CN104502605A - 检测犬弓形虫IgM抗体的ELISA试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测犬弓形虫IgM抗体的ELISA试剂盒及制备方法，属于生物技术领域。试剂盒采用羊抗犬IgM作为包被蛋白，依据捕获法ELISA原理检测犬血清中类弓形虫IgM类型抗体。试剂盒中96孔板中的包被抗原为羊抗犬IgM蛋白。本发明提供的酶联免疫试剂盒包括已包被的96孔板、阳性对照、阴性对照、辣根过氧化酶标记的弓形虫抗原P22、浓缩洗涤液、血清稀释液、TMB底物、终止液。本发明试剂盒可用于大批样品的筛查，试剂盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便。

Description

检测犬弓形虫IgM抗体的ELISA试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明为检测犬弓形虫IgM抗体的试剂盒，属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种犬弓形虫传染性疾病中检测抗体IgM的ELISA试剂盒及其制备方法。
背景技术
刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种世界性分布的致病原虫，为细胞内寄生的原虫，有多种冷血和温血动物都会通过不同形式感染，包括54种哺乳动物，70种鸟类，5种爬虫类，传染途径主要是摄取被猫科和犬科动物的体液或粪便污染过的食物。
健康正常人感染弓形虫后多呈无症状带虫免疫状态，但特殊人群感染后常引起严重后果，如孕妇感染后，经母婴垂直传播可致胎儿先天性畸形、流产和死胎；感染弓形虫后体内的免疫***最先分泌IgM抗体，对疑似感染的生物进行IgM抗体的检查更有利于早诊断，早治疗的原则。
弓形虫体表面还有多种表面抗原，可诱导宿主产生保护性免疫反应，P22表面抗原是弓形虫的主要表面抗原之一。
发明内容
本发明公开了一种检测犬弓形虫IgM抗体的基于捕获法ELISA方法的试剂盒及其制备方法，可用于弓形虫IgM抗体的大量筛查。
本发明还提供了一种采用基因重组技术，体外诱导表达、纯化P22抗原；采用过碘酸钠法对上述纯化蛋白进行辣根过氧化物酶标记。
本发明的目的是以原核表达的重组蛋白为基础，通过酶联免疫技术研制一种检测犬弓形虫IgM抗体的间接ELISA试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于检测犬弓形虫IgM抗体的捕获法ELISA试剂盒，所述的试剂盒包括由辣根过氧化物酶标记的P22蛋白。
还包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、酶标示踪物、酶标试剂、阳性对照、阴性对照。
上述用于检测犬弓形虫IgM抗体的捕获法ELISA试剂盒包括：
所述ELISA板条：每个试剂盒装有1块ELISA微孔板，每块ELISA板条为可自行拆卸的已包被抗原蛋白的ELISA微孔板，包被抗原蛋白为羊抗犬IgM，规格为8孔×12条；
所述ELISA微孔板的体积为300μl；
所述血清稀释液为即用型的牛血清白蛋白溶液；
所述洗涤液为25倍浓缩的磷酸盐缓冲液，使用前稀释；
所述底物显色液：即用型TMB显色液，10mL；
所述终止液：2mol/L的H2SO4溶液，10mL；
所述酶标试剂：所述辣根过氧化物酶标记的重组蛋白P22，使用前100倍稀释；
所述阳性对照为：经高温灭活的经疫苗免疫后一周内犬血清稀释液。
所述阴性对照为：经高温灭活的未患病且未经疫苗免疫的犬血清稀释液。
所述的捕获法ELISA试剂盒在检测犬弓形虫IgM抗体中的应用。
本发明是针对IgM抗体进行的检测，可以对弓形虫的早期感染进行检测，试剂盒可用于大批样品的筛查，试剂盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明的技术方案如下：
一、抗原制备
1.弓形虫P22蛋白的表达
根据GenBank中弓形虫P22基因序列，设计合成了1对引物，采用PCR方法从DNA中扩增出P22基因片段，将其克隆到表达载体pET28b中，构建了重组质粒pET-P22，测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。
2.弓形虫P22蛋白的纯化
诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用PBS洗涤重悬菌体，超声裂解(超声1s，间隔1s，共10min)，12000rpm离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。蛋白纯化时使用镍离子亲和层析柱，纯化后，经SDS-PAGE、western blotting鉴定，获取到单一条带，并具备较好的抗原性。使用BCA法测定纯化后蛋白含量，纯化后P22蛋白的OD值为1.65，与标准品比较后，其浓度为1000μg/ml。
二、试剂盒的建立
1.本发明试剂盒的检测原理
采用捕获法ELISA法，将羊抗犬IgM包被于微孔板中，然后用1％BSA将酶标板封闭，加入待测样本及标准阳性对照、阴性对照。样本或标准品中的弓形虫IgM抗体能与酶标板中包被的羊抗犬IgM反应，加入酶标P22蛋白后，酶标抗原与上一步反应结束的IgM抗原-抗体复合物结合。随后，加入辣根过氧化物酶底物TMB显色，终止液终止反应，通过酶标仪在450nm波长下，测定各孔吸光度值，OD值的大小(终止显色反应后颜色的深浅)与待测样本中弓形虫IgM抗体的含量成正比。
2.本发明试剂盒的组成
a)酶标板的最佳制备方法
用pH9.6的0.1M的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将纯化后羊抗犬IgM蛋白稀释后，按100ul/孔加入微孔板中，保证每孔中的羊抗犬IgM含量为0.1ug。4℃包被过夜，次日，弃去包被液，按200ul/孔加入1％BSA的封闭液，37℃静置2小时，洗涤甩干。室温干燥后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。
b)工作试剂的配置
洗涤液(pH 7.4，0.15M PBS)：KH2PO40.2g，Na2HPO4-12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸馏水至1000ml。浓缩成25倍作为存储液。
血清稀释液：牛血清白蛋白0.1g，加洗涤缓冲液至100ml
底物缓冲液(pH 5.0磷酸柠檬酸)：0.2M Na2HPO4 25.7ml，0.1M柠檬酸24.3ml，加蒸馏水50ml
TMB(四甲基联苯胺)使用液：TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml，底物缓冲液10ml，0.75％H2O2 32ul
终止液(2M H2SO4)：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml
c)检测弓形虫IgM抗体的捕获法ELISA试剂盒的组建
组建检测犬弓形虫IgM抗体的ELISA试剂盒，包含以下组分：
羊抗犬IgM包被的96孔酶标板
辣根过氧化物酶标记的P22蛋白
标准阳性对照
标准阴性对照
浓缩洗涤液
血清稀释液
TMB底物
终止液
产品说明书
三、样品中弓形虫IgM抗体的检测
1.用上述制备的试剂盒进行检测
1)将待测血清、阳性对照及阴性对照用抗体稀释液按比例稀释，每孔100μl加入酶标板，37℃孵育1小时。洗涤液清洗3-5次。
2)每孔加入稀释后酶标P22蛋白100μl，37℃孵育30min，洗涤液清洗3-5次。
3)每孔加入TMB底物液100μl，室温避光反应10-15分钟。
4)每孔加入100μl 2M H2SO4终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。
2.检测结果分析
1)测中阳性对照血清(PC)的OD值与阴性对照血清(NC)的OD值之差必须大于0.35时，检测被认为有效。
PC-NC≥0.35
Cut Off＝NC+0.05
其中NC＝阴性对照血清OD值
pC＝阳性对照血清OD值
2)检测时使用复孔，最终使用OD值为两个的平均值。
当血清样本的OD值低于Cut Off值时，该样本为弓形虫IgM抗体阴性。
当血清样本的OD值高于Cut Off值是，该样本为弓形虫IgM抗体阳性。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (6)

1.检测犬弓形虫IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述ELISA检测试剂盒以羊抗犬IgM为包被抗原，封闭后加入样本及标准阳性对照、阴性对照，以辣根过氧化物酶标记的弓形虫特异性抗原P22蛋白为标记蛋白，借助该酶标记蛋白，建立捕获法ELISA检测犬弓形虫IgM类型抗体，然后以辣根过氧化物酶底物TMB显色，终止液终止反应，测定各孔吸光度值。
2.根据权利要求1所述的检测犬弓形虫IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、酶标示踪物、终止液、阳性对照、阴性对照。
3.根据权利要求2所述的检测犬弓形虫IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：
所述ELISA板条：每个试剂盒装有1块96孔ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被羊抗犬IgM单克隆抗体的ELISA微孔板，规格为8孔×12条；
所述血清稀释液为即用型的牛血清白蛋白溶液；
所述洗涤液为25倍浓缩的磷酸盐缓冲液，使用前稀释；
所述底物显色液为即用型TMB显色液，10mL；
所述终止液为2mol/L的H2SO4溶液，10mL；
所述酶标示踪物：所述辣根过氧化物酶标记的弓形虫P22抗原，使用前100倍稀释；
所述阳性对照为：经高温灭活的经疫苗免疫后一周内犬血清稀释液。
所述阴性对照为：经高温灭活的未患病且未经疫苗免疫的犬血清稀释液。
4.制备权利要求1所述的检测犬弓形虫IgM抗体的ELISA试剂盒方法，其特征在于：用pH9.6的0.1M的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将羊抗犬IgM蛋白稀释后，按100ul/孔加入微孔板中，保证每孔中的羊抗犬IgM含量为0.1ug，4℃包被过夜，次日，弃去包被液，按200ul/孔加入1％BSA的封闭液，37℃静置2小时，洗涤甩干。室温干燥后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。
5.根据权利要求1所述检测犬弓形虫IgM抗体的ELISA试剂盒方法，其特征在于：辣根过氧化物酶标记的弓形虫P22抗原的制备是采用基因重组技术，体外诱导表达、纯化P22抗原；采用过碘酸钠法对上述纯化蛋白进行辣根过氧化物酶标记。
6.权利要求1所述的检测犬弓形虫IgM抗体的ELISA试剂盒在检测犬弓形虫IgM类型抗体中的应用。
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