该芯片集成化程度高、操作简单、制作工艺成熟，能够快速精确实现对单细胞的捕获、培养和批量化差异给药。

为实现本发明目的，所采用的技术方案如下：

技术方案之一为，一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片，由自上而下依次封接的细胞捕获与培养单元、药物扩散单元和药物供给单元组成；

其中，所述的细胞捕获与培养单元包括细胞培养腔，单细胞捕获阱，微流体流入通道，微流体流出通道，流入孔和流出孔，还可以设置储液池；细胞培养腔为设置于细胞捕获与培养单元底面的凹腔，单细胞捕获阱位于细胞培养腔内，细胞培养腔两端分别与微流体流入通道和微流体流出通道相连，流入孔和流出孔分别由细胞捕获与培养单元的上表面或侧表面穿入单元，流入孔与微流体流入通道相连，流出孔与微流体流出通道相连；储液池可以设置在流入孔与微流体流入通道连接处以及流出孔与微流体流出通道连接处；

所述的单细胞捕获阱为柱体，在柱体面向流体流入方向开有凹槽，凹槽为U型或矩形槽，槽体的尺寸为仅能够容纳一个细胞，在柱体上开有贯穿柱体的缝隙，缝隙为1-3个较好；多个单细胞捕获阱分别沿X和Y方向排列形成单细胞捕捉阱阵列，较好的行数为100～200，较好的列数为100～200；微流体流入通道和微流体流出通道可以是水平布置的直通道，也可以是弯曲的蛇形通道；较好的设计是，在微流体流入通道内靠近细胞培养腔一端设有多个竖直的圆柱体形成的阵列做为预混区，其作用在于，将流入的细胞团打散成单个细胞；储液池较好的为圆柱形；

所述的药物扩散单元上竖直分布有多个微孔通道，分别沿X和Y方向排列形成微孔阵列，较好的，微孔通道位于细胞捕获阱凹槽的水平正下方；可将微孔通道设置成相同或不同直径；

所述的药物供给单元包括给药槽、药物流入通道，药物流出通道，药物流入孔和药物流出孔；给药槽为设置于药物供给单元上表面的凹槽，位于微孔阵列的下方，两端分别与药物流入通道和药物流出通道相连；药物流入通道和药物流出通道分别与药物流入孔和药物流出孔相连；药物流入孔和药物流出孔可以经细胞捕获与培养单元和药物扩散单元穿入药物供给单元或由药物供给单元的侧表面穿入；还可以在药物流入通道与药物流入孔连接处以及药物流出通道与药物流出孔连接处设置储药池；

给药槽、储药池、药物流入通道和药物流出通道以及药物流入孔和药物流出孔可以是一个或多个；给药时，可以由多个药物流入孔和多个药物流入通道输送不同浓度的药物到多个给药槽，也可以由一个流入孔和多个药物流入通道输送至多个给药槽，还可以一个流入孔和一个药物流入通道输送至一个给药槽，或者其它的组合形式；药物流入和流出通道可以是水平布置的直通道，也可以是弯曲的蛇形通道；储液池较好的为圆柱形。

通过上述集成微流控芯片给药时，在相同时间内不同直径的微孔通道输入到单细胞捕捉阱内的药液体积不同，从而实现了批量化差异给药；或者将微孔通道设置成相同直径，通过设置不同的药液供给时间，实现不同时间的差异性给药；或者将微孔通道设置成相同直径，由不同的给药槽分别供给不同的药液，实现不同药液的差异性给药；或者其他组合形式。

所述集成微流控芯片的材料为常用的透明有机聚合物材料、能够满足开孔的强度要求且材料本身的性质不会影响单细胞的生理性能，比如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)以及水凝胶等，优选聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

技术方案之二为，一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片***，包括，

上述的用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片；

荧光显微镜，用于观察芯片内单细胞捕获阱阵列中的细胞是否有荧光并获取图像；

图像处理***，例如二维、三维粒子图像测速***，用于分析所述荧光显微镜获取的图像；

数字注射泵，连接所述微流控芯片的流入孔，以驱动细胞悬浮液、细胞培养液、药液等微流体的流动。

技术方案之三为，一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：

1)细胞捕获与培养单元：采用N型硅片，把硅片清洗干净，采用湿法氧化，在硅片表面生成一层氧化层，在其表面均匀的涂上SU-8光刻胶，将掩膜板放在均匀的光刻胶上面，采用紫外线曝光技术光刻出细胞培养腔、单细胞捕获阵列、微流体流入和流出通道、预混区圆柱体、储液池等平面形状；再使用半导体领域常用的ICP干法(感应等离子刻蚀)或湿法(刻蚀液刻蚀)刻蚀出凹槽；将液态的芯片材料倒入槽中，待其凝固后脱模取出切成长方形小片，得到细胞捕获与培养单元；

2)药物扩散单元：采用N型硅片，把硅片清洗干净，采用湿法氧化，在硅片表面生成一氧化层，在其表面均匀的涂上SU-8光刻胶，将掩膜板放在均匀的光刻胶上面，采用紫外线曝光技术光刻出扩散微孔通道阵列的平面形状；再使用半导体领域常用的ICP干法(感应等离子刻蚀)或湿法(刻蚀液刻蚀)刻蚀出凹槽；将液态的芯片材料倒入槽中，待其凝固后脱模取出切成长方形小片，得到药物扩散单元；

3)药物供给单元：采用N型硅片，把硅片清洗干净，采用湿法氧化，在硅片表面生成一层氧化层，在其表面均匀涂上SU-8光刻胶，将掩膜板放在均匀的光刻胶上面，采用紫外线曝光技术光刻出给药槽和药物流入和流出通道以及储液池的平面图形；再使用半导体领域常用的ICP干法(感应等离子刻蚀)或湿法(刻蚀液刻蚀)刻蚀出凹槽，将液态的芯片材料倒入槽中，待其凝固后脱模取出切成长方形小片，得到药物供给单元；

4)封接键合：分别处理细胞捕获与培养单元的下表面、药物扩散单元的上下表面、药物供给单元的上表面，将它们依次通过紫外线照射、真空中氧等离子体或固化胶粘合等方法键合，最终获得完整的微流控集成芯片；

5)打孔：使用打孔器在细胞捕获与培养单元以及药物供给单元上打出流入孔和流出孔以及药物流入孔和流出孔；

上述一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片的制备方法中的芯片材料为常用的透明有机聚合物材料、能够满足开孔的强度要求且材料本身的性质不会影响单细胞的生理性能，比如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)以及水凝胶等，优选聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明在一块集成微流控芯片上实现了对单细胞的捕获、培养和批量化差异给药，不仅集三种功能于一身，而且有效地避免了片外操作和试样转移过程中的污染。

2、本发明实现了对样品的高通量快速处理：本发明以微制造技术为基础，利用PDMS等材料，制作了可以容纳单个细胞的捕获阱阵列，能够实现单细胞的高通量捕获；此外，本发明是集成的微流控芯片，实验中所需的样品使用量少、反应速度快、操作简便。

3、本发明在设计上采用三层单元结构，在现有微制造技术条件下，制作工艺比较简单，易于加工；另外，本发明将细胞捕获与培养单元作为第一层、将药物扩散单元单独作为第二层、将药物供给单元作为第三层，每一层分工明确，各层之间具有良好的兼容性。

4、本发明的微流控芯片适用范围广，细胞捕获与培养单元中捕获阱的尺寸可以根据不同的细胞进行调整，如果需要用于尺寸差异很大的细胞，只需要加工不同尺寸的捕获阱即可。

5、本发明的单细胞捕获是通过设置水平方向开双缝的流式捕获阱来实现的，靠的是流体的水平剪切力驱动，具有易于实现单细胞快速捕获、对单细胞损伤较小、可控性较高、操作方便、准确高效的优点。

综上所述，本发明通过微制造加工技术和微流控技术，开发了一种多层微流控集成芯片，实现了对细胞悬浮液中单细胞的捕获、培养和差异性给药；为单细胞的给药研究提供了一种有效的实现途径，能够更高效、更准确、更高通量的实现单细胞的差异性给药过程。

附图说明

图1为本发明微流控芯片的总体结构示意图；

其中，1、细胞捕获与培养单元，2、药物扩散单元，3、药物供给单元；

图2为本发明微流控芯片的细胞捕获与培养单元的仰视图；

其中，H为单细胞捕获阱阵列的微观局部的放大图，单细胞捕获阱沿着X-Y方向形成阵列；101、细胞培养腔，102、单细胞捕获阱，103、微流体流入通道，104、微流体流出通道，105、流入孔，106、流出孔，107、储液池，110、单细胞捕捉阱阵列，112、预混区，34、药物流入孔，35、药物流出孔；

图3为本发明微流控芯片的药物扩散单元的俯视图；

其中，I为微孔阵列的微观局部的放大图，微孔通道沿着X-Y方向形成阵列；21、微孔通道，22、微孔阵列；

图4为本发明微流控芯片的药物供给单元的俯视图；

其中，31、给药槽，32、药物流入通道，33、药物流出通道，36、储药池；

图5为细胞捕获与培养单元的预混区示意图；

其中，图5A为预混区沿图1的A-A’方向的剖视图，图5B为图5A沿C-C’方向的剖视图；111、圆柱体；

图6为细胞培养腔与药物扩散单元结合面微观局部的放大示意图；

其中，图6A为细胞培养腔与药物扩散单元结合面沿图1的B-B’方向的剖视图；图6B为图6A沿D-D’方向的剖视图；108、凹槽，109、缝隙。

具体实施方式

实施例1

一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片，由自上而下依次封接的细胞捕获与培养单元1、药物扩散单元2和药物供给单元3组成；

其中，所述的细胞捕获与培养单元包括有细胞培养腔101，单细胞捕获阱102，微流体流入通道103，微流体流出通道104，流入孔105和流出孔106，还可以设置储液池107；细胞培养腔101为设置于细胞捕获与培养单元1底面的凹腔，单细胞捕获阱102位于细胞培养腔101内，细胞培养腔101两端分别与微流体流入通道103和微流体流出通道104相连，流入孔105和流出孔106分别由细胞捕获与培养单元1的上表面或侧表面穿入单元内，流入孔105与微流体流入通道103相连，流出孔106与微流体流出通道104相连；储液池107可以设置在流入孔105与微流体流入通道103连接处以及流出孔106与微流体流出通道104连接处；

细胞捕获与培养单元1高5-10毫米，较好的为长方体，长20-30毫米，宽7.5-15毫米；所述细胞培养腔101较好的为长方形凹槽，深度为10～100微米，较好的为10～30微米；所述单细胞捕获阱102为柱体，高度与细胞培养腔101的深度相同，为10～100微米，较好的为10～30微米，长度为50～100微米，宽度为50～100微米，在柱体面向流体流入方向开有凹槽108，凹槽为U型槽或矩形槽，槽体的尺寸为仅能够容纳一个细胞，较好的，U型槽口开口宽度10-20微米，深度10-20微米，矩形槽为边长10-20微米的矩形，在柱体上开有贯穿柱体的缝隙109，缝隙为1-3个较好；多个单细胞捕获阱102分别沿X和Y方向排列形成单细胞捕捉阱阵列110，行数为100～200，列数为100～200，行间距为20～100微米，列间距为20～100微米；微流体流入通道103和流出通道104可以是水平布置的直通道，也可以是弯曲的蛇形通道，通道的宽度为10～100微米，高度为10～100微米；在流入通道103内靠近细胞培养腔101一端设有多个竖直的圆柱体111形成的阵列做为预混区112，圆柱半径为2～10微米，高度为10～100微米，行数为3～8，列数为8～20，行间距和列间距均为20～80微米，其作用在于，将流入的细胞团打散成单个细胞；储液池107为圆柱形，半径为500～1000微米，高度为10～100微米；流入孔105与流出孔106的孔径为100～500微米；

所述的药物扩散单元2上竖直分布有多个微孔通道21，分别沿X和Y方向排列形成微孔阵列22，较好的，微孔通道21位于细胞捕获阱102的凹槽108水平正下方；药物扩散单元2高度为10～100微米，较好的为长方体，长宽同细胞捕获与培养单元1；微孔通道21的孔径必须要小于单个细胞的直径，这样细胞才不会从微孔中落入药物腔体内，较好的，微孔通道21为直径0.5～6微米的圆孔或者为长度、宽度分别为0.5～6微米的矩形孔；可将微孔通道21设置成相同或不同直径；

所述的药物供给单元3包括给药槽31，药物流入通道32，药物流出通道33，药物流入孔34和药物流出孔35；给药槽31为设置于药物供给单元3上表面的凹槽，位于微孔阵列的下方，两端分别与药物流入通道32和药物流出通道33相连；药物流入通道32和药物流出通道33分别与药物流入孔34和药物流出孔35相连；药物流入孔34和流出孔35可以经细胞捕获与培养单元1和药物扩散单元2穿入药物供给单元3或由药物供给单元3的侧表面穿入；还可以在药物流出通道与药物流出孔连接处以及药物流入通道与药物流入孔连接处设置储药池36；

药物供给单元3高为5-10毫米，可以为长方体，长宽同细胞捕获与培养单元1；给药槽31、药物流入通道32、药物流出通道33、药物流入孔34、药物流出孔35以及储药池36可以是一个或多个；给药时，可以由多个药物流入孔34和多个药物流入通道32输送不同浓度的药物到多个给药槽31，也可以由一个流入孔34和多个药物流入通道32输送至多个给药槽31，还可以一个流入孔34和一个药物流入通道32输送至一个给药槽31，或者其它的组合形式；储药池36可按需设置多个；

给药槽31总长度和总宽度分别大于等于细胞培养腔101的长度和宽度；药物流入和流出通道可以是水平布置的直通道，也可以是弯曲的蛇形通道，通道的宽度为10～100微米，深度为10～100微米；药物流入孔与流出孔的圆形孔径为100～500微米；储药池36为圆柱形，半径为500～1000微米，高度为10～100微米。

当使用集成微流控芯片进行单细胞捕获时，预先设置细胞捕获与培养单元1内部的压力略小于药物供给单元3内部的压力，在此前提下，流入孔105和流出孔106分别为细胞悬浮液或者细胞培养液的流入口和流出口，细胞悬浮液由流入孔105流入，经储液池107和微流体流入通道103，在预混区112中将细胞悬浮液中的细胞团打散成单个细胞，然后进入细胞培养腔101，由于捕获阱为水平方向开缝的流式捕获阱，靠的是流体的水平剪切力驱动，使细胞悬浮液中的细胞被细胞培养腔101中的单细胞捕获阱102形成的单细胞捕捉阱阵列110捕获，单细胞留在了凹槽108中，液体通过缝隙109和单细胞捕获阱间的通道流到微流体流出通道104，再由流出孔106排出，完成细胞捕获。

当使用集成微流控芯片进行单细胞培养时，预先设置细胞捕获与培养单元1内部的压力略小于药物供给单元3内部的压力，在此前提下，流入孔105停止输送细胞悬浮液，改为输送细胞培养液，使细胞培养腔101中充满培养液，定期更换培养液，即可实现单细胞的长期培养；

当使用集成微流控芯片进行进行单细胞给药实验时，给药方式有多种，可以选择如下方式中的一种：

1)将微孔通道21设置成不同直径，微孔通道21与单细胞捕捉阱102一一对应；将药液从药物流入孔34流入，经药物流入通道33进入给药槽31，试通一段时间待流量达到稳定状态后，阻塞流出孔35；由于压力作用，药液由给药槽31通过微孔通道21进入其对应的单细胞捕捉阱102，并且在相同时间内不同直径的微孔通道21输入到其对应的单细胞捕捉阱102内的药液体积不同，从而实现了批量化浓度差异给药；

2)将微孔通道21设置成相同或不同直径，微孔通道21与单细胞捕捉阱102一一对应；药物流入孔34，药物流入通道33和给药槽31为多个，且一个药物流入孔34对应一个药物流入通道33和一个给药槽31；将药液分别在不同时间从不同的药物流入孔34流入，经药物流入通道33进入给药槽31，试通一段时间待流量达到稳定状态后，阻塞流出孔35；或者将药液同时从不同的药物流入孔34流入，经药物流入通道33进入给药槽31，试通一段时间待流量达到稳定状态后，分别在不同时间阻塞流出孔35；由于压力作用，药液由给药槽31通过微孔通道21进入其对应的单细胞捕捉阱102，因为给药时间的不同或者阻塞流出孔35时间的先后，药液经微孔通道21输入到单细胞捕捉阱102内的时间有差异，产生了不同的药液供给时间，从而实现批量化时间差异性给药；

3)将微孔通道21设置成相同或不同直径，微孔通道21与单细胞捕捉阱102一一对应；药物流入孔34，药物流入通道33和给药槽31为多个，且一个药物流入孔34对应一个药物流入通道33和一个给药槽31；由不同的药物流入孔34分别供给不同的药物，将药液从药物流入孔34流入，经药物流入通道33进入给药槽31，试通一段时间待流量达到稳定状态后，阻塞流出孔35；由于经微孔通道21输入到单细胞捕捉阱102内的药液种类不同，从而实现批量化药物种类差异性给药；

4)将微孔通道21设置成相同直径，一些微孔通道21与单细胞捕捉阱102一一对应，还有一些微孔通道21位于几个单细胞捕捉阱102中心线的下方；给药时，将药液从药物流入孔34流入，经药物流入通道33进入给药槽31，试通一段时间待流量达到稳定状态后，阻塞流出孔35；由于压力作用，微孔通道21与单细胞捕捉阱102一一对应的，可以直接将药液由给药槽31通过微孔通道21进入其对应的单细胞捕捉阱102内，然而一些微孔通道21位于几个单细胞捕捉阱102中心线的下方，药液由给药槽31通过微孔通道21进入细胞培养槽后需要通过扩散作用进入到这些单细胞捕捉阱102中，这样使得每个单细胞捕捉阱102中的药物浓度不同，从而实现批量化浓度差异性给药；

5)其他组合方式。

从而实现了单细胞的批量化差异给药，并将单细胞的捕获、培养和批量化差异给药集成在了一块微流控芯片上。

实施例2

一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片，由自上而下依次封接的细胞捕获与培养单元1、药物扩散单元2和药物供给单元3组成；

细胞捕获与培养单元1为长方体，长30毫米，宽10毫米，高10毫米；细胞培养腔101为长度12毫米，宽度8毫米，深度16微米的矩形凹腔；单细胞捕获阱102为柱体，高度16微米，长度为50微米，宽度为50微米，在柱体面向流体流入方向开有凹槽108，凹槽为U型槽，U型槽口开口宽度16微米，深度16微米，在凹槽108槽底开有贯穿柱体的缝隙109，缝隙为2个；10000个单细胞捕获阱12分别沿X和Y方向排列形成单细胞捕捉阱阵列110，行数为100，列数为100，行间距为20微米，列间距为50微米；微流体流入通道103和流出通道104为水平布置的直通道，通道的宽度为50微米，高度为16微米；在流入通道103内靠近细胞培养腔101一端设有多个竖直的圆柱体111形成阵列做为预混区112，圆柱半径为2微米，高度为16微米，行数为3，列数为10，行间距和列间距均为80微米，其作用在于，将流入的细胞团打散成单个细胞；储液池107为圆柱形，半径为600微米，高度为16微米；流入孔105与流出孔106的孔径为500微米；

所述的药物扩散单元2为长方体，长宽同细胞捕获与培养单元1，高度为40微米；药物扩散单元2上竖直分布有10000个微孔通道21，分别沿X和Y方向排列形成100行×100列的微孔阵列22，每个微孔通道21都位于每个细胞捕获阱102的凹槽108水平正下方；微孔通道21的孔径必须要小于单个细胞的直径，这样细胞才不会从微孔中落入药物腔体内；为了实现批量化差异给药，将100行微孔通道21依次划分为5个区域，每个区域包含20行，对应的扩散微孔直径分别为0.5微米、1微米、2微米、3微米和4微米，微孔通道21的高度均为40微米；

药物供给单元3为长方体，长宽同细胞捕获与培养单元1，高为5毫米；给药槽31、药物流入通道32和药物流出通道33均为5个，药物流入孔34和药物流出孔35为1个；药物流入通道32和药物流出通道33为直通道，通道的宽度为50微米，高度为40微米；每个给药槽31的长度等于细胞培养腔101的长度12毫米，宽度等于细胞培养腔101宽度的1/5为1.6毫米；

其它部分同实施例1。

实施例3

微孔通道21的直径相同，给药槽31，药物流出通道32，药物流入通道33，药物流入孔34和药物流出孔35为多个；由不同药物流入孔34和药物流入通道33输送不同种类的药物到多个给药槽31，其他同实施例1。

实施例4

一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片***，包括，

实施例1所述的用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片；

荧光显微镜，为日本尼康Ti-s型生物荧光倒置显微镜，用于观察芯片的单细胞捕获阱阵列中的细胞是否有荧光并获取图像；

图像处理***，为北京立方天地科技有限公司生产的DM3-16M500型三维PIV***，用于分析所述荧光显微镜获取的图像；

以及数字注射泵，为瑞创RSP04-B四通道推拉模式注射泵，连接所述微流控芯片的流入孔，以驱动细胞液、细胞培养液、药液等微流体的流动。

***使用时，首先利用数字注射泵向芯片内注入细胞悬浮液，稳定通入一段时间，芯片捕获到细胞后，停止注入细胞悬浮液；然后利用数字注射泵向芯片内注入细胞培养液，连续灌输，将捕获的单细胞于微流控芯片中培养1～48h后，再通过数字注射泵向芯片内注入含有荧光探针的细胞培养液以标记和显示细胞表面分子，最后通过数字注射泵加入药物，并通过荧光显微镜和图像处理设备观察检测加药前后细胞表面荧光强度，来确定分析不同浓度的药物对细胞的药效。

实施例5

制备芯片：

1)细胞捕获与培养单元：采用N型4英寸硅片，把硅片清洗干净，采用湿法氧化，在硅片表面生成一层0.5-0.8微米厚的氧化层，在其表面均匀的涂上一层SU-8光刻胶，将掩膜板放在均匀的光刻胶上面，采用紫外线曝光技术光刻出细胞培养腔、单细胞捕获阵列、微流体流入和流出通道、预混区圆柱体、储液池等平面形状；再使用半导体领域常用的ICP干法(感应等离子刻蚀)或湿法(刻蚀液刻蚀)刻蚀出10-100微米深的凹槽，将液态的芯片材料PDMS倒入槽中，待其凝固后脱模取出按照长20-30毫米，宽7.5-15毫米，高5-10毫米的外形尺寸切成长方形小片，得到细胞捕获与培养单元；

2)药物扩散单元：采用N型4英寸硅片，把硅片清洗干净，采用湿法氧化，在硅片表面生成一层0.4-1.0微米厚的氧化层，在其表面均匀的涂上一层SU-8光刻胶，将掩膜板放在均匀的光刻胶上面，采用紫外线曝光技术光刻出扩散微孔通道阵列的平面形状；再使用半导体领域常用的ICP干法(感应等离子刻蚀)或湿法(刻蚀液刻蚀)刻蚀出10-100微米深的凹槽，将液态的芯片材料倒入槽中，待其凝固后脱模取出按照长20-30毫米，宽7.5-15毫米，高度为40-100微米的外形尺寸切成长方形小片，得到药物扩散单元；

3)药物供给单元：采用N型4英寸硅片，把硅片清洗干净，采用湿法氧化，在硅片表面生成一层0.5微米厚的氧化层，在其表面均匀涂上一层SU-8光刻胶，将掩膜板放在均匀的光刻胶上面，采用紫外线曝光技术光刻出给药槽和药物流入和流出通道以及储液池的平面图形；再使用半导体领域常用的ICP干法(感应等离子刻蚀)或湿法(刻蚀液刻蚀)刻蚀出10-100微米深的凹槽，将液态PDMS倒入槽中，待其凝固后脱模取出按照长20-30毫米，宽7.5-15毫米，高5-10毫米的外形尺寸切成长方形小片，得到药物供给单元；

4)封接键合：微流控芯片的键合可以采用紫外线照射、真空中氧等离子体以及采用固化胶粘合等方法，分别处理细胞捕获与培养单元的下表面、药物扩散单元的上下表面、药物供给单元的上表面，将它们依次键合，最终获得完整的微流控集成芯片；

5)打孔：在细胞捕获与培养单元表面使用打孔器分别打出细胞捕获和培养单元以及药物供给单元的流入孔和流出孔以及药物流入孔和流出孔。

Claims (9)

1.一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片，其特征在于，由自上而下依次封接的细胞捕获与培养单元、药物扩散单元和药物供给单元组成；

其中，所述的细胞捕获与培养单元包括细胞培养腔，单细胞捕获阱，微流体流入通道，微流体流出通道，流入孔和流出孔；细胞培养腔为设置于细胞捕获与培养单元底面的凹腔，单细胞捕获阱位于细胞培养腔内，细胞培养腔两端分别与微流体流入通道和微流体流出通道相连，流入孔和流出孔分别由细胞捕获与培养单元的上表面或侧表面穿入单元，流入孔与微流体流入通道相连，流出孔与微流体流出通道相连；

所述的药物扩散单元上竖直分布有多个微孔通道，分别沿X和Y方向排列形成微孔阵列；

所述的药物供给单元包括给药槽，药物流入通道，药物流出通道，药物流入孔和药物流出孔；给药槽为设置于药物供给单元上表面的凹槽，位于微孔阵列的下方，两端分别与药物流入通道和药物流出通道相连；药物流入通道和药物流出通道分别与药物流入孔和药物流出孔相连；药物流入孔和药物流出孔经细胞捕获与培养单元和药物扩散单元穿入药物供给单元或由药物供给单元的侧表面穿入。

2.根据权利要求1所述的一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片，其特征在于，所述的细胞捕获与培养单元还包括设置在流入孔与微流体流入通道连接处以及流出孔与微流体流出通道连接处的储液池；所述药物供给单元还包括设置在药物流出通道与药物流出孔连接处以及药物流入通道与药物流入孔连接处的储药池。

3.根据权利要求1所述的一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片，其特征在于，所述的单细胞捕获阱为柱体，在柱体面向流体流入方向开有凹槽，在柱体上开有贯穿柱体的缝隙；多个单细胞捕获阱分别沿X和Y方向排列形成单细胞捕获阱阵列。

4.根据权利要求1所述的一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片，其特征在于，在所述的微流体流入通道内靠近细胞培养腔一端设有多个竖直的圆柱体形成的阵列做为预混区。

5.根据权利要求3所述的一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片，其特征在于，所述微孔通道位于细胞捕获阱凹槽的水平正下方；微孔通道直径相同或不同。

6.根据权利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于，所述芯片材料为聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯或水凝胶。

7.根据权利要求3所述的一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片，其特征在于，所述单细胞捕获阱的凹槽为U型或矩形槽，槽体的尺寸为仅能够容纳一个细胞；所述贯穿柱体的缝隙为1～3个。

8.一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片的***，其特征在于，包括根据权利要求1所述的集成微流控芯片，荧光显微镜，图像处理***以及数字注射泵。

9.根据权利要求1所述的一种用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)制备细胞捕获与培养单元：采用N型硅片，将硅片清洗干净，采用湿法氧化，在硅片表面生成一层氧化层，在其表面均匀的涂上SU-8光刻胶，将掩膜板放在均匀的光刻胶上面，采用紫外线曝光技术光刻出细胞培养腔、单细胞捕获阵列、微流体流入和流出通道、预混区圆柱体、储液池平面形状；再使用半导体领域常用的ICP干法或湿法刻蚀出凹槽；将液态的芯片材料倒入槽中，待其凝固后脱模取出切成长方形小片，得到细胞捕获与培养单元；

2)制备药物扩散单元：采用N型硅片，将硅片清洗干净，采用湿法氧化，在硅片表面生成一层氧化层，在其表面均匀的涂上SU-8光刻胶，将掩膜板放在均匀的光刻胶上面，采用紫外线曝光技术光刻出扩散微孔通道阵列的平面形状；再使用半导体领域常用的ICP干法或湿法刻蚀出凹槽；将液态的芯片材料倒入槽中，待其凝固后脱模取出切成长方形小片，得到药物扩散单元；

3)制备药物供给单元：采用N型硅片，将硅片清洗干净，采用湿法氧化，在硅片表面生成一层氧化层，在其表面均匀的涂上SU-8光刻胶，将掩膜板放在均匀的光刻胶上面，采用紫外线曝光技术光刻出给药槽、药物流入和流出通道以及储液池的平面图形；再使用半导体领域常用的ICP干法或湿法刻蚀出凹槽，将液态的芯片材料倒入槽中，待其凝固后脱模取出切成长方形小片，得到药物供给单元；

4)封接键合：分别处理细胞捕获与培养单元的下表面、药物扩散单元的上下表面、药物供给单元的上表面，将它们依次通过紫外线照射、真空中氧等离子体或固化胶粘合方法键合，最终获得完整的微流控集成芯片；

5)打孔：使用打孔器在细胞捕获与培养单元以及药物供给单元上打出流入孔和流出孔以及药物流入和流出孔。