CN104498511A - 小麦蛋白激酶基因TaSTPK及其在培育耐盐植物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦蛋白激酶基因TaSTPK及含有所述基因TaSTPK的植物表达载体，本发明还公开了所述基因TaSTPK在培育耐盐植物中的应用。转基因功能验证，本发明所述转基因植株耐盐性有所提高，此成果有望为创造新型耐盐植物，提高植物耐盐能力，改良作物品种提供有力的帮助。

Description

小麦蛋白激酶基因TaSTPK及其在培育耐盐植物中的应用

技术领域

本发明涉及一种小麦蛋白激酶基因及其应用，尤其涉及一种小麦蛋白激酶基因TaSTPK及其在培育耐盐植物中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

蛋白激酶是一类催化蛋白磷酸化的酶，催化ATP上的磷酸基转移到受体蛋白特定的氨基酸残基上，导致蛋白质构象改变，从而使蛋白质功能激活或失活。根据磷酸化底物中氨基酸残基的不同，植物中的蛋白激酶有丝/苏氨酸类蛋白激酶，酪氨酸激酶，组氨酸激酶等。其中丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶的结构和序列上保守性很高。

蛋白激酶在植物信号识别与转导过程中起着重要的作用。植物在生长发育中经常受到低温、干旱和高盐等不良环境的胁迫，植物感受干旱、高盐刺激后，胁迫信号经历一系列传递过程，最后诱导特定功能基因的表达，在生理生化上作出调节反应。

目前关于蛋白激酶研究的报道有：Zaidi等人2012年的研究结果表明，将硬粒小麦中的一种MAP磷酸激酶在酵母中过量表达，导致其盐耐受能力，尤其是氯化锂的耐受力提高。Zhaoshi Xu等2008年的研究中曾经报道过一种SnRK2亚家族的蛋白激酶W55a在干旱、高盐及外源ABA、水杨酸、乙烯、茉莉酮酸甲酯等的刺激下上调表达，该基因在拟南芥中过量表达时，拟南芥的耐旱性增强，表明W55a与多种胁迫信号转导相关。但是经检索有关小麦中的TaSTPK基因的研究还未见报道，TaSTPK是小麦丝/苏氨酸类蛋白激酶家族的一个成员，关于该基因序列及其应用的文献未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种小麦蛋白激酶基因TaSTPK及其在培育耐盐植物中的应用。

本发明所述小麦蛋白激酶基因TaSTPK，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该核苷酸序列来自小麦品种济南177，由1485个脱氧核糖核苷酸组成。

本发明还提供了含有上述小麦蛋白激酶基因TaSTPK的植物表达载体pSTART-TaSTPK。

本发明所述的小麦蛋白激酶基因TaSTPK可广泛用于培育耐盐农作物品种。

本发明所述小麦蛋白激酶基因TaSTPK在培育耐盐植物中的应用。进一步的，本发明所述含基因TaSTPK的植物表达载体pSTART-TaSTPK在培育耐盐植物中的应用。

其中：所述植物优选是拟南芥或小麦。

实验证明，将本发明的基因TaSTPK在拟南芥中过表达后，盐胁迫下种子的萌发时间和萌发率都较野生型拟南芥及空载体对照株系有明显提前和升高(见图2)，说明该基因确实参与了盐胁迫下种子的萌发过程。试验中，任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，本发明优选的载体是pSTART。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因TaSTPK的植物表达载体进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)等。

本发明从小麦中分离得到小麦蛋白激酶基因TaSTPK，然后将该基因转化到拟南芥和小麦中，进行转基因功能验证(小麦和拟南芥转化筛选及盐胁迫表性分析)，确定了在盐胁迫下测试样种子萌发过程的耐盐性有所提高，进一步明确了所述小麦蛋白激酶基因TaSTPK在培育耐盐植物中的应用。预示本发明成果有望为创造新型耐盐植物，提高植物耐盐能力、改良作物品种提供有力的帮助。

附图说明

图1：TaSTPK蛋白功能域预测。

图2：转pSTART-TaSTPK纯合株系与空载体对照在不同NaCl浓度下萌发时间和萌发率统计。

具体实施方式

以下实施例用于阐明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照产品制造生产厂商的使用说明。

实施例1

一、TaSTPK基因的获得

利用正向引物：5’-AATCTAGATAACAACGCCCAATGGACTAC-3’，反向引物：5’-AAGAGCTCCTATTGAGAGAGAGGCTGGTTGT-3’扩增TaSTPK核苷酸序列，扩增程序为①94℃ 4min；②94℃ 50sec；③56℃ 50sec；④72℃ 1min 30sec(2到4共40个循环)；⑤72℃ 10min；扩增产物进行琼脂糖电泳分离，回收并连接pEASY-T3(全式金公司)克隆载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经测序后确定克隆核苷酸序列正确(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)。

TaSTPK基因的编码区cDNA为1485bp，编码蛋白含有494个氨基酸(氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)，蛋白分子量为56.2kD，将TaSTPK基因的氨基酸序列在数据库中进行检索发现，该基因编码的蛋白有丝氨酸/苏氨酸激酶功能区，ATP结合位点，因此该蛋白应为一种蛋白激酶，见图1。

二、重组表达载体的构建

选用pSTART载体作为该基因的过表达构建载体，根据TaSTPK基因的序列设计正向和反向引物，正向引物：5'–AATCTAGATAACAACGCCCAATGGACTAC-3'，反向引物：5'-AAGAGCTCCTATTGAGAGAGAGGCTGGTTGT-3'，以步骤一中带有TaSTPK基因正确序列的克隆载体为模板，测序正确的阳性克隆和载体质粒均使用XbaI/SacI双酶切，由于TaSTPK基因内部存在SacI切点，因此双酶切时使用不完全酶切。将目的基因和载体连接，获得pSTART-TaSTPK植物表达载体。

三、转化植物并培养

1、导入农杆菌

制备好的农杆菌感受态(菌株：EHA105)取100μl，加入0.5-1μg DNA，轻轻混匀，冰浴30分钟，液氮中速冻1分钟，37℃水浴3-5分钟融化细胞，加500μl无抗生素YEB液体培养基，28℃轻摇2小时，5000rpm离心1分钟，去除部分上清，留150-200μl涂板，平板含利福平和相应抗生素，28℃倒置培养两天。

2、转化拟南芥

选抽薹期的拟南芥(Col-0)，将主花序顶端减去，促进测生花序生长，在准备转化前一周不要浇水。将5ml已活化的农杆菌加到250ml YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，测菌液浓度至OD₆₀₀＝1.0-1.2，6000rpm离心15分钟收集菌体，用转化介质将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.8-0.9，加入Sillwet至终浓度为0.02％。花序浸入转染液中15秒，将花盆水平放置，在黑暗中培养24小时，随后22℃，长日照(16小时光照，8小时黑暗)培养，收取种子。四、基因表达检测

1、转基因拟南芥中基因表达分析

转化后的拟南芥植株收获T₀代种子，在含有卡那霉素的1/2MS培养基上筛选，阳性植株移栽后再进行PCR检测。收获T₁代种子后，再进行播种和筛选，直至获得转基因纯合株系，以便进行后续的生理实验。将筛选到的转基因纯合株系进行RT-PCR检测，证实TaSTPK基因是过量表达的。

2.转基因拟南芥种子盐胁迫下种子萌发

将转基因纯合株系与空载体对照拟南芥在0、50mM、100mM NaCl条件下萌发，结果如图2所示，发现在没有盐存在的情况下，萌发率和萌发时间早晚没有显著差异，而在50mM和100mM NaCl条件下，转基因株系的萌发时间要早于空载体对照，并且在100mM NaCl条件下，转基因纯合株系萌发率均高于对照组。

在盐胁迫下，转空载体拟南芥的萌发受到影响，萌发时间和萌发率均受到影响，高盐浓度下，渗透胁迫会导致种子内部很难达到萌发需要的含水量，同时活性氧和过氧化物自由基的产生对细胞膜会产生伤害，高盐导致植物内源激素改变，呼吸作用受到影响，因此会对植物种子的萌发造成影响。转基因纯合株系OX1、OX2在50mM和100mM NaCl条件下的萌发时间和萌发率均未受到影响，说明TaSTPK基因的过量表达产物，在植物种子萌发过程中参与了盐胁迫信号的感受传递并诱导特定功能基因的表达，从而使植物在生理生化上作出调节反应。

实施例2

条件和方法同实施例1中三至四，转化植物为小麦，转基因小麦中基因表达分析结果与实施例1四中一致，均证实了在盐胁迫下测试样种子萌发过程的耐盐性有所提高。

Claims (5)

1.一种小麦蛋白激酶基因TaSTPK，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.一种含有权利要求1所述基因TaSTPK的植物表达载体pSTART-TaSTPK。

3.权利要求1所述小麦蛋白激酶基因TaSTPK在培育耐盐植物中的应用。

4.权利要求2所述植物表达载体pSTART-TaSTPK在培育耐盐植物中的应用。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述植物是拟南芥或小麦。