CN104508129A - 设计的与血小板衍生生长因子结合的锚蛋白重复序列蛋白 - Google Patents

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Abstract

描述了具有与PDGF-BB的结合特异性的新设计的锚蛋白重复蛋白以及编码这类PDGF结合蛋白的核酸，包含这类蛋白的药物组合物以及这类蛋白质在治疗疾病中的用途。

Description

设计的与血小板衍生生长因子结合的锚蛋白重复序列蛋白
技术领域
本发明涉及设计的具有与血小板衍生生长因子(PDGF)的结合特异性的锚蛋白重复蛋白，以及编码这类PDGF结合蛋白的核酸序列、包含这类蛋白质的药物组合物和这类蛋白质治疗疾病的用途。
背景技术
血小板衍生生长因子(PDGF)在三十多年前被确认为成纤维细胞、平滑肌细胞和神经胶质细胞的血清生长因子。最近的综述中(Andrae,J.,Gallini,R.和Betsholtz,C.,Genes Dev.,22,1276-1312,2008)广泛描述了它在生理学和医学上的作用。人PDGF最初被确定为二硫键连接的两条不同肽链(A(PDGF-A；人PDGF-A具有UniProtKB/Swiss-Prot编号P04085)和B(PDGF-B；人PDGF-B具有UniProtKB/Swiss-Prot编号P01127))的二聚体。因此，可以形成三种蛋白质二聚体：PDGF-AA、PDGF-AB和PDGF-BB。最近，鉴定了两种额外的PDGF多肽链，PDGF-C和PDGF-D。目前已知的PDGF基因和多肽属于结构和功能相关的生长因子家族，其也包括血管内皮生长因子(VEGF)。PDGF/VEGF生长因子在整个动物界是保守的。
PDGF通过两种具有共同域结构的受体酪氨酸激酶(RTK)，PDGF受体(PDGFR)α(PDGFRα)和β(PDGFRβ)，起作用，其包括5个细胞外免疫球蛋白(Ig)环和***的细胞内酪氨酸激酶结构域。VEGF通过不同的但结构相关的RTK亚家族起作用。配体结合促进受体二聚化，这启动信号传导。取决于配体的构造和受体表达的模式，可以形成不同的受体二聚体。然而，在体内似乎只有少数的相互作用似乎是相关的；即，经由PDGFRα的PDGF-AA和PDGF-CC，及经由PDGFRβ的PDGF-BB的那些相互作用。
PDGF在发育过程中有关键作用，但在成人中对于正常生理功能证据有限。动物发育中PDGF和PDGFR的研究揭示了PDGFRα信号传导在原肠胚形成以及在脑和心神经嵴、生殖腺、肺、肠、皮肤、中枢神经***和骨骼发育中的作用。相似地，确定了PDGFRβ信号传导在血管形成和早期造血中的作用。PDGF信号传导牵涉广泛疾病。PDGF信号传导途径的自分泌激活与某些胶质瘤、肉瘤和白血病相关。通常在上皮细胞癌中观察到旁分泌的PDGF信号传导，其中它触发了基质募集(stromal recruitment)且可能参与上皮-间质转变，从而影响肿瘤生长、血管形成、侵袭和转移。PDGF驱动血管障碍(例如动脉粥样硬化、再狭窄、肺动脉高血压和视网膜疾病)以及纤维化疾病(包括肺纤维化、肝硬化、硬皮病、肾小球硬化和心脏纤维化)中的病理间质反应。
因此，提高的PDGF活性已经与几种疾病和病理状况关联。对于某些疾病已经确认了PDGF的致病性作用，为使用PDGF拮抗剂例如PDGF特异性抗体的治疗提供了前景。此外，已表明抗VEGF和抗PDGF剂的组合对于治疗某些眼部新生血管疾病有协同治疗效益(WO 2005/020972；Jo,N.,Mailhos,C.,Ju,M.,Cheung,E.,Bradley,J.,Nishijima,K.,Robinson,G.S.,Adamis,A.P.和Shima,D.T.,Am.J.Pathol.,168(6),2036-2053,2006)。
除了抗体，还有可以用于特异性结合目标分子(例如Binz,H.K.,Amstutz,P.和Plückthun,A.,Nat.Biotechnol.23,1257-1268,2005)从而作为拮抗剂发挥作用的新的结合蛋白或结合结构域。不具有Fc的一个这样的新型结合蛋白或结合结构域是基于设计的重复蛋白或设计的重复结构域(WO 2002/020565；Binz,H.K.,Amstutz,P.,Kohl,A.,Stumpp,M.T.,Briand,C.,Forrer,P.,Grütter,M.G.和Plückthun,A.,Nat.Biotechnol.22,575-582,2004；Stumpp,M.T.,Binz,H.K和Amstutz,P.,Drug Discov.Today 13,695-701,2008)。WO2002/020565描述了可以如何构建大的重复蛋白库以及其一般应用。然而，WO2002/020565既没有公开对PDGF-BB的结合特异性的重复结构域的选择，也没有公开特异性结合PDGF-BB的重复结构域的具体重复模块或重复序列基序。并且，WO2002/020565没有启示具有对PDGF-BB的结合特异性的重复结构域可以用于调控PDGF-BB介导的信号传导途径以成功治疗疾病。这些设计的重复结构域利用重复蛋白的模块化性质且可以具有N-末端和C-末端加帽(capping)模块以通过屏蔽结构域的疏水核心而防止设计的重复结构域聚集(Forrer,P.,Stumpp,M.T.,Binz,H.K.和Plückthun,A.,FEBS letters 539,2-6,2003)。
本发明的技术问题是鉴别通过特异性结合PDGF-BB来调控PDGF-BB介导的信号传导途径从而改善某些癌症、血管疾病(如视网膜疾病)、纤维化疾病和其他病理状况的治疗的新型结合蛋白(例如锚蛋白重复蛋白或结构域)。通过提供权利要求中表征的实施方案获得了这个技术问题的解决方案。
发明概述
本发明涉及一种包含至少一个锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中与PDGF-BB结合的Kd小于10-7M。
更特别地，本发明涉及一种包含至少一个锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域与选自SEQ ID NO：23-60的锚蛋白重复结构域竞争结合PDGF-BB，或其中所述锚蛋白重复结构域选自SEQ ID NO：23-60，其中所述锚蛋白重复结构域的位置1的G和/或位置2的S任选地缺失，且所述锚蛋白重复结构域的倒数第二位置的L和/或最后位置的N任选地被A置换。
在进一步的实施方案中，本发明涉及一种包含至少一个锚蛋白重复结构域的重组PDGF-BB结合蛋白，其包含有选自SEQ ID NO：12、14、15、17、18和19及其中SEQ ID NO：12、14、15、17、18和19中最多9个氨基酸被任意氨基酸置换的序列的氨基酸序列的锚蛋白重复模块。
特别地，本发明涉及一种包含序列SEQ ID NO：12-19和23-61中任一种的多肽的重组PDGF-BB结合蛋白。
本发明还涉及编码本发明的结合蛋白的核酸分子，和涉及包含一种或多种上述结合蛋白或核酸分子的药物组合物。
本发明还涉及用本发明的结合蛋白治疗病理状况的方法。
附图简要说明
图1.NHI-3T3成纤维细胞增殖的抑制
显示了各种浓度的具有对PDGF-BB的特异性的DARPin(以DARPin#49为例)对NIH-3T3成纤维细胞增殖的抑制以及相应的拟合抑制曲线。然后从该拟合抑制曲线计算出DARPin#49的IC50值是1.9nM。
OD：在450nm下的光密度；C：DARPin#49的浓度(nM)；D1：DARPin#49。X轴以对数刻度显示。DARPin#49的定义如下。
图2.PDGFRβ的竞争试验
对于独特的单一实验显示了各种浓度的具有对PDGF-BB的特异性的DARPin对PDGF-BB与PDGFRβ结合的抑制以及相应的拟合抑制曲线。然后对于DARPin#50(D1)和#28(D2)的IC50值分别计算为约20和18pM。OD：在450nm下的光密度；C：DARPin的浓度(pM)。X轴以对数刻度显示。DARPin#50和#28的定义如下。
图3.抗PDGF-BB DARPin与溶媒对脉络膜血管新生的作用
从0天直到第14天每天对小鼠腹腔内注射溶媒或DARPin#61-PEG20(即，用标准方法(例如，如WO2011/135067中所述)通过其C末端Cys残基与PEG20偶联的DARPin#61)。在第2天，用激光烧灼应用于眼睛以诱导脉络膜血管新生(CNV)且在第14天测量CNV的程度。符号代表单个眼睛和代表三个诱导的CNV位点各自的平均值。条棒代表单个组的中位值。
A：CNV的面积(mm2)；V：溶媒(即，PBS)；D1：PBS中的DARPin#61-PEG20，注射的每剂量10mg/kg；D2：PBS中的DARPin#61-PEG20，注射的每剂量1mg/kg。
发明详述
根据本发明的重组结合蛋白或结构域对哺乳动物PDGF-BB是特异性的。优选地，根据本发明的重组结合结构域对于小鼠、大鼠、狗、兔、猴或人来源的PDGF-BB是特异性的。更优选地，根据本发明的重组结合结构域对于人来源的PDGF-BB是特异性的。
术语“蛋白质”是指多肽，其中该多肽的至少部分具有或者能够通过在多肽链内和/或之间形成二级、三级或四级结构来获得特定的三维排列。如果蛋白质由两个或更多个多肽组成，单个多肽链可以非共价或共价地连接，例如通过两个多肽之间的二硫键。蛋白质的一部分(其单独地具有或能够通过形成二级或三级结构来获得特定的三维排列)被称为“蛋白质结构域”。本领域技术人员熟知此类蛋白质结构域。
在重组蛋白质、重组蛋白结构域等中所用的术语“重组”是指该多肽是采用相关领域技术人员熟知的重组DNA技术制备的。例如，编码多肽的重组DNA分子(例如通过基因合成制备)可以被克隆到细菌表达质粒(例如pQE30，Qiagen)、酵母表达质粒或哺乳动物表达质粒中。例如，当这样构建的重组细菌表达质粒被***到合适的细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli))中，该细菌可以产生由这个重组DNA编码的多肽。相应地产生的多肽被称为重组多肽。
在本发明的情况中，术语“多肽”涉及由一条或多条含有通过肽键连接的多个(例如，两个或更多个)氨基酸的链组成的分子。优选地，多肽由多于8个通过肽键连接的氨基酸组成。
术语“多肽标签”是指与多肽/蛋白质连接的氨基酸序列，其中该氨基酸序列可用于该多肽/蛋白质的纯化、检测或靶向，或其中该氨基酸序列促进多肽/蛋白质的理化性能，或其中该氨基酸序列有效应子功能。结合蛋白的单个多肽标签、部分和/或结构域可直接或通过多肽接头互相连接。这些多肽标签是本领域技术人员熟知的且完全可由本领域技术人员得到。多肽标签的例子是小多肽序列，例如His(例如SEQ ID NO：9的His标签)、myc、FLAG或Strep-标签或者部分如酶(例如像碱性磷酸酶的酶)(其允许检测该多肽/蛋白质)，或者可用于靶向的部分(例如免疫球蛋白或其片段)和/或作为效应物分子。
术语“多肽接头”是指能够连接例如两个蛋白结构域、多肽标签和蛋白结构域、蛋白结构域和非多肽部分(例如聚乙二醇)或两个序列标签的氨基酸序列。本领域技术人员已知此类额外的结构域、标签、非多肽部分和接头。专利申请WO2002/020565的说明书中提供了一系列例子。此类接头的特殊例子是可变长度的甘氨酸-丝氨酸接头和脯氨酸-苏氨酸接头，优选所述接头长度为2-24个氨基酸；更优选所述接头长度为2-16个氨基酸。SEQ ID NO：10提供了甘氨酸-丝氨酸接头的例子，和SEQ ID NO：11提供了脯氨酸-苏氨酸接头的例子。优选地，SEQ ID NO：11的脯氨酸-苏氨酸接头前接GS和/或后接GS。
术语“聚合物部分”是指蛋白质性聚合物部分或非蛋白质性聚合物部分。“蛋白质性聚合物部分”优选是没有形成稳定三级机构的多肽。蛋白质性聚合物部分的例子是(Amunix的注册商标；WO2007/103515)多肽，或如WO2008/155134中所描述的含有脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸残基的多肽。这样的蛋白质性聚合物部分可以通过利用标准的DNA克隆技术，接着标准表达和纯化来生成遗传融合多肽而与例如，本发明的结合结构域共价连接。“非蛋白质性聚合物部分”是非由多肽构成的聚合物部分。非蛋白质性聚合物部分的例子是羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。术语“PEG化的”是指PEG部分共价连接于，例如，本发明的多肽。本发明的聚合物部分可以在分子量上宽范围地变化。优选地，所述聚合物部分通过多肽接头连接到结合结构域。
在特定的实施方案中，PEG部分或任意其他非蛋白质性聚合物可以，例如，通过马来酰亚胺接头与半胱氨酸巯基偶联，使半胱氨酸通过肽接头与如本文所述的结合结构域的N-或C-末端偶联。
术语“结合蛋白”是指如下进一步详细解释的含有一个或多个结合结构域、一个或多个生物活性化合物和一个或多个聚合物部分的蛋白质。优选地，所述结合蛋白含有多达四个结合结构域。更优选地，所述结合蛋白含有多达两个结合结构域。最优选地，所述结合蛋白只含有一个结合结构域。此外，任意这类结合蛋白可以包含额外的非结合结构域的蛋白质结构域、多聚化部分、多肽标签、多肽接头和/或单一Cys残基。多聚化部分的例子是配对以提供功能性免疫球蛋白Fc结构域的免疫球蛋白重链恒定区及亮氨酸拉链或包含在两个此类多肽之间形成分子间二硫键的游离巯基的多肽。单一Cys残基可用于将其他部分与多肽偶联，例如，通过使用本领域技术人员熟知的马来酰亚胺化学作用。优选地，所述结合蛋白是重组结合蛋白。同样优选地，结合蛋白的结合结构域具有不同的靶标特异性。
术语“生物活性化合物”是指在应用于患有疾病的哺乳动物时减轻该疾病的化合物。生物活性化合物可具有拮抗性或激动性的性能，且可以是蛋白质性生物活性化合物或非蛋白质性生物活性化合物。这类蛋白质性生物活性化合物可以通过利用标准的DNA克隆技术，接着其标准表达和纯化以生成遗传融合多肽而共价连接于，例如，本发明的结合结构域。这类非蛋白质性生物活性化合物可以通过化学手段共价连接于例如本发明的结合结构域，例如通过经由马来酰亚胺接头与半胱氨酸巯基偶联，使半胱氨酸通过肽接头与如本文所述的结合结构域的N-或C-末端连接。蛋白质性生物活性化合物的例子是具有独特靶标特异性的结合结构域(通过与生长因子的结合中和生长因子)、细胞因子(例如，白细胞介素)、生长因子(例如，人生长激素)、抗体及其片段、激素(例如，GLP-1)和任何可能的蛋白质性药物。非蛋白质性生物活性化合物的例子是毒素(例如，来自ImmunoGen的DM1)、靶向GPCR的小分子、抗生素和任何可能的非蛋白质性药物。
术语“结合结构域”是指表现出与蛋白质支架相同的“折叠”(三维结构)且具有预定性质的蛋白质结构域，如下所定义的。这种结构域可通过合理的，或更为普遍地，组合蛋白质工程技术(其为本领域已知的技能)(Binz等,2005,loc.cit.)获得。例如，具有预定性质的结合结构域可以通过包含以下步骤的方法获得：(a)提供与如下进一步定义的蛋白质支架表现出相同折叠的蛋白质结构域的多样化集合；和(b)筛选所述多样化集合和/或从所述多样化集合中选择以获得至少一个具有所述预定性质的蛋白质结构域。蛋白质结构域的多样化集合可以基于所用的筛选和/或选择***通过多种方法提供，且可包括使用本领域技术人员熟知的方法，例如噬菌体展示或核糖体展示。优选地，所述结合结构域是重组结合结构域。
术语“蛋白质支架”是指带其中可高度耐受氨基酸***、置换或缺失的暴露表面区域的蛋白质。可用于生成本发明的结构结构域的蛋白质支架的实例有抗体及其片段(如单链Fv或Fab片段)、来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白质A、来自菜粉蝶(Pierisbrassicae)的胆汁三烯结合蛋白或其他脂笼蛋白质、锚蛋白重复蛋白或其他重复蛋白及人纤连蛋白。本领域技术人员熟知蛋白质支架(Binz等,2005,loc.cit.；Binz等,2004,loc.cit.)。
术语“靶标”是指单个分子例如核酸分子、多肽或蛋白质、碳水化合物或任意其他天然存在的分子，包括这类单个分子的任意部分或两个或更多个这类分子的复合物。靶标可以是完整的细胞或组织样品，或者可以是任意非天然分子或部分。优选地，靶标是天然存在的或非天然的多肽或含有化学修饰(例如被天然的或非天然的磷酸化、乙酰化或甲基化修饰)的多肽。在本发明的特殊应用中，靶标是PDGF-BB。
术语“预定性质”是指如与靶标结合、阻断靶标、靶标介导反应的激活、酶促活性的性质，及相关的其他性质。根据所需性质的类型，普通技术人员将能够识别进行筛选和/或选择具有所需性质的结合结构域的形式和必要步骤。优选地，所述预定性质是指与靶标的结合。
下面对重复蛋白的定义是基于专利申请WO2002/020565中的那些。专利申请WO2002/020565还包括了对重复蛋白特征、技术和应用的一般描述。
术语“重复蛋白”是指包含一个或多个重复结构域的蛋白质。优选地，每一个所述的重复蛋白包括多达四个重复结构域。更优选地，每一个所述的重复蛋白包括多达两个重复结构域。最优选地，每一个所述的重复蛋白只包括一个重复结构域。此外，所述重复蛋白可包含额外的非重复蛋白结构域、多肽标签和/或多肽接头。
术语“重复结构域”是指包含两个或更多个连续重复单元(模块)作为结构单元的蛋白质结构域，其中所述结构单元有相同折叠，且紧密堆叠以形成具有联合疏水核心的超螺旋结构。优选地，重复结构域还包含N-末端和/或C-末端加帽单元(或模块)。甚至更为优选地，所述N-末端和/或C-末端加帽单元(或模块)是加帽重复。
术语“设计的重复蛋白”和“设计的重复结构域”分别是指通过专利申请WO2002/020565中所述的发明过程获得的重复蛋白质或重复结构域。设计的重复蛋白和设计的重复结构域是合成的而不是天然的。它们分别是通过表达相应设计的核酸获得的人造蛋白质或结构域。优选地，表达在真核或原核细胞(例如细菌细胞)中或者通过体外无细胞表达***完成。因此，设计的锚蛋白重复蛋白(即，DARPin)对应于包含至少一个锚蛋白重复结构域的本发明的重组结合蛋白。
术语“结构单元”是指多肽的局部有序部分，其通过两个或更多个沿多肽链彼此靠近的二级结构区段之间的三维相互作用形成。这样的结构单元呈现结构基序。术语“结构基序”是指在至少一个结构单元中存在的二级结构元件的三维排列。本领域技术人员熟知结构基序。结构单元单独不能获得限定的三维结构排列，但是他们的连续排列(例如作为重复结构域中的重复模块)导致相邻单元的互相稳定，从而生成超螺旋结构。
术语“重复单元”是指包含一个或多个天然存在的重复蛋白的重复序列基序的氨基酸序列，其中所述“重复单元”以多拷贝存在，且其呈现决定蛋白质折叠的全部所述基序共有的限定折叠拓扑结构。所述重复单元对应于Forrer等,2003,loc.Cit中所述的重复蛋白的“重复结构单元(重复序列)”或Binz等,2004,loc.cit中所述的重复蛋白的“连续同源结构单元(重复序列)”。这样的重复单元包含框架残基和相互作用残基。这类重复单元的例子有犰狳重复单元、富含亮氨酸重复单元、锚蛋白重复单元、三角形四肽(tetratricopeptide)重复单元、HEAT重复单元和富含亮氨酸变体重复单元。包含两个或更多个这类重复单元的天然存在的蛋白质称为“天然存在的重复蛋白”。当互相比较时，重复蛋白的单个重复单元的氨基酸序列可含有显著数目的突变、置换、添加和/或缺失，但仍基本上保持了重复单元的一般模式或基序。
因此，术语“锚蛋白重复蛋白”是指作为例如Forrer等,2003,loc.cit.所述的锚蛋白重复的重复单元。本领域技术人员熟知锚蛋白重复。术语“锚蛋白重复结构域”是指包含两个或更多个连续的锚蛋白重复单元(模块)作为结构单元，及优选地N-末端和/或C-末端加帽单元(或模块)的重复结构域。
术语“框架残基”是指重复单元的氨基酸残基或对应的重复模块的氨基酸残基，其造成折叠拓扑结构，，其对所述重复单元(或模块)的折叠有贡献或对与相邻单元(或模块)的相互作用有贡献。这种贡献可能是与重复单元(或模块)中的其他残基的相互作用，或对如α-螺旋或β-折叠片或者形成线性多肽或环的氨基酸延伸中存在的多肽主链构象的影响。
术语“靶相互作用残基”是指重复单元的氨基酸残基或对应的重复模块的氨基酸残基，其对与靶物质的相互作用有贡献。这种贡献可能是与靶物质的直接相互作用，或对其他直接相互作用的残基的影响，例如，通过稳定重复单元(或模块)的多肽构象以允许或增强直接相互作用的残基与所述靶标的相互作用。可以通过分析通过物理化学方法(例如X射线晶体学、NMR和/或CD光谱)或通过与操作者熟知的在结构生物学和/或信息生物学的从业者公知的已知和相关结构信息对比而获得的结构数据识别这种框架和靶相互作用残基。
优选地，用于重复序列基序推导的重复单元是同源重复单元，其中所述重复单元包含相同的结构基序且其中所述重复单元的超过70％的框架残基是彼此同源的。优选地，所述重复单元的超过80％的框架残基是同源的。最优选地，所述重复单元的超过90％的框架残基是同源的。本领域技术人员已知用于确定多肽之间同源性百分比的计算机程序，例如Fasta、Blast或Gap。更优选地，用于推导重复序列基序的重复单元从在特定靶标上选择的重复结构域获得的同源重复单元。
术语“重复序列基序”是指从一个或多个重复单元或重复模块推断的氨基酸序列。优选地，所述重复单元或重复模块来自于具有对相同靶标的结合特异性的重复结构域。这种重复序列基序包含框架残基位置和靶相互作用残基位置。所述框架残基位置对应于重复单元(或模块)的框架残基的位置。同样的，所述靶相互作用残基位置对应于重复单元(或模块)的靶相互作用残基的位置。重复序列基序包含固定位置和随机化位置。术语“固定位置”是指重复序列基序中的氨基酸位置，其中所述位置设置于特定的氨基酸。最常见的是，这种固定位置对应于框架残基的位置和/或对于特定靶标特异性的靶相互作用残基的位置。术语“随机化位置”是指重复序列基序的氨基酸位置，其中所述位置处允许两个或更多个氨基酸，例如，其中允许通常二十种天然存在的氨基酸的任一种，或其中允许二十种天然存在的氨基酸的大部分氨基酸(例如除了半胱氨酸以外的氨基酸，或除了甘氨酸、半胱氨酸和脯氨酸以外的氨基酸)。最常见的是，这种随机化位置对应于靶相互作用残基的位置。但是，框架残基的某些位置也可以随机化。
术语“折叠拓扑结构”是指所述重复单元或重复模块的三级结构。折叠拓扑结构通过形成至少α-螺旋或β-折叠片的部分的氨基酸延伸，或形成线性多肽或环的氨基酸延伸，或α-螺旋、β-折叠片和/或线性多肽/环的任意组合确定。例如，锚蛋白重复单元/模块由β-转角，接着两个反平行的α-螺旋和达到下一重复单元/模块的转角的环组成。
术语“连续的”是指其中重复单元或重复模块串联布置的排列。在设计的重复蛋白质中，存在至少有2个，一般约2-6个，特别至少约6个，经常20个或更多个重复单元(或模块)。在大多数情况下，重复结构域的重复单元(或模块)表现高度的序列同一性(在对应位置的相同氨基酸残基)或序列相似性(氨基酸残基不同，但具有相似的理化性质)，且某些氨基酸残基可能是高度保守的关键残基。但是，重复结构域的不同重复单元(或模块)之间通过氨基酸***和/或缺失和/或置换导致的高度序列变异性是可能的，只要保持了重复单元(或模块)的共同折叠拓扑结构。
本领域技术人员熟知用于通过理化手段例如X射线晶体学、NMR或CD光谱直接确定重复蛋白质的折叠拓扑结构的方法，。用于识别并确定重复单元或重复序列基序或用于鉴定识别包含这种重复单元或基序的相关蛋白家族的方法，例如同源性检索(BLAST等)，在生物信息学领域中是良好建立的，且为本领域技术人员熟知。优化初始重复序列基序的步骤可包括迭代过程。
术语“重复模块”是指设计的重复结构域的重复氨基酸序列，其原本来源于天然存在的重复蛋白质的重复单元。在重复结构域中包含的每一个重复模块来源于天然存在的重复蛋白质家族或亚家族(例如犰狳重复蛋白或锚蛋白重复蛋白的家族)的一个或多个重复单元。更优选地，重复结构域中包含的每一个重复模块包含从同源重复单元推断的重复序列基序，该同源重复单元获自在靶标上选择的重复结构域，例如如实施例1所述的，且具有相同的靶标特异性。
因此，术语“锚蛋白重复模块”应当是指原本来源于天然存在的锚蛋白重复蛋白的重复单元的重复模块。本领域技术人员熟知锚蛋白重复蛋白。
“重复模块”可以包含在对应的重复模块的所有拷贝中存在的氨基酸残基的位置(“固定位置”)和具有不同的或“随机化”氨基酸残基的文职(“随机化位置”)。
术语“加帽模块”是指与重复结构域的N-或C-末端重复模块融合的多肽，其中所述加帽模块与所述重复模块形成紧密的三级相互作用(例如三级结构相互作用)从而提供在不与连续重复模块相接触的侧将所述重复模块的疏水核心与溶剂屏蔽开的帽。所述N-和/或C-末端加帽模块可以是，或可以来源于，与重复单元相邻的天然存在的重复蛋白中存在的加帽单元或其他结构单元。术语“加帽单元”是指天然存在的折叠多肽，其中所述多肽限定了与重复单元N-或C-末端融合的特定结构单元，其中所述多肽与所述重复单元形成紧密的三级结构相互作用从而提供在一侧将所述重复单元的疏水核心与溶剂屏蔽开的帽。优选地，加帽模块或加帽单元是加帽重复。术语“加帽重复”是指与所述相邻的重复单元(或模块)具有相似或相同折叠和/或与所述相邻的重复单元(或模块)具有序列相似性的加帽模块或加帽单元。WO2002/020565和Interlandi等,2008(loc.cit.)中描述了加帽模块和加帽重复。N-末端锚蛋白加帽模块(例如N-末端加帽重复)的例子是SEQ ID NO：1-3，和锚蛋白C-末端加帽模块(例如C-末端加帽重复)的例子是SEQ ID NO：4-8、13和16。
例如，SEQ ID NO：49的N-末端锚蛋白加帽模块由1-32位的氨基酸编码，且SEQ ID NO：49的C-末端锚加帽模块由132-159位的氨基酸编码。
本发明的重组结合蛋白包含至少一个锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域具有对哺乳动物PDGF-BB的结合特异性。
术语“具有对靶标的结合特异性”、“特异性地结合靶标”或“靶标特异性”等是指结合蛋白或结合域在PBS中以比不相关蛋白(例如E.coli麦芽糖结合蛋白(MBP))更低的解离常数与靶标结合。优选地，在PBS中对靶标的解离常数与对MBP的相应解离常数相比低至少10倍，更优选地至少102倍，甚至更优选地至少103倍，或最优选地至少104倍。
实施例中示出了具有对PDGF-BB的结合特异性且包含锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。
特别地，本发明涉及如在此定义的包含具有与PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其在PBS中以小于10-6M的解离常数(Kd)与PDGF-BB结合。优选地，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以小于10-7M的Kd结合PDGF-BB，更优选地小于10-8M、10-9M、10-10M，或最优选地小于10-11M。
本领域技术人员熟知测定蛋白-蛋白相互作用的解离常数的方法，例如基于表面等离子体共振(SPR)的技术(如SPR平衡分析)或等温滴定量热法(ITC)。如果在不同条件(例如盐浓度、pH)下测量，所测量的特定蛋白-蛋白相互作用的Kd值可能会变化。因此，Kd值的测量最好是用标准化蛋白质溶液和标准化缓冲液(如PBS)进行。
实施例2示出了包含在PBS中具有以小于10-6M的Kd结合PDGF-BB的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。
优选地是包含具有对人PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。
更优选的是包含含有70-300个氨基酸，尤其是90-200个氨基酸的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。
本发明的结合结构域是锚蛋白重复结构域或设计的锚蛋白重复结构域，优选如WO2002/020565所述。实施例中示出了具有对PCGF-BB的结合特异性的设计的锚蛋白重复结构域的例子。
在进一步的实施方案中，本发明涉及包含至少一个具有对哺乳动物PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域以小于10-7M的IC50值抑制在PBS中PDGF-BB与PDGFRβ的结合。优选地，所述锚蛋白重复结构域以小于10-7M的IC50值抑制在PBS中PDGF-BB与PDGFRβ的结合，更优选地，小于10-8M、10-9M、10-10M，或最优选地小于10-11M。
半最大抑制浓度(IC50)是化合物(如本发明的结合结构域)抑制生物、生化或生理功能的效力的量度。本领域技术人员熟知确定抑制蛋白-蛋白相互作用的IC50值的方法，例如竞争ELISA。如果在不同条件(例如盐浓度、pH)下测量，所测量的蛋白-蛋白相互作用的特定抑制剂的IC50值可以变化。因此，IC50值的测量优选用标准化蛋白质溶液和标准化缓冲液(如PBS)进行。
实施例4中示出了包含以小于10-7M的IC50值抑制PBS中PDGF-BB与PDGFRβ结合的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。
在进一步的实施方案中，本发明涉及包含具有对PDGF-BB的结合特异性的至少一个锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其抑制PDGF-BB刺激的NIH-3T3成纤维细胞(ATCC，cat号：CRL-1658)增殖的IC50值小于10-6M。优选地，所述重复结构域抑制PDGF-BB刺激的NIH-3T3成纤维细胞增殖的IC50值小于10-7M，更优选地小于10-8M、10-9M、10-10M，或最优选地10-11M。
NIH-3T3细胞响应于PDGF-BB而生长，且因此可以用于测量本发明化合物的功能抑制性能力。NIH-3T3细胞在培养基中生长，且然后在加入PDGF-BB和的抗-PDGF-BB DARPin滴定之前营养饥饿7小时。如采用本领域技术人员熟知的标准测量法测量的，本发明化合物抑制PDGF-BB的能力的评估通过NIH-3T3细胞的增殖能力确定。实施例3中示出了包含以小于10-6M的IC50值抑制PDGF-BB刺激的NIH-3T3成纤维细胞增殖的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。
本发明涉及包含具有对PDGF-BB的结合特异性的至少一个锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述结合蛋白和/或锚蛋白重复结构域在PBS中热展开时的中点变性温度(Tm)高于40℃，且当在PBS中37℃下孵育1天时以高达10g/L的浓度形成低于5％(w/w)的不溶性聚集体。
术语“PBS”是指含有137mM NaCl、10mM磷酸盐和2.7mM KCl且pH为7.4的磷酸盐缓冲的水溶液。
优选地，重组结合蛋白和/或结合结构域在pH 7.4的PBS中热展开时的中点变性温度(Tm)高于45℃，更优选高于50℃，更优选高于55℃，且最优选高于60℃。本发明的结合蛋白或结合结构域在生理条件下具有限定的二级和三级结构。这种多肽的热展开导致其二级和三级结构的丧失，其可以进行接着，例如，圆二色性(CD)测量。热展开时结合蛋白或结合结构域的中点变性温度对应于当通过缓慢地将温度从10℃提高到约100℃使所述蛋白或结构域热变性时，在生理缓冲液中协同转变的中点处的温度。本领域技术人员熟知确定热展开时中点变性温度的测定。结合蛋白或结合结构域在热展开时的这一中点变性温度指示该多肽的热稳定性。
还优选的是当在PBS中37℃下孵育超过5天、优选超过10天，更优选超过20天、更优选超过40天且最优选超过100天时，以高达20g/L、优选高达40g/L、更优选高达60g/L、甚至更优选高达80g/L和最优选高达100g/L的浓度形成低于5％(w/w)的不溶性聚集体的重组结合蛋白和/或锚蛋白重复结构域。可以通过可见沉淀的出现、凝胶过滤或动态光散射(在不溶性聚集体形成时急剧增加)检测不溶性聚集体的形成。不溶性聚集体可以通过以10000xg离心10分钟从蛋白样品除去。优选地，重组结合蛋白和/或锚蛋白重复结构域在所述的PBS中37℃的孵育条件下形成低于2％，更优选低于1％、0.5％、0.2％、0.1％或最优选低于0.05％(w/w)的不溶性聚集体。可以通过分离不溶性聚集体与可溶性蛋白质，然后用标准定量方法测定可溶性和不溶性部分中的蛋白质量来确定不溶性聚集体的百分比。
还优选的是在含有100mM二硫苏糖醇(DTT)的PBS中37℃下孵育1小时或10小时时，没有丧失其原始三维结构的重组结合蛋白和/或锚蛋白重复结构域。
在一个特定实施方案中，本发明涉及包含锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其特异性结合PDGF-BB且具有上述所示的的或优选的中点变性温度和非聚集性质。
在进一步的实施方案中，本发明涉及包含至少一个具有对哺乳动物PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域与选自SEQ ID NO：23-60、优选SEQ IDNO：24、45和50、尤其SEQ ID NO：24和50的锚蛋白重复结构域竞争结合哺乳动物PDGF-BB。
还优选所述锚蛋白重复结构域与选自DARPins#23-60的结合蛋白竞争结合哺乳动物PDGF-BB。优选地，所述重复结构域与选自DARPins#24、45和50的结合蛋白竞争结合哺乳动物PDGF-BB。更优选地，所述锚蛋白重复结构域与结合蛋白DARPins#24或50竞争结合哺乳动物PDGF-BB。
术语“竞争结合”是指本发明的两个不同结合结构域不能同时与同一靶标结合，而其两者均能单独地与同一靶标结合。因此，这两个结合结构域竞争结合所述靶标。优选地，所述两个竞争的结合结构域与所述靶标上的重叠或相同结合表位结合。本领域技术人员熟知用于确定两个结合结构域是否竞争结合靶标的方法，例如竞争酶联免疫吸附测定法(ELISA)或竞争SPR测量(如通过采用来自BioRad的Proteon仪器)。例如，SEQ ID NO：#49或SEQ ID NO：#58的锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO：#50的锚蛋白重复结构域竞争结合人PDGF。
术语“表位”是指靶蛋白(如PDGF-BB)表面上本发明的结合域(如锚蛋白重复结构域)本身连接的特定位点。这个术语类似于本领域技术人员熟知的抗体的表位定义。如果本发明的两个结合域结合同一表位，则其竞争结合PDGF-BB。可以通过，例如与PDGF-BB复合的本发明结合结构域的蛋白质X射线晶体学(一种本领域技术人员熟知的方法)来阐明表位的准确分子排列。
在进一步的实施方案中，本发明涉及包含至少一个具有对哺乳动物PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含与选自SEQ ID NO：23-60的一个锚蛋白重复结构域有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，
其中所述锚蛋白重复结构域的位置1的G和/或位置2的S任选地缺失，且
所述锚蛋白重复结构域的倒数第二位置的L和/或最后位置的N任选地被A置换。
优选地，本发明的重组结合蛋白中的这种锚蛋白重复结构域包含与选自SEQ ID NO：24、45和50，更优选24和50的一个锚蛋白重复结构域有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
优选地，本发明的重组结合蛋白中的这种锚蛋白重复结构域包含与在选自SEQ ID NOs：23-60的锚蛋白重复结构域的N-末端和C-末端加帽模块之间存在的一个、两个或三个锚蛋白重复结构域具有至少70％，例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
优选地，不是具有70％的氨基酸序列同一性，这种锚蛋白重复结构域或这种本发明重组结合蛋白的锚蛋白重复结构域中的N-末端和C-末端加帽模块之间的一个、两个或三个重复模块包含有至少75％氨基酸序列同一性，更优选至少76％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％或最优选至少95％的氨基酸序列。优选地，所述的氨基酸序列同一性的百分比是在框架位置中。
优选地，SEQ ID NO：23-60的重复结构域中最多30个氨基酸，例如30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个或没有氨基酸被另一氨基酸置换。特别的，SEQ ID NO：23-60中最多25个氨基酸、更优选最多20个氨基酸、更优选最多15个氨基酸、甚至更优选最多11个氨基酸、更优选最多8个氨基酸、更优选最多5个氨基酸、更优选最多2个氨基酸和最优选没有氨基酸被置换。
优选地，当SEQ ID NO：13或16的加帽模块、SEQ ID NO：12、14、15、17、18或19的重复模块或者SEQ ID NO：23-60的重复结构域中有氨基酸被置换时，这些氨基酸选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y，更优选选自A、D、E、H、I、K、L、Q、R、S、T、V和Y。还优选地，氨基酸被同源氨基酸置换，即，氨基酸被包含有相似生物物理性质的侧链的氨基酸置换。例如，带负电荷的氨基酸D可以被带负电荷的氨基酸E置换，或疏水氨基酸如L可以被A、I或V置换。本领域技术人员熟知在多肽中用一个氨基酸置换另一个氨基酸的技术。
在进一步的实施方案中，本发明涉及包含至少一个具有对哺乳动物PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域选自SEQ ID NO：23-60，
其中所述锚蛋白重复结构域的位置1的G和/或位置2的S任选地缺失，且
所述锚蛋白重复结构域的倒数第二位置的L和/或最后位置的N任选地被A置换。
优选地，这种锚蛋白重复结构域选自SEQ ID NO：24、45和50，更优选24和50。
在进一步的实施方案中，本发明涉及重组结合蛋白，其中锚蛋白重复结构域与选自SEQ ID NOs：23-60的锚蛋白重复结构域结合相同的表位。优选地，这种锚蛋白重复结构域选自SEQ ID NO：24、45和50，更优选24和50。
在进一步的实施方案中，本发明涉及包含至少一个具有对哺乳动物PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有选自SEQ ID NO：12、14、15、17、18和19及SEQ ID NO：12、14、15、17、18和19中最多9个氨基酸被任何氨基酸置换的序列的氨基酸序列的锚蛋白重复模块。
优选地，所述锚蛋白重复结构域的这种锚蛋白重复模块选自SEQID NO：12、14和17，更优选12和17。
优选地，SEQ ID NO：12、14、15、17、18和19的重复模块中最多8个氨基酸、更优选最多7个氨基酸、更优选最多6个氨基酸、更优选最多5个氨基酸、甚至更优选最多4个氨基酸、更优选最多3个氨基酸、更优选最多2个氨基酸和最优选1个氨基酸被另一氨基酸置换。优选地，所述的氨基酸置换在框架位置中。因此，SEQ ID NO：12、14、15、17、18和19的框架位置中最多8个氨基酸被任何氨基酸置换，优选最多7、6、5、4、3或2个氨基酸，且最优选1个氨基酸。
在进一步的实施方案中，本发明涉及重组结合蛋白，其中具有对PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域包含具有锚蛋白重复序列KDEEGTTPLHYAAVWGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:12)和其中SEQ ID NO:12中最多9个氨基酸被任何氨基酸置换的序列的重复模块，其中
位置3的E任选地被选自D、W、Q、I和Y，优选选自D和W的氨基酸置换；
位置4的E任选地被选自T、D、Y和S，优选选自T和D的氨基酸置换；
位置6的T任选地被选自S和F的氨基酸，优选被S置换；
位置11的Y任选地被F置换；
位置14的V任选地被选自A、Y和T的氨基酸，优选被A置换；以及
位置15的W任选地被选自F、K、V和Y，优选选自F和Y的氨基酸置换。
在进一步的实施方案中，本发明涉及包含至少一个具有哺乳动物PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有选自SEQ ID NO：13和16或SEQ IDNO：13和16中最多9个氨基酸被任何其他氨基酸所置换的序列的氨基酸序列的加帽模块。
优选地，所述锚蛋白重复结构域中包含的SEQ ID NO：13和16加帽模块中最多8个氨基酸被其他氨基酸置换，更优选最多7个氨基酸、更优选最多6个氨基酸、更优选最多5个氨基酸、甚至更优选最多4个氨基酸、更优选最多3个氨基酸、更优选最多2个氨基酸、更优选最多1个氨基酸和最优选SEQ ID NO：13和16中没有氨基酸被置换。优选地，所述置换的氨基酸在框架位置。
在再另一个实施方案中，本发明涉及重组结合蛋白，其中具有对PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域包含具有序列QDIYGATPADLAALVGHEDIAEVLQKLN(SEQ ID NO:13)或SEQID NO:13中最多9个氨基酸被任何氨基酸置换的序列的C-末端加帽模块，其中
位置3的I任选地被选自K、L、A和V的氨基酸置换，优选L、A和V；
位置4的Y任选地被选自W、F和S，优选选自W和F的氨基酸置换；
位置6的A任选地被K置换；
位置14的L任选地被选自F、Y和D，优选选自F和Y的氨基酸置换；
位置15的V任选地被选自L、I、A和N的氨基酸置换，优选L和I；以及
位置23的V任选地被选自I和L的氨基酸置换。
优选的是其中锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:12的锚蛋白重复模块和C-末端加帽模块SEQ ID NO:13的重组结合蛋白。优选地，所述C-末端加帽模块直接接着所述锚蛋白重复结构域中的所述锚蛋白重复模块。
在再另一个实施方案中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有对PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域包含具有锚蛋白重复序列KDQEGTTPLHFAASVGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQID NO:15)或SEQ ID NO:15中最多9个氨基酸被任何氨基酸置换的序列的重复模块，且其中
位置3的Q任选地被A置换；
位置4的E任选地被D置换；
位置6的T任选地被E置换；
位置11的F任选地被Y置换；
位置14的S任选地被V置换；以及
位置15的V任选地被W置换。
在再另一个实施方案中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有对PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域包含具有序列QDHYGATPADLAALIGHEDIAEVLQKLN(SEQ ID NO:16)或SEQID NO:16中最多9个氨基酸被任何氨基酸置换的序列的C-末端加帽模块，且
其中
位置3的H任选地被I置换；以及
位置4的Y任选地被W置换。
在再另一个实施方案中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有对PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域包含具有锚蛋白重复序列KDLNGQTPLHLAADIGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ IDNO:17)或SEQ ID NO:17中最多9个氨基酸被任何氨基酸置换的序列的重复模块，且其中
位置1的K任选地被Q或I置换；
位置3的L任选地被N置换；以及
位置27的A任选地被H置换。
在再另一个实施方案中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有对PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域包含具有锚蛋白重复序列KDYAGSTPLRLAAWAGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQID NO:18)或SEQ ID NO:18中最多9个氨基酸被任何氨基酸置换的序列的重复模块，且其中
位置1的K任选地被Q置换；
位置14的W任选地被H置换；
位置15的A任选地被V置换；以及
位置27的A任选地被N或Y置换。
在再另一个实施方案中，本发明涉及一种重组结合蛋白，其中具有对PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域包含具有锚蛋白重复序列KDYFGYTPLHLAAYFGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQID NO:19)或SEQ ID NO:19中最多9个氨基酸被任何氨基酸置换的序列的重复模块，且其中
位置1的K任选地被N置换；
位置12的A任选地被T置换；
位置13的A任选地被T置换；
位置22的E任选地被D置换；以及
位置27的A任选地被H或Y置换。
进一步优选的是分别包含N-末端或C-末端锚蛋白加帽重复的N-末端或C-末端锚蛋白加帽模块，其中所述加帽重复中的一个或多个氨基酸残基被在对应的锚蛋白加帽单元或锚蛋白重复单元比对时对应位置存在的氨基酸残基取代。
可以用20种最常见的天然存在的氨基酸中的任意一种进行氨基酸置换，优选用选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸置换，更优选用选自A、D、E、H、I、K、L、Q、R、S、T、V和Y的氨基酸置换。还优选地，氨基酸被同源氨基酸置换，即，氨基酸被包含有相似生物物理性质的侧链的氨基酸置换。例如，带负电荷的氨基酸D可以被带负电荷的氨基酸E置换，或疏水氨基酸如L可以被A、I或V置换。本领域技术人员熟知用一个同源氨基酸置换另一个氨基酸。
还优选的是包含基于SEQ ID NO：4-18、13和16的任一上述C-末端加帽模块的位置27和28处的氨基酸A的C-末端加帽模块。
还优选的是包含基于SEQ ID NO：4-18、13和16的任一上述C-末端加帽模块的位置1-26或位置1-27的氨基酸的C-末端加帽模块。
SEQ ID NO：1-3的位置1的氨基酸G和/或位置2的S可以从N-末端锚蛋白加帽模块移除而不对其性质具有任何明显影响。这两个氨基酸用作连接锚蛋白重复结构域与其他氨基酸和蛋白质的接头。本发明还包含其中移除位置1的G和/或位置2的S的含有N-末端锚蛋白加帽模块的这种锚蛋白重复结构域。可以理解，如在此定义的锚蛋白重复结构域中的氨基酸位置(如“位置33”)可以相应地适应，从而造成编号偏移。例如，如果缺失了一个氨基酸，“位置33”将变成“位置32”，或如果缺失了两个氨基酸，“位置33”将变成“位置31”。
本发明的锚蛋白重复结构域的锚蛋白加帽模块可以通过组合本领域技术人员已知的技术(如氨基酸序列的比对、诱变和基因合成)被锚蛋白加帽模块取代。例如，SEQ ID NO：49的C-末端加帽重复可以被SEQ ID NO：8的C-末端加帽重复取代，其通过(i)通过与SEQ ID NO：8的序列比对确定SEQ ID NO：49(即，序列位置132-159)的C-末端加帽重复，(ii)用SEQ ID NO：8的序列取代确定的SEQ ID NO：49的C-末端加帽重复，(iii)生成编码重复结构域的基因，其编码取代的C-末端加帽模块，(iv)在大肠杆菌的细胞质中表达修饰的重复结构域，以及(v)通过标准方法纯化修饰的重复结构域而进行。作为进一步的例子，SEQ ID NO：49的N-末端加帽重复可以被SEQ ID NO：2的N-末端加帽重复取代，其通过(i)通过与SEQ ID NO：2进行序列比对确定SEQ ID NO：49(即，序列位置1-32)的N-末端加帽重复，(ii)用SEQ ID NO：2的序列取代确定的SEQ ID NO：49的N-末端加帽重复，(iii)生成编码重复结构域的基因，其编码取代的N-末端加帽模块，(iv)在大肠杆菌细胞质中表达修饰的重复结构域，以及(v)用标准方法纯化修饰的重复结构域而进行。
此外，本发明的锚蛋白重复结构域可以通过组装N-末端锚蛋白加帽模块(如SEQ ID NO：2的N-末端加帽重复)，接着一个或多个重复模块(如包含SEQ ID NO：49的位置33-131的氨基酸残基的三个锚蛋白重复模块)以及C-末端加帽模块(如SEQ ID NO：8的C-末端加帽重复)来遗传地构建。所述遗传组装的重复结构域基因然后可以如上所述在大肠杆菌中表达。
进一步优选的是含有缺乏氨基酸C、M或N的氨基酸序列的重组结合蛋白、重复结构域、重复模块、N-末端加帽模块或C-末端加帽模块。
进一步优选的是含有缺乏氨基酸N接着G的氨基酸序列的重组结合蛋白、重复结构域、重复模块、N-末端加帽模块或C-末端加帽模块。
进一步优选的是包含任一这种N-末端或C-末端加帽模块的重组结合蛋白或重复结构域。
在根据本发明的包含锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白的进一步优选实施方案中，所述重复结构域的N-末端加帽模块的一个或多个氨基酸残基被在N-末端加帽单元的比对时对应位置存在的氨基酸残基置换。优选地，最多30％的氨基酸残基被置换，更优选最多20％，甚至更优选最多10％的氨基酸残基被置换。最优选地，这种N-末端加帽单元是天然存在的N-末端加帽单元。
在根据本发明的包含锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白的进一步优选实施方案中，所述重复结构域的C-末端加帽模块的一个或多个氨基酸残基被在C-末端加帽单元序列的比对时对应位置存在的氨基酸残基置换。优选地，最多30％的氨基酸残基被置换，更优选最多20％，甚至更优选最多10％的氨基酸残基被置换。最优选地，这种C-末端加帽单元是天然存在的C-末端加帽单元。
在再另一个特定实施方案中，最多30％氨基酸残基，更优选最多20％，甚至更优选最多10％的氨基酸残基被未在重复单元、N-末端加帽单元或C-末端加帽单元的对应位置中发现的氨基酸置换。
术语“共有序列”是指氨基酸序列，其中所述共有序列通过多个重复单元的结构和/或序列比对获得。利用两个或更多个结构和/或序列比对的重复单元并在比对中允许空位，有可能确定在每个位置上最常见的氨基酸残基。共有序列是指在每个位置上都是最常表现的氨基酸的序列。在单一位置上具有高于平均出现水平的两个或更多个氨基酸的情况中，共有序列可以包括这些氨基酸的子集。所述两个或更多个重复单元可以从单一重复蛋白中包含的重复单元，或从两个或更多个不同的重复蛋白获取。
本领域技术人员熟知共有序列及其确定方法。
“共有氨基酸残基”是在共有序列中某个位置上存在的氨基酸。如果在所述两个或更多个重复单元中发现有两个或更多个，如三个、四个或五个氨基酸残基具有相似机率，则共有氨基酸可以是最常见的氨基酸之一或所述两个或更多个氨基酸残基的组合。
进一步优选的是非天然存在的加帽模块、重复模块、结合蛋白或结合结构域。
术语“非天然存在”是指合成的或不是来自于自然的，更具体的，该术语是指人工制造的。术语“非天然存在的结合蛋白”或“非天然存在的结合结构域”是指所述结合蛋白或所述结合结构域是合成的(即，通过化学合成由氨基酸制备)或重组的且不是来自于自然的。“非天然存在的结合蛋白”或“非天然存在的结合结构域”分别是通过表达对应设计的核酸获得的人造的蛋白质或结构域。优选的，表达在真核或细菌细胞中或通过使用体外无细胞表达***完成。另外，该术语是指所述结合蛋白或所述结合结构域的序列在序列数据库(如GenBank、EMBL-Bank或Swiss-Prot)中不是作为非人工序列存在。本领域技术人员熟知这些数据库和其他相似的序列数据库。
在一个特定的实施方案中，本发明涉及包含与PDGF-BB特异性结合的锚蛋白重复结构域和进一步包含与血管内皮生长因子A(VEGF-A)特异性结合的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。具有对PDGF-BB的特异性的锚蛋白重复结构域的例子在本文中给出，且具有对VEGF-A的特异性的锚蛋白重复结构域的例子描述于其全文通过引用结合于此的WO 2010/060748(US 2011/0207668)和WO2011/135067(US 2013/0116197)中。这样两个重复结构域可以通过本领域技术人员已知的方法利用遗传手段通过多肽接头连接。在本发明的一个实施方案中，包含与PDGF-BB特异性结合的锚蛋白重复结构域和与血管内皮生长因子A(VEGF-A)特异性结合的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白可用于治疗视网膜疾病和脉络膜新生血管疾病，如渗出型年龄相关性黄斑变性、息肉状脉络膜血管新生和病理性近视。
另一个优选的实施方案是包含具有对PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，所述锚蛋白重复结构域包含参与与PDGF-BB结合的一个、两个、三个或更多个内部重复模块。优选地，这种锚蛋白重复结构域包含N-末端加帽模块，两个到四个内部重复模块和C-末端加帽模块。优选的，所述加帽模块是加帽重复。还优选的，所述加帽模块参与与PDGF-BB的结合。
进一步优选的是包含两个或更多个所述具有对PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。优选的，所述结合蛋白包含2个或3个所述重复结构域。所述两个或更多个重复结构域有相同或不同的氨基酸序列。
在根据本发明的包含锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白的进一步优选实施方案中，所述锚蛋白重复结构域的重复模块的一个或多个氨基酸残基被重复单元序列比对时对应位置存在的氨基酸残基置换。优选地，最多30％的氨基酸残基被置换，更优选最多20％，甚至更优选最多10％的氨基酸残基被置换。最优选地，这种重复单元是天然存在的重复单元。
在再另一个特定实施方案中，最多30％的氨基酸残基，如29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％的氨基酸残基被未在重复单元的对应位置中发现的氨基酸置换。更优选最多20％，甚至更优选10％的氨基酸残基被未在重复单元的对应位置中发现的氨基酸置换。
在进一步的实施方案中，如在此所述的任意重组PDGF-BB结合蛋白或结构域可以共价结合一个或多个另外的部分，包括例如，结合不同靶标以产生双特异性结合剂的部分、生物活性化合物、标记部分(例如，荧光标记如荧光素、或放射性示踪剂)、促进蛋白纯化的部分(例如，小肽标签如His-或strep-标签)、提供具有提高的疗效的效应子功能的部分(如，抗体的Fc部分以提供抗体依赖性细胞介导细胞毒性、毒性蛋白部分如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A(ETA)或小分子毒性剂如美登木素生物碱或DNA烷化剂)或提供改进的药代动力学的部分。改进的药代动力学可以根据认识到的治疗需要评估。通常需要提高生物利用度和/或增加剂量之间的时间，可能通过增加给药后在血清中蛋白质保持可用的时间。在某些情况下，需要提高蛋白质的血清浓度随时间的连续性(如，减少在给药后短时间的浓度和紧接下次给药前的浓度之间的蛋白质血清浓度差异)。倾向于减缓蛋白质从血液的清除的部分包括羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、糖(例如，唾液酸)、良好耐受的蛋白质部分(例如，Fc片段或血清白蛋白)和对丰富的血清蛋白有特异性和亲和力的结合结构域或肽，如抗体Fc片段或血清白蛋白。WO2012/069654中提供了具有对血清白蛋白的亲和力的这种结合结构域的例子。本发明的重组结合蛋白可以连接于将哺乳动物(如小鼠、大鼠或人)中多肽的清除率相对于未修饰多肽降低超过3成的部分。
在进一步的实施方案中，本发明涉及编码特定重组结合蛋白、特定锚蛋白重复结构域、特定锚蛋白重复模块和特定加帽模块的核酸分子。此外，考虑包含所述核酸分子的载体。
进一步地，考虑包含一个或多个上述重组结合蛋白，尤其是包含重复结构域的重组蛋白，或编码特定结合蛋白的核酸分子，及任选的药学上可接受的载体和/或稀释剂的药物组合物。药学上可接受的载体和/或稀释剂是本领域技术人员已知的，并如以下更详细地解释。更进一步地，考虑包含一个或多个上述重组结合蛋白，尤其是包含重复结构域的结合蛋白的诊断组合物。
药物组合物包含如上所述的重组结合蛋白和药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，例如，如Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition,Osol,A.Ed.[1980]所描述的。技术人员已知的合适的载体、赋形剂或稳定剂是盐水、Ringer溶液、葡萄糖溶液、Hank溶液、非挥发油、油酸乙酯、盐水中的5％葡萄糖、提高等渗性和化学稳定性的物质、缓冲剂和防腐剂。其他合适的载体包括其本身不能诱导对接受该组合物的个体有害的抗体的产生的任何载体，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸和氨基酸共聚物。药物组合物也可以是包含额外活性剂如抗癌剂或抗血管生成剂的组合制剂。
用于体内给药的制剂必须是无菌的或灭菌的。这可以通过用无菌过滤膜过滤轻易实现。
药物组合物可以通过本领域技术人员技能范围内的任意合适的方法给药。
进一步地，任意上述药物组合物被认为用于疾病的治疗。
本发明进一步提供治疗方法。该方法包括向需要的患者施用治疗有效量的，即足够对患者产生所需效果的量的，本发明的重组结合蛋白。
进一步地，考虑治疗哺乳动物包括人的病理状况的方法，包括向需要的患者施用有效量的上述药物组合物。
此类病理状况的例子是动脉粥样硬化、再狭窄、肺动脉高血压、眼和视网膜疾病和纤维化疾病，包括肺间质纤维化、肝硬化、硬皮病、肾小球硬化和心肌纤维化。此外，抗PDGF-BB疗法可用于肿瘤病理状况，如胶质瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤和上皮癌。
本发明的重组结合蛋白或锚蛋白重复结构域可以通过几种方法获得和/或进一步进化，如在噬菌体(WO 1990/002809、WO2007/006665)或细菌细胞(WO 1993/010214)的表面上展示、核糖体展示(WO 1998/048008)、质粒上展示(WO 1993/008278)或通过使用共价RNA-重复蛋白杂合构建体(WO 2000/032823)、或胞内表达和选择/筛选如通过蛋白质互补试验(WO 1998/341120)。本领域技术人员熟知此类方法。
可以根据本领域技术人员已知的方案(WO 2002/020565、Binz,H.K.等,J.Mol.Biol.,332,489-503,2003和Binz等,2004,loc.cit)获得用于选择/筛选本发明的重组结合蛋白或锚蛋白重复结构域的锚蛋白重复蛋白文库。实施例1举例说明了用此类文库选择具有对PDGF-BB的特异性的锚蛋白重复结构域。再者，本发明的锚蛋白重复结构域可以由根据本发明的锚蛋白重复模块和合适的加帽模块或加帽重复(Forrer,P.等,FEBS letters 539,2-6,2003)通过标准的重组DNA技术(例如WO 2002/020565、Binz等,2003,loc.cit.和Binz等,2004,loc.cit)模块化组装。
本发明不限制于实施例中所述的具体实施方案。可以根据以下描述的简要大纲使用和处理其他源。
实施例
以下描述的所有原料和试剂都是本领域技术人员已知的，且是市售的或可以使用已知技术制备。
材料
化学品从Fluka(瑞士)购买。寡核苷酸来自Microsynth(瑞士)。除非另有说明，DNA聚合酶、限制性酶和缓冲剂来自New EnglandBiolabs(美国)或Fermentas(立陶宛)。克隆和蛋白生产菌株是大肠杆菌XL1-blue(Stratagene，美国)或BL21(Novagen，美国)。重组人和鼠PDGF-BB从Reliatech(德国，产品号分别是200-055和M10-125)购买。生物素化的PDGF-BB使用标准的生物素化试剂和方法(Pierce，美国)将生物素部分与蛋白质的伯胺偶联而通过化学方式获得。
分子生物学
除非另有说明，方法根据所描述的方案(Sambrook J.,Fritsch E.F.and Maniatis T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory 1989,New York)进行。
设计的锚蛋白重复蛋白文库
描述了产生设计的锚蛋白重复蛋白文库的方法(WO2002/020565、Binz等2003,loc.cit.和Binz等2004,loc.Cit)。通过这些方法可以构建具有随机化锚蛋白重复模块和/或随机化加帽模块的设计的锚蛋白重复蛋白文库。例如，此类文库可以相应地基于固定的N-末端加帽模块(例如SEQ ID NO：2的N-末端加帽模块)或根据SEQ ID NO：64的随机化N-末端加帽模块、一个或多个根据SEQID NO：20、62或63的序列基序的随机化重复模块和固定的C-末端加帽模块(例如SEQ ID NO：8的C-末端加帽模块)或按照SEQ IDNO：65的随机化C-末端加帽模块组装而成。优选地，此类文库组装为在重复或加帽模块的随机位置上没有氨基酸C、G、M、N(在G残基之前)或P。此外，按照SEQ ID NO：20、62或63的序列基序的随机化重复模块可以进一步在位置10和/或位置17处随机化；按照SEQ ID NO：64的序列基序的随机化N-末端加帽模块可以进一步在位置7和/或位置9处随机化；以及按照SEQ ID NO：65的序列基序的随机化C-末端加帽模块可以进一步在位置10、11和/或17处随机化。
此外，所述文库中的这种随机化模块可以包含额外的具有随机化氨基酸位置的多肽环***。此类多肽环***的例子是抗体的互补决定区(CDR)环文库或从头产生的肽文库。例如，可以用人核糖核酸酶L的N-末端锚蛋白重复结构域的结构(Tanaka,N.,Nakanishi,M,Kusakabe,Y,Goto,Y.,Kitade,Y,Nakamura,K.T.,EMBO J.23(30),3929-3938,2004)作为指导设计这种环***。类似于其中在靠近两个锚蛋白重复的边界存在的β-转角中***十个氨基酸的这种锚蛋白重复结构域，锚蛋白重复蛋白文库可以包含在锚蛋白重复结构域的一个或多个β-转角中***的不同长度(例如1-20个氨基酸)的随机化环(具有固定的和随机化的位置)。
锚蛋白重复蛋白文库的任何此类N-末端加帽模块优选具有RELLKA或RILKAA基序而不是RILLAA基序(例如，在SEQ ID NO：64的位置21-26存在)且锚蛋白重复蛋白文库的任何此类C-末端加帽模块优选具有KAA或KLA基序而不是KLN基序(例如，在SEQID NO：65的最后三个氨基酸)。
这种锚蛋白重复蛋白文库的设计可以通过与靶标相互作用的锚蛋白重复结构域的已知结构作为指导。此类结构的例子(通过它们蛋白质数据库(PDB)的独特登录或识别码(PDB-ID)确认)是1WDY、3V31、3V30、3V2X、3V2O、3UXG、3TWQ-3TWX、1N11、1S70和2ZGD。
描述了设计的锚蛋白重复蛋白文库的例子，如N2C和N3C设计的锚蛋白重复蛋白文库(WO 2002/020565、Binz等.2003,loc.cit.、Binz等.2004,loc.cit.)。N2C和N3C中的数字描述在N-末端和C-末端加帽模块之间存在的随机化重复模块的数目。
用于定义重复单元和模块内的位置的命名法是基于Binz等2004,loc.cit.，具有锚蛋白重复模块和锚蛋白重复单元的边界平移一个氨基酸位置的修饰。例如Binz等2004(loc.cit.)的锚蛋白重复模块的位置1对应于本公开的锚蛋白重复模块的位置2，且结果是Binz等2004(loc.cit.)的锚蛋白重复模块的位置33对应于本公开中的下一个锚蛋白重复模块的位置1。
所有DNA序列均由测序确认，且所有所述蛋白质的计算分子量由质谱确认。
实施例1.选择包含具有对PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结 构域的结合蛋白
使用核糖体展示(Hanes,J.和Plückthun,A.,PNAS 94,4937-42,1997)，从Binz等2004(loc.cit.)所述的DARPin文库选择许多具有对PDGF-BB的结合特异性的设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)。通过粗提取物ELISA评估选择的克隆与特异性(PDGF-BB)和非特异性(MBP，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白)靶标的结合，其表明成功选择了数百个PDGF-BB结合蛋白。例如，SEQ ID NO:23-61的锚蛋白重复结构域构成包含具有对PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域的所选择结合蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO：12、14、15、17、18和19提供了来自这种具有对PDGF-BB的特异性的锚蛋白重复结构域的单个锚蛋白重复模块。SEQ ID NO：13和16提供这种具有对PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域的单个加帽模块。
通过核糖体展示选择PDGF-BB特异的锚蛋白重复蛋白
通过核糖体展示(Hanes和Plückthun,loc.cit.)利用人和小鼠PDGF-BB为靶标蛋白、如上所述的设计的锚蛋白重复蛋白文库和确立的方案(Zahnd,C.,Amstutz,P.和Plückthun,A.,Nat.Methods 4,69-79,2007)进行PDGF-BB特异的锚蛋白重复蛋白的选择。各轮选择后逆转录(RT)-PCR循环数从40恒定地减少到30，从而由于结合物的富集调节到产量。前四轮的选择采用标准核糖体展示选择，采用降低的靶标浓度和提高洗涤严格性来从第1轮到第4轮增加选择压力(Binz等.2004,loc.cit.)。为了富集高亲和力抗-PDGF-BBDARPin，第四轮标准核糖体展示选择(以上)的结果经历具有提高的选择严格性的解离速率选择轮(Zahnd,2007,loc.cit.)。进行最后标准选择轮以扩增并回收解离速率选择的结合蛋白。
如通过粗提取ELISA所示选择的克隆与PDGF-BB特异性结合
采用标准方案使用DARPin表达细胞的粗大肠杆菌提物通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来鉴定与PDGF-BB特异性结合的单个选择的DARPin。将通过核糖体展示选择的DARPin克隆到pQE30(Qiagen)表达载体中，转化到大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene)中，且然后在含有1ml生长培养基(含有1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2YT)的96孔深孔板中(各克隆在单一孔中)37℃下生长过夜。在新的96孔深孔板中用100μl的过夜培养液接种1ml新鲜的含有50μg/ml氨苄青霉素的2YT。37℃孵育2小时后，用IPTG(最终浓度为1mM)诱导表达并继续3小时。收获细胞，重悬浮于100μlB-PERII(Pierce)中并在室温下伴随振摇孵育15分钟。然后加入900μl PBS-TC(补充有0.25％酪蛋白水解物、0.1％Tween的PBS，pH 7.4)，通过离心去除细胞碎片。应用100μl的各裂解克隆到包含通过其生物素部分固定的PDGF-BB或不相关MBP的Neutravidin包被MaxiSorp板的孔中，并在室温下孵育1小时。在用PBS-T(补充有0.1％Tween的PBS，pH 7.4)充分洗涤后，板用单克隆辣根标记的抗RGS(His)4抗体(34650，Qiagen)通过标准ELISA过程显影。然后通过POD底物(Roche)检测结合。405nm下测量显色。通过这样的粗细胞提取物ELISA筛选数百个克隆发现了具有对PDGF-BB的特异性的超过百种不同DARPin。选择这些结合蛋白用于进一步分析。选择的与PDGF-BB特异性结合的锚蛋白重复结构域的氨基酸序列的示例提供于SEQ ID NO：23-61中。
将这些与具有对PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域和不具有对PDGF-BB的结合特异性的阴性对照DARPin(即，DARPin#21和22)克隆到基于pQE(QIAgen，德国)的表达载体中，提供了如下所述促进简单的蛋白质纯化的N-末端His-标签。因此，构建了编码以下DARPin的表达载体：
DARPin#21(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:21)；
DARPin#22(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:22)；
DARPin#23(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:23)；
DARPin#24(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:24)；
DARPin#25(具有与其N末端融合的His标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:25)；
DARPin#26(具有与其N末端融合的His标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:26)；
DARPin#27(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:27)；
DARPin#28(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:28)；
DARPin#29(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:29)；
DARPin#30(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:30)；
DARPin#31(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:31)；
DARPin#32(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:32)；
DARPin#33(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:33)；
DARPin#34(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:34)；
DARPin#35(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:35)；
DARPin#36(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:36)；
DARPin#37(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:37)；
DARPin#38(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:38)；
DARPin#39(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:39)；
DARPin#40(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:40)；
DARPin#41(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:41)；
DARPin#42(具有与其N末端融合的His标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:42)；
DARPin#43(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:43)；
DARPin#44(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:44)；
DARPin#45(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:45)；
DARPin#46(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:46)；
DARPin#47(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:47)；
DARPin#48(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:48)；
DARPin#49(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:49)；
DARPin#50(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:50)；
DARPin#51(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:51)；
DARPin#52(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:52)；
DARPin#53(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:53)；
DARPin#54(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:54)；
DARPin#55(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:55)；
DARPin#56(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:56)；
DARPin#57(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:57)；
DARPin#58(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:58)；
DARPin#59(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:59)；
DARPin#60(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:60)；
DARPin#61(具有与其N末端融合的His-标签(SEQ ID NO:9)的SEQ IDNO:61)；
DARPin的高水平和可溶性表达
为了进一步分析，将上述粗细胞提取物ELISA中显示特异性PDGF-BB结合的所选择克隆在大肠杆菌BL21或XL1-Blue细胞中表达并利用其His-标签用标准方案纯化。用50ml的静止过夜培养物(TB，1％葡萄糖、100μg/ml氨苄青霉素；37℃)接种1l培养液(不含葡萄糖的相同培养基)。在600nm下吸光度为0.7(对于BL21是1)时，培养物用0.5mM IPTG诱导并于37℃孵育4-5小时。离心该培养物，且所得沉淀在40ml TBS500(50mM Tris–HCl、500mMNaCl、pH 8)中重悬浮并超声处理。裂解物再离心，并将甘油(最终浓度10％(v/v))和咪唑(最终浓度20mM)加入所得上清液中。蛋白质用Ni-次氮基三乙酸柱(2.5ml柱体积)按照生产商(QIAgen，德国)的指示纯化。或者，缺乏6xHis-标签的DARPin或选择的重复结构域根据本领域技术人员已知的标准树脂和方案通过阴离子交换色谱法接着尺寸排阻色谱进行纯化。如从SDS-15％PAGE估计的，可以从纯度大于95％的1L大肠杆菌培养液中纯化最多200mg具有对PDGF-BB的结合特异性的的高度可溶性DARPin。这样的纯化DARPin用于进一步表征。
实施例2.通过表面等离子体共振分析对与PDGF-BB特异性结合的 DARPin的表征
将来自人和小鼠的生物素化PDGF-BB分子通过结合包被的Streptavidin固定在流动池中，并分析其与各种选择的DARPin的相互作用。
表面等离子体共振(SPR)分析
用ProteOn仪器(BioRad)测定SPR，并根据本领域技术人员已知的标准过程进行测量。运行缓冲液是含有0.005％Tween的PBS，pH 7.4。将中性亲和素(Neutravidin)共价固定在GLC芯片(BioRad)上以达到约8000共振单元(RU)的水平。然后将PDGF-BB固定在中性亲和素包被的芯片上。然后通过注射100μl含有浓度为12.5、6.26、3.13和1.67nM(结合速率测量)的DARPin系列稀释的运行缓冲液(含有0.005％Tween的PBS)，接着以30μl/分钟的恒定流速的10分钟到最多3小时的运行电泳缓冲液(解离速率测量)测量DARPin PDGF-BB的相互作用。从PDGF-BB注入后的RU痕迹中提取未包被参照细胞和参照注射(即，仅运行缓冲液的注射)的信号(即，共振单元(RU)值)从PDGF-BB注射后获得的RU迹线减去(双参照)。从由结合速率以及解离速率测量获得的SRP迹线，可以确定相应DARPin PDGF-BB相互作用的结合速率和解离速率。
表1总结了所得结果。解离常数(Kd)用本领域技术人员已知的标准过程从估计的结合速率和解离速率计算。
表1.通过SPR确定的DARPin PDGF-BB相互作用(人和小鼠)的解离常数
n.d.:未测定
实施例3.具有对PDGF-BB的结合特异性的DARPin对成纤维细胞增 殖的抑制
NIH-3T3成纤维细胞是用于涉及PDGF-BB的分析的标准细胞系。在第1天70-80％汇合时，收获细胞并以生长培养基中5000细胞/孔的密度接种到96孔培养板中，接着饥饿细胞约7-8小时，随后更换培养基为分析培养基并孵育24小时。所有的孵育条件均为37℃，5％CO2流。细胞饥饿之后，在第2天，更换培养基为含有稀释系列的生长因子人PDGF-BB(用于增殖分析)或20ng/mL人PDGF-BB与2.5倍稀释系列的DARPin(200nM到0.05nM)的抑制混合物(用于抑制分析)的新鲜的分析培养基。在加入20μL WST-1试剂(Roche产品编号11644807001)后，细胞在这个条件下再孵育48小时。该试剂使分析活细胞数的比色分析成为可能。在加入WST-1后2、4和6小时的几个时间点，于A450处读取信号，具有A600的校正背景。
表2总结了实施例结果。利用GraphPad Prism软件以及本领域技术人员已知的标准过程从上述所得的滴定曲线计算IC50值。图1中给出了DARPin#49的滴定曲线的例子。
表2.各种DARPin对PDGF-BB诱导的NIH-3T3细胞增殖的抑制效力
实施例4.通过受体竞争试验对与PDGF-BB特异性结合的DARPin 的表征
在受体竞争ELISA(基于PDGF-BB Quantikine，R&D***)中确定PEG化的抗-PDGF-BB DARPin抑制人PDGF-BB结合其受体PDGFRβ的效力。PDGFRβ/Fc嵌合体预包被于微板上。DARPin在具有确定量的PDGF-BB的PDGF-BB Quankinine试剂盒(R&D***)的分析稀释液中预孵育并在室温下750rpm振摇孵育2小时。这些预孵育混合物然后转移到预包被的孔中，且没有被DARPin阻断的任何PDGF-BB被固定的受体结合。在洗掉任何未结合的物质后，对PDGF-BB特异性的辣根过氧化物酶连接的多克隆抗体加入孔中。在洗涤以除去任何未结合的抗体-酶试剂后，在孔中加入底物溶液，并与结合的PDGF-BB的量成比例地显色。停止显色，且在405nm下测量颜色强度。在这个试验中，如表3中总结的，测试的DARPin显示高PDGF-BB抑制效力。图2中给出了对于一组DARPin的示例滴定曲线。利用GraphPad Prism软件以及本领域技术人员已知的标准过程从如上所述获得的这种滴定曲线计算IC50值。
表3.DARPin对PDGF-BB与其受体PDGFRβ相互作用的抑制(给出平均IC50值)
实施例5.具有对PDGF-BB的结合特异性的DARPin对小鼠中激光诱 导的脉络膜血管新生的抑制
在体内测试对新生血管生长的效果。选择小鼠激光脉络膜血管新生模型并按照发表所述进行(Takahashi,K.,Saishin,Y.,Saishin,Y.,King,A.G.,Levin,R.和Campochiaro,P.A.,Arch.Ophthalmol.127(4),494-499,2009)。
如前所述，通过激光光凝诱导的Bruch膜破裂诱导脉络膜血管新生(CNV)。在第2天，用盐酸***(100mg/kg体重)麻醉成年C57BL/6小鼠，并用1％托吡卡胺扩瞳。用OcuLight GL二极管激光器中的狭缝灯递送***对每个视网膜递送三次532nm二极管激光光凝(75μm光斑大小，持续0.1秒，120mW)烧伤，用手持的盖片作为接触透镜来观察视网膜。在视网膜后极的9、12和3点钟方向进行烧伤。在激光的同时产生的气泡(其意味着Bruch膜的破裂)是获得脉络膜血管新生的重要因素，并因此在本实验中只包括其中产生气泡的烧伤。如图3所示，每天分别施用浓度为10或1mg/kg的DARPin#61-PEG20。在第14天，小鼠用荧光素标记的葡聚糖灌注心脏，如所描述的(Takahashi等,loc cit)制备视网膜平面装备(flat-mounts)，并通过图像分析定量血管新生的面积。用1元ANOVA和Dunnett后检验比较所有DARPin组与溶媒组进行统计分析。本领域技术人员熟知这些技术。图3示出了结果。

Claims (26)

1.包含至少一个锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中与PDGF-BB结合的Kd小于10-7M。
2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中抑制PDGF-BB与PDGFRβ结合的IC50值小于10-7M。
3.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域抑制PDGF-BB刺激的3T3成纤维细胞增殖的IC50值小于10-7M。
4.根据权利要求1-3任一项所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域与选自SEQ ID NO：23-60的锚蛋白重复结构域竞争结合PDGF-BB。
5.根据权利要求1-4任一项所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含与选自SEQ ID NO：23-60的一个锚蛋白重复结构域有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，
其中所述锚蛋白重复结构域中位置1的G和/或位置2的S任选地缺失，且
所述锚蛋白重复结构域中倒数第二位置的L和/或最后位置的N任选地被A置换。
6.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含与选自SEQ ID NO：23-60的一个锚蛋白重复结构域有至少76％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，
其中所述锚蛋白重复结构域中位置1的G和/或位置2的S任选地缺失，且
所述锚蛋白重复结构域中倒数第二位置的L和/或最后位置的N任选地被A置换。
7.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含与选自SEQ ID NO：23-60的一个锚蛋白重复结构域在其框架位置中有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，
其中所述锚蛋白重复结构域中位置1的G和/或位置2的S任选地缺失，且
所述锚蛋白重复结构域中倒数第二位置的L和/或最后位置的N任选地被A置换。
8.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域选自SEQ ID NO：23-60，
其中所述锚蛋白重复结构域中位置1的G和/或位置2的S任选地缺失，且
所述锚蛋白重复结构域中倒数第二位置的L和/或最后位置的N任选地被A置换。
9.根据权利要求1-8任一项所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域与选自SEQ ID NOs：23-60的锚蛋白重复结构域结合相同的表位。
10.根据权利要求1-7或9任一项所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含有选自如下组的氨基酸序列的锚蛋白重复模块：SEQ ID NO：12、14、15、17、18和19及SEQ ID NO：12、14、15、17、18和19中最多9个氨基酸被任意氨基酸置换的序列。
11.根据权利要求10所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含有选自下组的氨基酸序列的锚蛋白重复模块：SEQ ID NO：12、14、15、17、18和19及SEQ ID NO：12、14、15、17、18和19中最多2个氨基酸被任意氨基酸置换的序列。
12.根据权利要求10所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含有选自下组的氨基酸序列的锚蛋白重复模块：SEQ ID NO：12、14、15、17、18和19及SEQ ID NO：12、14、15、17、18和19的框架位置中最多8个氨基酸被任意氨基酸置换的序列。
13.根据权利要求10所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复模块具有氨基酸序列KDEEGTTPLHYAAVWGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:12)和SEQ ID NO:12中最多9个氨基酸被任意氨基酸所置换的序列，其中
位置3的E任选地被选自D、W、Q、I和Y的氨基酸置换；
位置4的E任选地被选自T、D、Y和S的氨基酸置换；
位置6的T任选地被选自S和F的氨基酸置换；
位置11的Y任选地被F置换；
位置14的V任选地被选自A、Y和T的氨基酸置换；
位置15的W任选地被选自F、K、V和Y的氨基酸置换。
14.根据权利要求13所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复模块具有氨基酸序列KDEEGTTPLHYAAVWGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:12)，其中SEQ ID NO:12的框架位置中最多8个氨基酸被任意氨基酸所置换，且其中
位置3的E任选地被选自D、W、Q、I和Y的氨基酸置换；
位置4的E任选地被选自T、D、Y和S的氨基酸置换；
位置6的T任选地被选自S和F的氨基酸置换；
位置11的Y任选地被F置换；
位置14的V任选地被选自A、Y和T的氨基酸置换；
位置15的W任选地被选自F、K、V和Y的氨基酸置换。
15.根据权利要求1-14任一项所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有选自下组的氨基酸序列的加帽模块：SEQ IDNO:13和16以及SEQ ID NO:13和16中最多8个氨基酸被任意氨基酸所置换的序列。
16.根据权利要求15所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有选自下组的氨基酸序列的加帽模块：SEQ ID NO:13和16以及SEQ ID NO:13和16的框架位置中最多7个氨基酸被任意氨基酸所置换的序列。
17.根据权利要求15所述的结合蛋白，其中所述具有与PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域包含具有氨基酸序列QDIYGATPADLAALVGHEDIAEVLQKLN(SEQ ID NO:13)或SEQID NO:13中最多8个氨基酸被任意氨基酸所置换的序列的C-末端加帽模块，且其中
位置3的I任选地被选自K、L、A和V的氨基酸置换；
位置4的Y任选地被选自W、F和S的氨基酸置换；
位置6的A任选地被K置换；
位置14的L任选地被选自F、Y和D的氨基酸置换；
位置15的V任选地被选自L、I、A和N的氨基酸置换；以及
位置23的V任选地被选自I和L的氨基酸置换。
18.根据权利要求15所述的结合蛋白，其中所述具有与PDGF-BB的结合特异性的锚蛋白重复结构域包含具有氨基酸序列QDIYGATPADLAALVGHEDIAEVLQKLN(SEQ ID NO:13)的C-末端加帽模块，其中SEQ ID NO:13的框架位置中最多7个氨基酸被任意氨基酸置换，且其中
位置3的I任选地被选自K、L、A和V的氨基酸置换；
位置4的Y任选地被选自W、F和S的氨基酸置换；
位置6的A任选地被K置换；
位置14的L任选地被选自F、Y和D的氨基酸置换；
位置15的V任选地被选自L、I、A和N的氨基酸置换；以及
位置23的V任选地被选自I和L的氨基酸置换。
19.根据权利要求1-4任一项所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含权利要求13的锚蛋白重复模块和权利要求17的C-末端加帽模块。
20.根据权利要求19所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:12的锚蛋白重复模块，紧接着是SEQ ID NO:13的C-末端加帽模块。
21.根据权利要求1-7和9-19任一项所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域的锚蛋白重复模块中的一个或多个氨基酸残基被锚蛋白重复单元比对时对应位置处存在的氨基酸残基置换。
22.根据权利要求1-4任一项所述的结合蛋白，包含序列SEQ IDNO：12-19和23-61中任一序列的肽。
23.编码根据权利要求1-22任一项所述的结合蛋白的核酸。
24.包含根据权利要求1-22任一项所述的结合蛋白或根据权利要求23所述的核酸及任选的药学上可接受的载体和/或稀释剂的药物组合物。
25.治疗选自渗出型年龄相关性黄斑变性、息肉状脉络膜血管新生和病理性近视的状况的方法，所述方法包括向需要所述治疗的患者施用治疗有效量的根据权利要求1-22任一项所述的结合蛋白。
26.治疗选自渗出型年龄相关性黄斑变性、息肉状脉络膜血管新生、和病理性近视的状况的方法，所述方法包括向需要所述治疗的患者施用治疗有效量的包含与PDGF-BB特异性结合的锚蛋白重复结构域和与VEGF-A特异性结合的锚蛋白重复结构域的结合蛋白。
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