CN104502554A - 一种他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法 - Google Patents
一种他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法。本发明是以活性酯法将肟化他达那非与牛血清白蛋白偶联，合成人工免疫抗原，并用于免疫动物，制备特异性抗他达那非及其类似物抗体。另外将肟化他达那非与卵清白蛋白偶联，用于构建免疫检测方法。抗他达那非及其类似物抗体经分离纯化后标记于纳米胶体金，然后和他达那非及其类似物检测抗体以及羊抗兔IgG分别固化在一载体上，在检测溶液中加入检测抗原。本发明的方法对保健品、中成药中违法添加他达那非及其类似物的最低检出限度为10μg/kg，且在5分钟内完成快速检测。方法稳定、快速、准确，适合于进行一步法违法添加药品的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及食品药品安全检测技术领域，尤其涉及一种他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法。
背景技术
有植物原料生产的功能食品和中成药被认为安全和无副作用，近年来在全世界广受消费者青睐。其中，天然***品(naturalaphrodisiacs)是其中最为活跃的产品类型。但是，天然壮阳产品中违法添加磷酸二酯酶-5抑制剂(PDE-5inhibitors)，增加壮阳效果以促进销售，谋取非法利益的行为，已经成为全球性的问题。
在上世纪90年代初期，辉瑞公司的一个用于治疗冠心病的PDE-5抑制剂药物，在II、III期临床中发现能够有效治疗阳痿，这就是后来风靡世界的“枸橼酸西地那非”。之后，另两个PDE-5抑制剂药物伐地那非和他达那非相继在市场上取得巨大的成功，不法分子合成了PDE-5抑制剂药物及其结构类似物，违法添加到天然药物中增加装药疗效，以促进销售牟取不正当利益。
目前，US-FDA批准上市用于治疗阳痿的PDE-5抑制剂有：枸橼酸西地那非(Viagra，辉瑞)、盐酸伐地那非(Levitra，拜尔)和他达那非(Cialis，礼莱)。在中成药、保健品中违法添加的PDE-5抑制剂药物，不仅包括以上三种药品，还包括对获准上市的PDE-5药品进行了结构衍生化的结构类似物(structural analogues)。
违法添加PDE-5抑制剂药物的危害性体现在：首先，PDE-5抑制剂药物会引起一系列副作用，如头痛、面部潮红、消化不良、视力模糊和肌肉酸痛。美国FDA官方网页(http：//www.fda.gov/medwatch/report.htm.)发布的药物不良反应信息显示，服用Viagra可能导致失明(2005年)，服用Viagra、Levitra和Cialis会导致听力突然下降甚至失聪(2007年)。因此，世界各国对PDE-5药物都严格按照处方药管理，在没有医生指导下服用违法添加的该类药品是危险的。其次，PDE-5抑制剂与硝酸酯药物的相互作用会导致严重的低血压。硝酸酯药物广泛应用于糖尿病、高血压，高血脂和冠心病的治疗，患有这些疾病而又伴随阳痿症状的病人，往往求助于天然***品。如果这些病人所服用的天然药品中含违法添加的PDE-5药物，将会导致可怕的后果。
其中，他达那非及其结构类似物在保健食品中添加，在近期有明显上升的趋势。如下是他达那非及其被发现的类似物的结构式，方框部分的结构是他达那非药效必需基团。
上文讲述了包括他达那非在内PDE-5抑制剂的危害性，对于众多他达那非结构类似物，问题显得更加复杂。首先，由于PDE-5抑制剂药品没有进行过毒理和安全性实验，存在很多的未知危害因素。其次，西地那非类似物比获准上市的同类药物具有更强的药理活性，如他达那非类似物氨基他达那非和去甲他达那非与他达那非相比，对PDE-5的50％抑制浓度都更低，药理活性更高。再者，PDE-5抑制剂类似物由于结构被修饰，导致药物在体内的生物学分布和药代动力学发生改变，从而增加了危险因素。从结构上推测，他达那非类似物正丁基他达那非和辛基他达那非的代谢稳定性和脂溶性增强，在体内能够维持长时间的高血药浓度，并且更加容易通过血脑屏障产生严重的视觉障碍。
违法添加的PDE-5抑制剂类似物对消费者的健康危害程度更大，必须加强对PDE-5抑制剂类似物监管和筛查。近年来，世界各国的检测部门和科研机构为开发违法PDE-5药物筛查方法做了大量的工作，主要有以下几种技术：①薄层层析(TLC)技术。TLC技术简单易行，检测成本低廉，适用大规模初步鉴定。T.S.Reddy等使用碘化铋钾显色，建立了高效薄层层析(HPTLC)技术，在标准品的参照下，筛查天然药品中违法添加的PDE-5药物取得了良好的效果。②高效液相色谱(HPLC)和液质联用(LC-MS)技术。高效液相色谱(HPLC)技术被广泛应用于PDE-5药物的筛查，其最大的优势是可以实现定量检测。液质联用(LC-MS)能够结合检品的质谱信息对违法添加的PDE-5药物进行确证检验。③HPLC和LC-MS只能检测已知的PDE-5药物。对于分子结构被蓄意修饰的新出现的PDE-5的类似物，由于色谱行为和质谱行为与已知药物存在差异，只有液相/串联离子阱质谱(LC/ESI-MS/MS)技术能够检测。该技术把LC分离得到的检品用电喷雾电离(ESI)转换为准分子离子，经碰撞室(CID)进行解离产生的特征离子碎片在二级质谱(MS2)进行检测。综合分析检品液相分离结果以及串联质谱得到的化合物结构信息，可以在同一过程中检测出已知的和未知的PDE-5药物。④除了昂贵的LC/ESI-MS/MS，只有通过水解产物分析，推测新出现的PDE-5的类似物的分子结构。通过对检品进行酸解，用LC-MS对水解产物进行分析，掌握该检品的各水解产物的柱保留时间和m/z值，与已知的PDE-5药物标准品的水解产物的LC-MS检测结果进行比较，可以推测目标检品的精确结构。
以上的仪器检测方法虽然灵敏、准确、可靠，但是设备昂贵复杂、运行条件苛刻、对人员素质要求高、不能进行现场检测，其打假检测工作效果存在局限性。必须有快速、灵敏、可靠、价廉的现场检测方法加以补充。
现有的他达那非及其类似物快速检测方法主要是化学检测方法和薄层色谱检测方法，检测的灵敏度和抗干扰能力有提高的需要。免疫学检测方法灵敏、特异、快速和价廉，在环境监测和食品安全领域已广泛应用，在食品药品安全快速检测中也越来越被给予厚望。
不法商人为了规避监管，不断推出他达那非结构类似物进行违法添加，必须开发一种能够同时检测他达那非及其结构类似物的免疫学方法，才能够有效打击该类违法添加行为。
本发明涉及突出他达那非及其类似物共同基团的人工抗原合成方法，以人工免疫抗原免疫动物诱导产生能够识别他达那非及其类似物共同基团的特异性抗体，开发检测违法添加他达那非及其类似物的胶体金免疫层析方法，为大规模的专项筛查工作提供高效的技术工具。
经文献检索，未发现利用胶体金免疫层析方法检测他达那非及其类似物的相关报道。本发明专利为食品药品安全检测工作提供新的工具。
发明内容
本发明的目的在于克服现有免疫检测技术只能检测一种目标物质的不足，通过有针对性的抗原设计，免疫动物诱导产生既能够识别他达那非，还能够识别所有潜在的他达那非结构类似物的通用抗体，提供一种能够他达那非及其类似物这一系列物质的纳米胶体金标记免疫测定方法，应用于食品药品安全检测领域，改变了传统的违法添加多步繁锁检测问题，实现一步法快速检测他达那非及其类似物违法添加的监管检测。
要实现本发明，重点是合成突出他达那非及其类似物共同基团的人工抗原。必须把他达那非共价联接到蛋白质载体，合成人工免疫抗原，把他达那非及其被发现的类似物的结构式中方框所标识的化学基团暴露在人工免疫抗原的外部，才能诱导动物免疫反应产生识别他达那非药效必需基团的通用抗体。
只要是他达那非类似物，就肯定含有他达那非及其被发现的类似物的结构式中所标识的他达那非药效必需基团，就一定能够被按上述设计方案获得的通用抗体所识别。从而实现同时检测这一整类物质的技术构想。
本发明采用如下技术方案：
本发明的他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法是以活性酯法将肟化他达那非与牛血清白蛋白(BSA)偶联，合成人工免疫抗原，并用于免疫动物，制备特异性抗他达那非及其类似物抗体。另外将肟化他达那非与卵清白蛋白(OVA)偶联，用于构建免疫检测方法。抗他达那非及其类似物抗体经分离纯化后标记于纳米胶体金，然后和他达那非及其类似物检测抗体以及羊抗兔IgG分别固化在一载体上，在检测溶液中加入检测抗原。在阴性样品检测过程中，在层析膜检测线区域形成“抗体-检测抗原-抗体”组成的“三文治”式抗原复合物，胶体金在检测区域集聚显色，从而产生检测信号。在阳性样品检测过程中，根据竞争抑制免疫层析原理，固相抗体和胶体金标记抗体都会被检品竞争结合，对层析膜检测线区域的“抗体-检测抗原-抗体”免疫复合物产生抑制，胶体金在检测区域不能集聚显色，从而不能产生检测信号。
这种方法产生的信号清晰而且稳定，检测灵敏度高、可靠性强。进行他达那非及其类似物的半定量分析测定，所建立的检测体系对保健品、中成药中违法添加他达那非及其类似物的最低检出限度为10μg/kg，且在5分钟内完成快速检测。方法稳定、快速、准确，适合于进行一步法违法添加药品的快速检测。
以下对本发明的技术方案作出进一步说明，其具体的步骤为：
人工免疫化合物的制备，半抗原的衍生化反应。通过肟化反应使他达那非接上活泼基团，而保留他达那非及其类似物共同结构，原理如下：
称取2mg他达那非那非溶解在2mL无水吡啶溶液中，加入5mg羧甲基羟胺，室温摇晃反应过夜。次日把吡啶用旋转蒸发仪蒸干，用5mL碳酸氢钠溶液溶解反应物，弃去沉淀。然后用盐酸调节pH值到3.0，用乙酸乙酯抽提。弃去水相。将收集的乙酸乙酯用旋转蒸发仪蒸干，得到肟化他达那非。
突出他达那非及其类似物共有基团人工免疫抗原合成方法，原理如下：肟化他达那非与NHS在EDC作用下缩合，形成肟化他达那非活泼酯：
肟化他达那非活泼酯在碱性条件下与蛋白质氨基缩合，合成突出他达那非及其类似物共同结构的免疫抗原：
采用改良活性酯法合成免疫抗原，将0.5mg半抗原溶于0.5mL无水甲醇，再加入0.05g碳二亚胺(EDC)和0.01g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下反应过夜，离心分离沉淀物，取上清夜，逐滴加入溶解在1.0mL的碳酸缓冲液(pH8.5)的含5mg阳离子化牛血清白蛋白(MBSA)的溶液中，室温震荡反应4反应小时。生理盐水透析72小时除去未反应的肟化他达那非，每6小时换透析液一次，分装冻存于-20℃冰箱。
突出他达那非及其类似物共有基团人工检测抗原合成方法，原理如下：肟化他达那非活泼酯在下与蛋白质氨基缩合，合成突出他达那非及其类似物共同结构的免疫抗原：
采用碳二亚胺法合成检测抗原，将0.2mg肟化他达那非溶于0.5mL无水甲醇，加入到1.0mL含5mg阳离子化卵清白蛋白(MOVA)的碳酸缓冲液(pH8.5)溶液中，再加入0.05g碳二亚胺(EDC)和0.01g NHS，室温下震荡反应过夜，离心分离沉淀物，取上清夜，磁力搅拌4反应小时。生理盐水透析72小时除去未反应的肟化他达那非活泼酯，每6小时换透析液一次，分装冻干备用。
经扫描鉴定他达那非及其类似物-BSA偶联物具备牛血清白蛋白(BSA)和他达那非及其类似物的吸收特征，他达那非及其类似物-OVA偶联物具备卵清白蛋白(OVA)和他达那非及其类似物的吸收特征。证明他达那非及其类似物人工免疫抗原和人工检测抗原合成成功。
抗他达那非及其类似物特异性抗体的制备：用合成的他达那非及其类似物-BSA免疫实验用新西兰大白兔，每只大白兔初次免疫用0.2mg/0.2mL免疫抗原加等量的福氏完全佐剂乳化后皮下注射免疫。初次免疫相隔28天，用0.1mg/0.1mL免疫抗原以福氏不完全佐剂乳化抗原后皮下注射，进行加强免疫。以后每隔21天以同样剂量加强免疫一次，共进行四次加强免疫。最后一次加强免疫后，7天以颈动脉取血收集兔子血清，-20℃冻存备用。
胶体金的制备：在100mL超纯水中加入1.0mL 1％浓度的氯金酸，加热至沸腾，再加入1％柠檬酸三钠溶液1mL，继续煮沸10分钟，冷却后，4℃保存备用，取样扫描测定最大吸收峰并进行透射电镜观察粒子大小。
胶体金标记抗他达那非及其类似物特异性抗体：调节如上制备的胶体金溶液(100mL)的pH值为8.2，快速搅拌下加入抗他达那非及其类似物特异性抗体400μg，使其终浓度为4μg/mL室温反应15分钟后，加入聚乙二醇(PEG)至终浓度为1％，继续搅拌15分钟。用15000r/min离心30分钟，吸去上清后所得沉淀即为纯化的金标记抗体，此金标记抗体复悬于保存液中，4℃保存。
硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜的处理：调节如上制备的100mL胶体金溶液的pH值为8.2，快速搅拌下加入经纯化的抗他达那非及其类似物抗体400μg，使其终浓度为4μg/mL，室温反应15分钟后，加入聚乙二醇PEG至终浓度为1％，继续搅拌15分钟，用15000r/min离心30分钟，吸去上清后所得沉淀即为纯化的金标记抗体，此金标记抗体复悬于保存液中，4℃保存。
免疫层析试纸条的制备。在60mm×300mm的单面胶PVC板上，依次粘贴上玻璃纤维素膜、已固定有金标记抗他达那非及其类似物抗体的玻璃纤维素膜、已平行包被他达那非及其类似物抗体和抗小鼠IgG抗体的硝酸纤维素膜、吸水玻璃纤维素膜。用切条机将粘贴好的PVC板纵向切成5mm×60mm的试纸条。
样品测试和结果判断方法：取0.2g(或0.2mL)样品，溶解在2.0mL无水乙醇中充分抽提目标检品。抽提液静止10分钟使杂质充分沉淀，取0.2mL上清液加入到20mL在含有0.05mg/mL他达那非检测抗原的样品检测液，充分摇匀成为样品检测液。用滴管在样品垫上滴加3-4滴液样品检测，羊抗兔IgG和他达那非及其类似物偶联OVA结合物分别喷涂在NC膜的质控线(C)和测试线(T)，含他达那非及其类似物待测样品经S端根据层析原理向另一端移动，并先后越过测试线和质控线，由于样品检测溶液中存在检测抗原，NC膜T线上的固相抗体和胶体金上标记的抗体在分别与检测抗原结合，在NC膜T线位置形成双抗体夹心免疫结合物，使T线显色产生检测信号。当样品中存在目标检品，免疫反应就会被竞争阻断，T现颜色会消失。
质控线(C)的原理与参考文献报道方法相同，是检验方法本身有效与否而设定，显色有效，不显色表明方法本身无效。
不含他达那非及其类似物的样品显明显的两条线，呈阴性结果。含2ng/mL他达那非及其类似物的样品，检测线已经大部分被抑制，呈弱阳性。他达那非及其类似物含量大于2ng/mL的样品，检测线全部被抑制，呈强阳性。
附图说明
图1是胶体金检测试剂装配图；
图中：1.底板；2.样品垫；3.胶体金垫；4.硝酸纤维素膜；5.吸水垫；6.检测线；7.质控线。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
实施例一：
突出他达那非及其类似物共有基团人工免疫抗原合成方法：(1)称取2mg他达那非那非溶解在2mL无水吡啶溶液中，加入5mg羧甲基羟胺，室温摇晃反应过夜。次日把吡啶用旋转蒸发仪蒸干，用5mL碳酸氢钠溶液溶解反应物，弃去沉淀。然后用盐酸调节pH值到3.0，用乙酸乙酯抽提。弃去水相。将收集的乙酸乙酯用旋转蒸发仪蒸干，得到肟化他达那非。(2)采用改良活性酯法合成免疫抗原，将0.5mg半抗原溶于0.5mL无水甲醇，再加入0.05g碳二亚胺(EDC)和0.01gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下反应过夜，离心分离沉淀物，取上清夜，逐滴加入溶解在1.0mL的碳酸缓冲液(pH8.5)的含5mg阳离子化牛血清白蛋白(MBSA)的溶液中，室温震荡反应4反应小时。生理盐水透析72小时除去未反应的肟化他达那非，每6小时换透析液一次，分装冻存于-20℃冰箱。(3)突出他达那非及其类似物共有基团人工检测抗原合成方法：采用碳二亚胺法合成检测抗原，将0.2mg肟化他达那非溶于0.5mL无水甲醇，加入到1.0mL含5mg阳离子化卵清白蛋白(MOVA)的碳酸缓冲液(pH8.5)溶液中，再加入0.05g碳二亚胺(EDC)和0.01g NHS，室温下震荡反应过夜，离心分离沉淀物，取上清夜，磁力搅拌4反应小时。生理盐水透析72小时除去未反应的肟化他达那非活泼酯，每6小时换透析液一次，分装冻干备用。
实施例二：
然后将经分离纯化的400μg，单抗加入预先制备的40nm大小胶体金溶液(pH为8.2)中，室温反应15分钟，加入聚乙二醇(PEG)至终浓度为1％，继续搅拌15分钟。用8000r/min离心30分钟，吸去上清后所得沉淀即为纯化的金标记抗体。将此金标记抗体结合物喷涂于玻璃纤维素膜上，将他达那非及其类似物偶联-OVA结合物喷涂于NC膜，作为测试线，将羊抗兔IgG喷涂于NC膜，作为质控线，然后将样品吸收垫、喷涂有胶体金抗体的的玻璃纤维、喷有测试线和质控线的NC膜以及吸水玻璃纤维依次粘贴于一塑料底板(5mm×6mm)。
测试样品时，取0.2g(或0.2mL)样品，溶解在2.0mL无水乙醇中充分抽提目标检品。抽提液静止10分钟使杂质充分沉淀，取0.2mL上清液加入到20mL在含有0.05mg/mL他达那非检测抗原的样品检测液，充分摇匀成为样品检测液。用滴管在样品垫上滴加3-4滴液样品检测，羊抗兔IgG和他达那非及其类似物偶联OVA结合物分别喷涂在NC膜的质控线(C)和测试线(T)，含他达那非及其类似物待测样品经S端根据层析原理向另一端移动，并先后越过测试线和质控线，由于样品检测溶液中存在检测抗原，NC膜T线上的固相抗体和胶体金上标记的抗体在分别与检测抗原结合，在NC膜T线位置形成双抗体夹心免疫结合物，使T线显色产生检测信号。当样品中存在目标检品，免疫反应就会被竞争阻断，T现颜色会消失。
质控线(C)的原理与参考文献报道方法相同，是检验方法本身有效与否而设定，显色有效，不显色表明方法本身无效。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：所述方法是以活性酯法将肟化他达那非，通过活泼酯法与阳离子化牛血清白蛋白偶联合成人工免疫抗原，把他达那非及其类似物共同结构暴露在人工抗原外部，并用于免疫动物，制备特异性抗他达那非及其类似物共同结构的抗体；
将肟化他达那非用碳二亚胺法与卵清白蛋白偶联，合成检测抗原，确保他达那非及其类似物共同结构暴露在人工抗原外部，将获得的抗体与检测抗原配合构建检测胶体金免疫层析检测***，用于构建同时检测他达那非及其结构类似物的免疫检测方法；
然后将抗他达那非及其类似物共同结构的抗体经分离纯化后标记于纳米胶体金，再将抗他达那非及其类似物共同结构的抗体标记在在硝酸纤维素膜(NC膜)载体的检测线(T线)上，羊抗兔IgG固化在质控线上，构建胶体金检测卡；
检测样品时在样品检测溶液中添加检测抗原，NC膜T线上的固相抗体和胶体金上标记的抗体在分别与检测抗原上的他达那非及其类似物共同结构结合，在NC膜T线位置形成双抗体夹心免疫结合物，使T线显色产生检测信号，样品中存在目标检品，免疫反应就会被竞争阻断，T现颜色会消失，从而使胶体金在固相与进行他达那非及其类似物的半定量分析测定。
2.如权利要求1所述的他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：
(1)对他达那非进行肟化衍生化方法，并把衍生化他达那非连接到不同的蛋白质载体，构建把他达那非及其类似物共同结构暴露在外部的突出他达那非及其类似物共有基团人工免疫抗原和人工检测抗原；
(2)使用突出他达那非及其类似物共同结构的人工免疫抗原免疫家兔，诱导产生抗他达那非及其类似物多克隆抗体，收集血清并使用免疫亲和层析法纯化特异性抗体；
(3)胶体金的制备；
(4)抗他达那非及其类似物特异性抗体标记胶体金；
(5)把抗他达那非及其类似物共同结构的抗体标记在在硝酸纤维素膜(NC膜)载体的检测线(T线)上，羊抗兔IgG固化在质控线上，构建胶体金检测卡；
(6)在检测过程中NC膜T线上的固相抗体和胶体金上标记的抗体在分别与检测抗原上的他达那非及其类似物共同结构结合，在NC膜T线位置形成双抗体夹心免疫结合物，使T线显色产生检测信号。
3.如权利要求2所述的他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的他达那非肟化衍生化方法的具体步骤如下：取2mg他达那非溶解在2mL无水吡啶溶液中，加入5mg羧甲基羟胺，室温摇晃反应过夜，次日把吡啶用旋转蒸发仪蒸干，用5mL碳酸氢钠溶液溶解反应物，弃去沉淀，然后用盐酸调节pH值到3.0，用乙酸乙酯抽提，弃去水相，将收集的乙酸乙酯用旋转蒸发仪蒸干，得到肟化他达那非。
4.如权利要求2所述的他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的突出他达那非及其类似物共有基团人工免疫抗原的合成方法如下：采用改良活性酯法合成免疫抗原，将0.5mg半抗原溶于0.5mL无水甲醇，再加入0.05g碳二亚胺和0.01g N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应过夜，离心分离沉淀物，取上清夜，逐滴加入溶解在1.0mL的碳酸缓冲液的含5mg阳离子化牛血清白蛋白的溶液中，室温震荡反应4反应小时，生理盐水透析72小时除去未反应的他达那非及其类似物，每6小时换透析液一次，分装冻存于-20℃冰箱。
5.如权利要求2所述的他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的突出他达那非及其类似物共有基团人工检测抗原的合成方法如下：采用碳二亚胺法合成检测抗原，将0.2mg肟化他达那非溶于0.5mL无水甲醇，加入到1.0mL含5mg阳离子化卵清白蛋白的碳酸缓冲液溶液中，再加入0.05g碳二亚胺和0.01g NHS，室温下震荡反应过夜，离心分离沉淀物，取上清夜，磁力搅拌4反应小时，生理盐水透析72小时除去未反应的肟化他达那非活泼酯，每6小时换透析液一次，分装冻干备用。
6.如权利要求4或5所述的他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：所述的碳酸缓冲液的pH＝8.5。
7.如权利要求2所述的他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：步骤(3)中，胶体金采用常规的柠檬酸还原法制备。
8.如权利要求2所述的他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：步骤(5)的具体步骤为：用微定量喷头喷涂两条平行线于硝酸纤维素膜上，抗他达那非及其类似物抗体作为测试线，羊抗兔IgG作为质控线，用定量喷头喷涂金标记抗他达那非及其类似物抗体于玻璃纤维素膜上，干燥硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜后备用。
9.如权利要求2所述的他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：步骤(6)的具体步骤为：取0.2g或0.2mL样品，溶解在2.0mL无水乙醇中充分抽提目标检品，抽提液静止10分钟使杂质充分沉淀，取0.2mL上清液加入到20mL在含有0.05mg/mL他达那非检测抗原的样品检测液，充分摇匀成为样品检测液，用滴管在样品垫上滴加3-4滴液样品检测，羊抗兔IgG和他达那非及其类似物偶联OVA结合物分别喷涂在NC膜的质控线(C)和测试线(T)，含他达那非及其类似物待测样品经S端根据层析原理向另一端移动，并先后越过测试线和质控线，由于样品检测溶液中存在检测抗原，NC膜T线上的固相抗体和胶体金上标记的抗体在分别与检测抗原结合，在NC膜T线位置形成双抗体夹心免疫结合物，使T线显色产生检测信号，当样品中存在目标检品，免疫反应就会被竞争阻断，T现颜色会消失。
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