CN104502599A - 25-羟基维生素d定量检测试纸条及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种25-羟基维生素D定量检测试纸条及其应用，属于医用试剂领域。本发明提供的试纸条包括样本垫、结合垫、NC膜、吸水垫和PVC衬板，所述样本垫上包被有25-OH VD活化的乳胶微粒和/或1，25-(OH)2VD活化的乳胶微粒，所述结合垫上涂布有胶体金标记的抗25-OH VD单克隆抗体及抗VDBP单克隆抗体，所述NC膜依次包括T线和C线，所述T线上包被有25-OH VD-BSA和部分表达的人VDBP，所述C线上包被有羊抗鼠抗体。采用本发明试纸条，无需样本预处理，能够快速、准确测定样品中维生素D的含量。

Description

25-羟基维生素D定量检测试纸条及其应用
技术领域
本发明涉及一种25-羟基维生素D定量检测试纸条及其应用，属于医药制剂领域。
背景技术
近年来，随着研究的不断深入，人们对维生素D(VD)有了更多的认识，VD是所有生物活性物质中一个非常独特的成员，具有多种作用，它是维生素，但本质上是激素，还可能是细胞因子。因为VD是来源于食物的必需营养物，而且人体需要量非常小，所以说它是维生素。它主要是在紫外线的照射下从皮肤内的7-脱氢胆固醇转变而来，然后随血液运行到全身发挥作用，所以属于类固醇类激素。人们逐渐认识到它具有更广泛的生理作用，除了调节钙磷代谢外，还具有抗增殖、抗分化、调节细胞凋亡、介导免疫反应、调节多种内分泌腺激素的分泌、调节造血组织造血的作用。这些功能是VD的类似物骨三醇(1,25-(OH)2VD)通过与具有VD受体(VDR)的细胞相结合并经过一系列生理生化过程而起作用的。这些肾外来源的骨三醇，作用于细胞周围的某一部位，所以按照其作用也可以认为是一种细胞因子。无论如何，VD及其类似物在临床上的重要意义越来越受到人们的重视，如何更加科学合理使用将是我们现在面临的重要课题。
维生素D是一种必须经过代谢转变才能达到最佳钙化醇生物活性的脂溶性类固醇衍生物。皮肤合成的维生素D3或小肠吸收的维生素D由维生素D结合蛋白(vitamin Dbinding protein，VDBP)运输，需在肝脏25-羟化酶CYP2R1和肾脏1α-羟化酶CYP27B1的催化下经2次酶促经化反应形成最终的活性代谢产物1，25一二羟基维生素D3(1,25-(OH)2VD)，与维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)结合发挥生物学功能。VDBP由肝脏合成，分子量为51335，含有458个氨基酸残基，与维生素D具有高度亲和力。每个VDBP分子都含有一个VD结合位点，其结合氨基酸位点为35-49氨基酸序列构成的结构域。因此，在血液中，VDBP存在两种形式，即与VD及其代谢物亲和结合的结合型VDBP(占VDBP总量的5％)和VD结合位点空缺的游离型VDBP。
人体的维生素D的活性形式是1，25二羟维生素D3(1,25-hydroxyvitamin D3)，是因为它是在1位和25位有两个羟基，其中25羟化是在肝脏完成的，1羟化是在肾脏完成的，而25羟VD3可以作为机体缺乏VD的指示指标。VD的主要功能是促进小肠钙磷的吸收，促进肾脏对钙磷的重吸收，调节体内钙磷代谢。所以，缺乏VD即使膳食中钙的量足够多，也会有缺钙现象的。不过，VD不易缺乏，因为人体内是可以合成的，晒晒太阳就行了，但是有严重肝、肾疾病的人就例外了，因为上述的VD3的羟化过程无法进行。
1,25(OH)2VD在体内的半衰期大约是4h，其浓度比25-OH VD低约1000倍，并受血清PTH、Ca2+及磷酸盐浓度的严格调控。1,25(OH)2VD水平不能反映人体维生素D状态，但是其升高与甲状腺机能亢进有关。因此，测定血清1,25(OH)2VD含量对获得性或遗传性25-OH VD和磷酸盐代谢紊乱(如慢性肾病、遗传性磷酸盐缺乏紊乱、肿瘤引起的骨软化、缺乏性佝偻病、慢性肉芽肿形成障碍)辅助诊断有重要价值。
目前，用于血清1,25(OH)2VD测定方法有HPLC、LC-MS/MS、RIA、CLIA等方法，其中由于HPLC、LC-MS/MS样本处理难、检测成本高等原因，在临床应用较少。目前，由于侧向层析技术的灵敏度高、特异性好、操作简便、检测成本低等特点，应用越来越广。
侧向层析技术，按其原理可分为两类，一类是以酶促反应显色为基础，以显色高度来定量；另一类则使用着色标记物如乳胶微粒、胶体硒、胶体金以及脂质体等，层析时，标记物与待测物反应形成的复合物被相应的固定在层析材料上的配体捕获而富集显色，根据层析材料上显色条带的有无或多少来定性或定量。以酶促反应显色为基础的免疫层析技术由于待测物的定量是以试纸条上以酶活性为依据，故其测量结果受酶稳定性以及样品基质、pH值、温育时间和温度等环境因素的影响。
免疫胶体金技术是继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展起来的固相标记免疫测定技术。80年代出现在临床诊断领域的胶体金免疫层析(colloidal goldimmunochromatography assay，GICA)快速诊断试纸条是建立在金标免疫渗滤基础上的一种免疫检测技术。它具有简单快速、结果明确、无需复杂操作技巧和特殊设备、灵敏度高、携带方便等优点，己成为临床实验诊断领域发展的一个新方向。因此，开发25-羟基维生素D测试试纸条在维生素D缺乏症的辅助诊断中有重要价值。
但是，在血清中80％以上25-OH VD与VDBP结合，通常的免疫检测方法是利用样本预处理液(如有机溶剂等蛋白变性剂)处理，将25-OH VD从VDBP解离释放后测定；或采用酸性的反应体系(pH4.0-6.0)进行测定；或采用高浓度的VDBP亲和结合物竞争释放25-OH VD，这些方法存在样本稀释过程或25-OH VD释放不完全或亲和结合物的亲和性等因素限制。因此，研发一种无需样本预处理、检测结果准确的25-羟基维生素D含量测定方法成为目前的难题。
发明内容
根据上述领域的不足和需求，本发明提供一种以25-羟基维生素D为目标物的检测试纸条，所述试纸条利用侧向层析原理，无需样本前处理，直接测定样本中25-OH VD的含量。
本发明请求保护的技术方案如下：
一种用于25-羟基维生素D定量检测的试纸条，包括样本垫、结合垫、NC膜、吸水垫及PCV衬板；所述样本垫、结合垫、NC膜和吸水垫按样品层析方向依次设置于PCV衬板上；
其特征在于：所述样本垫采用具有网状结构且可以捕获粒径为2.0-2.6μm之间的颗粒物的纤维垫，且包被有25-羟基维生素D活化的乳胶微粒和/或1，25-二羟基维生素D活化的乳胶微粒；
所述结合垫上涂布有胶体金标记的抗25-羟基维生素D单克隆抗体和胶体金标记的抗人维生素D结合蛋白单克隆抗体；
所述NC膜上包括检测线和质控线，所述检测线靠近所述结合垫，包被有25-羟基维生素D-牛血清白蛋白偶联物和重组人维生素D结合蛋白，所述质控线靠近吸水垫，包被有羊抗鼠抗体。
所述样本垫上25-羟基维生素D活化的乳胶微粒和/或1，25-二羟基维生素D活化的乳胶微粒的包被浓度为0.5-10μg/cm2。
所述结合垫上胶体金标记的抗25-羟基维生素D单克隆抗体的浓度为0-10μl/cm2；所述胶体金标记的抗人维生素D结合蛋白单克隆抗体的浓度为0-10μl/cm2。
所述NC膜的检测线上25-羟基维生素D-牛血清白蛋白偶联物的包被浓度为1.0-2.0μg/条，所述重组人维生素D结合蛋白的包被浓度为0-2.0μg/条；所述质控线上羊抗鼠抗体的包被浓度为0.5-2.0μg/条。
所述重组人维生素D结合蛋白为具有人维生素D结合蛋白第159-458位氨基酸序列的多肽。
所述样本垫上25-羟基维生素D活化的乳胶微粒和/或1，25-二羟基维生素D活化的乳胶微粒的包被浓度为2.0μg/cm2；所述结合垫上胶体金标记的抗25-羟基维生素D单克隆抗体的浓度为10μl/cm2，所述胶体金标记的抗人维生素D结合蛋白单克隆抗体的浓度为10μl/cm2；所述NC膜的检测线上25-羟基维生素D-牛血清白蛋白偶联物的包被浓度为1.0μg/条，所述重组人维生素D结合蛋白的包被浓度为1.0μg/条；所述质控线上羊抗鼠抗体的包被浓度为0.8μg/条。
一种用于25-羟基维生素D定量检测的方法，其特征在于：采用任一所述的试纸条检测样品中25-羟基维生素D的总含量，其步骤如下：
(1)将待测样品滴加在样本垫上，室温反应15min；
(2)待质控线显色后，将试纸条放入读条仪，读取样品中25-OH VD的浓度。
一种用于25-羟基维生素D定量检测的检测卡，包含任一所述的试纸条及卡盒，其特征在于：所述卡盒包括盒盖和盒底；所述试纸条设置于所述卡盒的盒底；所述卡盒的盒盖上具有加样孔和观察窗，所述加样孔正对所述试纸条上的样本垫，所述观察窗正对所述试纸条上的检测线和质控线。
本发明基于固相分离技术与免疫侧向层析技术提供一种用于25-羟基维生素D(25-OHVD)定量检测的试纸条，包括样本垫、结合垫、NC膜、吸水垫及PCV衬板等结构。所述试纸条采用特别的侧向层析***，无需样本前处理，直接测定样本中25-OH VD的总含量。
本发明试纸条的样本垫为具有网状结构的纤维垫，可以捕获粒径为2.0-2.6μm之间的颗粒物，其上包被有25-羟基维生素D活化的乳胶微粒(LP-25-OH VD)和/或1，25-二羟基维生素D活化的乳胶微粒(LP-1，25-(OH)2VD)。所述LP-25-OH VD为25-OH VD-BSA与活性乳胶微粒(LP)通过1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)法共价偶联而得。所述样本垫可以捕获样本中游离的VDBP，使游离型VDBP与结合型VDBP分离。其原理是具有网状结构的样本垫固定的VDBP亲和结合物(如25-OH VD)活化的乳胶微粒利用层析原理竞争释放25-OH VD，VDBP与25-OH VD亲和力较高(Ka＝5×108M-1)且VDBP高浓度存在(18～65μg/L)，而竞争结合物不能完全释放25-OH VD，从而捕获游离型VDBP，而结合型VDBP和游离的25-OH VD继续向前(吸水垫方向)泳动。
本发明试纸条的结合垫上涂布有胶体金(Colloidal Gold，CG)标记的抗25-羟基维生素D单克隆抗体(CG-anti-25-OH VD)和胶体金标记的抗人维生素D结合蛋白单克隆抗体(CG-anti-VDBP)。所述CG-anti-25-OH VD可以与样本中游离的25-OH VD结合，CG-anti-VDBP可以与样本中的人VDBP结合。
本发明试纸条的NC膜上从左至右依次包括检测线(T线)和质控线(C线)，所述T线上包被有25-OH VD-BSA和重组人VDBP(rProtein)，所述25-OH VD-BSA能够与样本中游离的25-OH VD竞争结合CG-anti-25-OH VD，形成25-OH VD-BSA-CG-anti-25-OH VD复合物，该复合物的量与样本中游离的25-OH VD含量相关；所述重组人VDBP为部分表达的人VDBP，缺少VD结合域氨基酸序列，因此不能与25-羟基维生素D结合，能够与样本中结合型VDBP竞争结合CG-anti-VDBP，形成rProtein-CG-anti-VDBP复合物，该复合物的量与样本中结合型25-OH VD的含量相关。所述C线上包被有羊抗鼠抗体，该抗体能够与CG-anti-25-OH VD和CG-anti-VDBP结合，用以判定结果的有效性，显色为有效，无色为无效。
本发明试纸条的吸水垫和PCV衬板，分别为试纸条提供层析泳动动力、支撑和保护。
本发明试纸条检测样本中维生素D含量的原理是：游离的25-OH VD与NC膜T线上的包被物25-OH VD-BSA竞争结合CG-anti-25-OH VD，结合了游离型25-OH VD的CG-anti-25-OH VD继续向前泳动，与NC膜C线上的包被物羊抗鼠抗体结合；结合型VDBP与T线上的包被物重组人VDBP竞争结合CG-anti-VDBP，结合了结合型VDBP的CG-anti-VDBP继续向前泳动，与C线包被物羊抗鼠抗体结合。此法为竞争法，即样本中25-OH VD含量越高，结合在T线上的CG-anti-25-OH VD和CG-anti-VDBP越少，显色越浅，吸光度越低，反之则越高，由T线显色的深浅即可判定VD的含量。而C线结合CG-anti-25-OH VD和CG-anti-VDBP仅作为有效性判定，显色则有效，反之则无效。由于1，25-(OH)2VD与25-OH VD的结构极其相似，因此本发明25-OH VD试纸条测定的结果为1，25-(OH)2VD和25-OH VD的总含量，但是由于1，25-(OH)2VD在血液中的浓度远低于25-OH VD，因此对25-OH VD测定结果的影响可以忽略。
为了提高本发明试纸条检测***的准确度，发明人从样本垫包被物、样本垫包被物的浓度、结合垫上胶体金标记抗体的浓度及包被量、T线蛋白种类及包被量等方面进行了优化。在本发明的一些实施例中，所述样本垫包被物优选LP-25-OH VD和/或LP-1，25-(OH)2VD，包被浓度为2.0μg/cm2；所述结合垫上CG-anti-25-OH VD的浓度为10μl/cm2，所述CG-anti-VDBP的浓度为10μl/cm2；所述NC膜T线上25-OH VD-BSA的包被浓度为1.0μg/条，所述重组人VDBP的包被浓度为1.0μg/条，所述质控线上羊抗鼠抗体的包被浓度为0.8μg/条。
本发明还提供一种用于25-羟基维生素D定量检测的方法，采用本发明提供的试纸条进行检测，只需将少量样品滴加在样本垫上，室温下放置15min，待质控线显色后，将试纸条放入读条仪，读条仪读取检测线和质控线的吸光度后自动代入仪器预设的校准曲线(四参数拟合)进行计算，直接给出25-羟基维生素D的浓度。该方法无需进行样本前处理，操作简便，定量快速准确，便于临床VD含量的测定。
综上所述，本发明提供的用于25-羟基维生素D定量检测的试纸条能够快速、准确的检测样品中维生素D的含量。与现有的检测方法相比，采用本发明试纸条进行VD含量检测具有以下优点：(1)操作简便：由于血液中80％以上25-OH VD与VDBP结合，常规方法需要进行样本预处理，使25-OH VD暴露后进行检测，而本发明试纸条采用两种抗体分别捕获游离型25-OH VD和结合型25-OH VD，无需样本预处理，简化了实验步骤，节约了时间；(2)定量准确：普通试纸条如果不进行样本预处理，只能检测到游离的25-OH VD，而本发明试纸条可以同时检测游离型和结合型25-OH VD，准确性高。
附图说明
图1.本发明试纸条的结构示意图，其中1-PVC衬板，2-样本垫，3-结合垫，4-T线，5-NC膜，6-C线，7-吸水垫；
图2.rProtein与anti-VDBP、25-OH VD结合能力；
图3.NC膜T/C线包被示意图；
图4.本发明试纸条检测结果与IDS试剂盒检测结果的直线拟合。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行解释，需要说明的是，下述实施例仅作为对本发明的进一步解释和说明，而不以任何方式限制本发明。
试验所用试剂：
活性乳胶微粒(Latex Particle)：其颗粒表面具有活性基团可以与蛋白质共价结合，购于Merck公司，货号39510001。
25-OH VD-BSA：即25-OH VD与BSA通过共价键偶联获得的偶联物，购于上海惠斯生物。
1,25-(OH)2VD-BSA：即1,25-(OH)2VD与BSA通过共价键偶联获得的偶联物，购于上海惠斯生物。
25mM MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸(sigma，M3671)缓冲液：称取4.88g MES于900mL超纯水中，完全溶解后调节pH5.0，定容至1L。
EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)溶液：sigma，39391。
pH7.510mM PBS：称取0.27g磷酸二氢钾(KH2PO4)(国药，10017608)、1.42g磷酸氢二钠(Na2HPO4)(国药，100203008)，8g氯化钠(NaCl)(国药，10019308)、0.2g氯化钾(KCl)(国药，10016308)于900mL超纯水中，完全溶解后调节pH至7.5，然后用容量瓶定容至1L。
10mM Tris-HCl：称取1.576g(国药，xw020034)于900mL超纯水中，完全溶解后调节到所需的pH值，然后定容至1L。
1％柠檬酸缓冲液：称取1.0g柠檬酸三钠(国药，10019428)于100mL超纯水中，至完全溶解。
5％BSA：称取5g BSA(amresco，0332)于100ml PBS溶液中，至完全溶解。
TBS：50mM Tris–HCl，150mM NaCl，1.5mM EDTA，10mM DTT，0.5％TritonX-100，0.2mg/ml lysozyme，pH 7.4。
2M H2SO4：取100mL浓硫酸于800ml超纯水中。
Anti-VDBP：抗人VDBP单克隆抗体，购于公司Santa cruz，货号sc-365441。
Anti-25-OH VD：即抗25-羟基维生素D抗体，一种可以与25-OH VD亲和结合的免疫球蛋白，购于Meridian，货号K24124M。
读条仪：C10066-10，滨松。
纤维垫：用作样本垫，Fusion5，GE。
本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可通过本领域常规方法配制或商购获得，规格为实验室纯级即可。
实施例1、25-羟基维生素D定量检测试纸条的制备
(一)VDBP重组蛋白的表达及验证
rProtein重组蛋白即人VDBP部分序列159-458氨基酸通过GST融合蛋白的表达方式在E.coli***表达(表达载体是PET28a，采用的E.coli细胞是BL21(DE3)，购于北京全式金生物技术有限公司)。细菌在含有100mg/ml氨苄西林(23YT-Amp)的LB培养基中培养，37℃过夜培养后以1:10比例放大培养。当菌液浓度(A600)达到0.8-0.9时，加入0.5mM IPTG进行诱导表达。25℃培养12-15h后，离心收集菌体并用TBS缓冲液重悬。超声破碎细菌液，40w，10s，10s，50次；12000rpm，4℃离心15min，收集上清液。采用GE GSTrap FF纯化柱(GE，71-5016-96AK)进行蛋白纯化，蛋白浓度用A280/A260进行测定。
用anti-VDBP和25-OH VD-BSA分别包被微孔板(购于深圳金灿华)，1.0ug/ml(pH7.510mM PBS)，100ul/孔。37℃条件下放置2小时后，弃去孔内液体，加入5％BSA，150ul/孔。37℃条件下放置1小时后，弃去孔内液体，待用。
将不同浓度的rProtein加入上述微孔板中，100ul/孔，37℃孵育1小时；然后弃去孔内液体，用PBST(pH7.510mM PBS含0.05％Tween-20)洗板5次，加入HRP标记的抗GST抗体(购于北京义翘神州，11213-MM05；用PBST以1:10000的比例稀释)，100ul/孔，37℃孵育0.5小时；然后弃去孔内液体，用PBST洗板5次，加入底物(购于北京索莱宝，PR1200)100ul/孔，37℃孵育10分钟后加入2M H2SO4终止液，50ul/孔，测定其吸光度(A450nm)。
结果如图2所示，重组蛋白rProtein可以与anti-VDBP结合，而不与25-OH VD结合。
(二)25-OH VD活化的乳胶微粒的制备
1、乳胶微粒(LP)的活化
取1mg乳胶微粒，用1mL 25mM MES(pH5.0)缓冲液洗涤3次(每次混匀10min)；
(1)配制10mg/mL EDC(M＝191.7g/mol，C＝52mM)溶液(EDC溶解于冷的25mM MES，pH5.0)。
(2)将Latex Particle用440μL 25mM MES(pH5.0)重悬。
(3)加入10μL EDC溶液，充分混匀，缓慢振摇，30min，室温。
(4)将反应完成的离心管离心(3000rmp，5min)，去除上清，并用1mL 25mM MES，pH 5.0洗涤3次。
2、Latex Particle包被
(1)用300μL 25mM MES，pH 5.0重悬Latex Particle；
(2)加入10ul 10mg/ml 25-Hydroxy Vitamin D3-BSA(上海惠斯生物)(25mM MES，pH5.0)溶液；
(3)用25mM MES，pH 5.0使反应体系定容为500μL，充分混匀；
(4)缓慢振摇，室温30-120min或4℃2小时；
(5)将反应完成的离心管离心(3000rmp，5min)，去除上清。
3、Latex Particle洗涤和保存
(1)用500μL 25mM MES(pH 5.0)洗涤4次；
(2)加入100μL 0.1-0.5％BSA(amresco，0332)，30-60min，室温；
(3)用100μL 50mM Tris-HCl(pH 6.8，含1％Tween-20)(sigma，44112)洗涤4次，得25-OH VD活化的乳胶微粒(LP-25-OH VD)；
(4)加入1mL 5％BSA保存。
(三)金标结合物的制备
(1)取100mL 0.01％HAuCl4(国药，10010711)溶液，加热至沸腾。
(2)加入2.0mL 1％柠檬酸三钠溶液，加热搅拌15min。
(3)关掉加热旋扭，适当速度搅拌至室温，得胶体金溶液(Colloidal Gold，CG)。
(4)量取20.0mL的胶体金置于100.0mL的小烧杯中，在搅拌的状态下缓慢加入0.4mg待标记蛋白(如anti-VDBP、anti-25-OH VD)，搅拌30min。
(5)加入5％BSA至终浓度为1％，继续搅拌30min。
(6)以12000r/min离心30min，弃去上清液，用PBST重悬。
(7)以12000r/min离心30min，弃去上清液，用PBST重悬。
(8)以12000r/min离心30min，弃去上清液，沉淀用1％BSA重悬，得到1.0mL浓缩物(即金标结合物)，置4℃冰箱备用。
(四)样本垫、结合垫的预处理
(1)将样品垫(Fusion 5，GE)和结合垫(上海金标生物科技有限公司)用1％BSA浸泡30min，37℃烘干。
(2)将25-OH VD活化的乳胶微粒(LP-25-OH VD，2.0ug/cm2)涂布于样本垫上，37℃烘干。
(3)取金标结合物滴加到结合垫上(10uL/cm2)，37℃烘干。
(五)T/C线(检测线/质控线)包被
C线(质控线)：用1mg/mL羊抗鼠抗体包被NC膜(135s，Millipore)C线(见图3a、图3b)，每条1.0μL，37℃干燥。
T线(检测线)：将1.0mg/mL 25-羟基维生素D-牛血清白蛋白偶联物和1.0mg/mL的重组人维生素D结合蛋白按照1：5的比例混合包被NC膜(135s，Millipore)(见图3c、图3d)，每条包被1.0μg混合物，37℃干燥。
(六)组装试纸条
将样本垫、结合垫、NC膜、吸水垫(CH37M，上海金标生物科技有限公司)、PVC衬板(上海金标生物科技有限公司)、卡盒(金灿华)，由下到上，由内到外进行组装(见图1)。
实施例2、样本垫包被物的选择
通过优选样本垫包被物以提高本发明试纸条检测***的性能。根据测定结果，采用2例临床样本(25-OH维生素D含量高值H、低值L)按照表1制备添加回收样本，计算回收率，选择最优的包被物。
表1添加回收样本制备方法
筛选方法如下：
(1)分别选用LP-25-OH VD、LP-1,25-(OH)2VD或25-OH VD-BSA包被样本垫(2.0ug/cm2)，包被方法同实施例1；
(2)层析试纸条制备方法同实施例1；
(3)加入100μL样本，室温反应15min；
(4)据读条仪计算25-OH VD，然后由公式(1)计算回收率R。
R = C × ( V o + V ) - C o × V o V × C 8 × 100 % .................公式(1)
其中：R为回收率；
V为加入样本体积；
V0为基质样本的体积；
C为混合样本的检测浓度；
C0为基质样本的检测浓度；
Cs为加入样本的浓度。
结果如表2所示，使用LP-25-OH VD、LP-1,25-(OH)2VD两者或两者之一包被的样本垫效果较好。
表2不同样本垫包被物的回收率
实施例3、LP-25-OH VD的包被浓度选择
由于LP-25-OH VD的包被浓度影响人血清中游离VDBP的捕获效率，因此需对其包被浓度进一步优化。优化方法同实施例2。
筛选方法如下：
(1)选用不同浓度LP-25-OH VD包被样本垫，包被步骤同实施例1；
(2)层析试纸条制备方法同实施例1；
(3)加入100μL样本，室温反应15min；
(4)据读条仪计算25-OH VD，然后由公式(1)计算回收率R。
实验结果如表3所示，LP-25-OH VD浓度以25-OH VD-BSA浓度表示，最优的LP-25-OH VD浓度为2.0ug/cm2。
表3不同LP-25-OH VD浓度的回收率
实施例4、结合垫上GC-anti-25-OH VD、GC-anti-VDBP的浓度选择
由于GC-anti-25-OH VD、GC-anti-VDBP的浓度影响人血清中游离25-OH VD和结合25-OH VD的测定结果，因此需对其浓度进一步优化。优化方法同实施例3。
结果如表4所示，GC-anti-25-OH VD最优的包被浓度为10ul/cm2，GC-anti-VDBP优选浓度范围为0-10ul/cm2，最优的包被浓度为10ul/cm2。
表4结合垫不同浓度GC-anti-25-OH VD、GC-anti-VDBP条件下的回收率
实施例5、NC膜T线上25-OH VD-BSA、rProtein的浓度选择
由于25-OH VD-BSA、rProtein的浓度影响人血清中游离25-OH VD和结合25-OH VD的测定结果，因此需对其浓度进行优化。优化方法同实施例3。
结果如表5所示，其中25-OH VD-BSA优选浓度范围为1.0-2.0ug/条，最优的包被浓度为1.0ug/条；rProtein优选浓度范围为0-2.0ug/条，最优的包被浓度为1.0ug/条。
表5T线不同浓度25-OH VD-BSA、rProtein条件下的回收率
实施例6、临床样本测定
用上述优化条件制备的试纸条，测定用IDS 25OH VD测定试剂盒(ImmunodiagnosticSystems Limited，国食药监械(进)字2011第2403360号)赋值的临床样本40例，以IDS25OH VD测定试剂盒结果为X轴，以本发明试纸条测定结果为Y轴，进行直线拟合。
测定方法如下：
(1)将100μL待测样品滴加在样本垫上，室温反应15min；
(2)待质控线显色后，将试纸条放入读条仪(C10066-10，滨松)，读取样品中25-OHVD的浓度。
结果如图4所示，实验获得的线性方程为Y＝0.98X+0.4，线性相关系数r为0.91。由此表明，测定结果与IDS测定结果相关性很好，采用本发明试纸条测定样品中25-OH VD的含量准确性高。

Claims (8)

1.一种用于25-羟基维生素D定量检测的试纸条，包括样本垫、结合垫、NC膜、吸水垫及PCV衬板；所述样本垫、结合垫、NC膜和吸水垫按样品层析方向依次设置于PCV衬板上；
其特征在于：所述样本垫采用具有网状结构且可以捕获粒径为2.0-2.6μm之间的颗粒物的纤维垫，且包被有25-羟基维生素D活化的乳胶微粒和/或1，25-二羟基维生素D活化的乳胶微粒；
所述结合垫上涂布有胶体金标记的抗25-羟基维生素D单克隆抗体和胶体金标记的抗人维生素D结合蛋白单克隆抗体；
所述NC膜上包括检测线和质控线，所述检测线靠近所述结合垫，包被有25-羟基维生素D-牛血清白蛋白偶联物和重组人维生素D结合蛋白，所述质控线靠近吸水垫，包被有羊抗鼠抗体。
2.根据权利要求1所述的试纸条，所述样本垫上25-羟基维生素D活化的乳胶微粒和/或1，25-二羟基维生素D活化的乳胶微粒的包被浓度为0.5-10μg/cm2。
3.根据权利要求1所述的试纸条，所述结合垫上胶体金标记的抗25-羟基维生素D单克隆抗体的浓度为0-10μl/cm2；所述胶体金标记的抗人维生素D结合蛋白单克隆抗体的浓度为0-10μl/cm2。
4.根据权利要求1所述的试纸条，所述NC膜的检测线上25-羟基维生素D-牛血清白蛋白偶联物的包被浓度为1.0-2.0μg/条，所述重组人维生素D结合蛋白的包被浓度为0-2.0μg/条；所述质控线上羊抗鼠抗体的包被浓度为0.5-2.0μg/条。
5.根据权利要求1所述的试纸条，所述重组人维生素D结合蛋白为具有人维生素D结合蛋白第159-458位氨基酸序列的多肽。
6.根据权利要求1所述的试纸条，所述样本垫上25-羟基维生素D活化的乳胶微粒和/或1，25-二羟基维生素D活化的乳胶微粒的包被浓度为2.0μg/cm2；所述结合垫上胶体金标记的抗25-羟基维生素D单克隆抗体的浓度为10μl/cm2，所述胶体金标记的抗人维生素D结合蛋白单克隆抗体的浓度为10μl/cm2；所述NC膜的检测线上25-羟基维生素D-牛血清白蛋白偶联物的包被浓度为1.0μg/条，所述重组人维生素D结合蛋白的包被浓度为1.0μg/条；所述质控线上羊抗鼠抗体的包被浓度为0.8μg/条。
7.一种用于25-羟基维生素D定量检测的方法，其特征在于：采用权利要求1-6任一所述的试纸条检测样品中25-羟基维生素D的总含量，其步骤如下：
(1)将待测样品滴加在样本垫上，室温反应15min；
(2)待质控线显色后，将试纸条放入读条仪，读取样品中25-OH VD的浓度。
8.一种用于25-羟基维生素D定量检测的检测卡，包含权利要求1-6任一所述的试纸条及卡盒，其特征在于：所述卡盒包括盒盖和盒底；所述试纸条设置于所述卡盒的盒底；所述卡盒的盒盖上具有加样孔和观察窗，所述加样孔正对所述试纸条上的样本垫，所述观察窗正对所述试纸条上的检测线和质控线。
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