CN104483376A - 一种筛选环孢素a于免疫t细胞中药物作用靶位的方法 - Google Patents
一种筛选环孢素a于免疫t细胞中药物作用靶位的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104483376A CN104483376A CN201410843729.5A CN201410843729A CN104483376A CN 104483376 A CN104483376 A CN 104483376A CN 201410843729 A CN201410843729 A CN 201410843729A CN 104483376 A CN104483376 A CN 104483376A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- immune
- ciclosporin
- protein
- gel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种利用蛋白质组学技术对环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选的方法。本筛选环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位的方法利用蛋白质组学技术,对环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选,方法包括以下步骤:步骤1)建立环孢素A于免疫T细胞作用样品组群、步骤2)制备免疫T细胞二维电泳蛋白质样品、步骤3)双向凝胶电泳、步骤4)图像采集分析得出结果。本发明筛选环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位的方法,操作思路明确、结果真实可靠,克服了常规筛选手段由于分析数据过于庞大和复杂,造成筛选结果误差较大,准确率低的缺陷,为临床用药提供了具有药理意义和指导作用的检测结果。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用蛋白质组学技术对环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选的方法。
背景技术
环孢素A(cyclosprine,CsA)是由11个氨基酸组成的环状多肽,是土壤中一种真菌的活性代谢物。1978年英国首次将环孢素A应用于临床肾移植,此后环孢素A又用于肝、心、肺、胰腺、骨髓等器官的移植,均取得令人满意的效果,明显提高病人的生存率。1984年环孢素A进入我国,形成了环孢素A加硫唑嘌呤加激素的三联免疫抑制方案,大大提高了移植存活率,同时也使移植术后急性排斥反应的发生率大幅下降。环孢素A作为一种强效免疫抑制剂,近年来人们对它的研究越来越多,发现它还可用来治疗自身免疫性疾病、血液病及寄生虫病等。目前,临床上针对个体病患,环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位一直无法确定,且常规筛选手段由于分析数据过于庞大和复杂,造成筛选结果误差较大,准确率低,难以在临床用药时提供具有药理意义和指导作用的检测结果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的上述缺陷,提供一种利用蛋白质组学技术对环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选的方法。
为解决上述技术问题,本筛选环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位的方法利用蛋白质组学技术,对环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选,其具体方法包括以下步骤:
步骤1):将培养至第五日的免疫T细胞,分为等量的对照组和若干试验组,向试验组中分别加入不同浓度的环孢素A,整体形成环孢素A对免疫T细胞模型的药物作用样品组群;
步骤2):将步骤1)所述的环孢素A对免疫T细胞模型的药物作用样品组群培养至对数生长期;弃去培养液,刮取细胞收集细胞到若干对应的离心管;收集完成后用磷酸缓冲液冲洗细胞5次,经冲洗后吸干离心管内残留磷酸缓冲液,然后加入等体积10mol/L脲、50mmol/L DTT、5%的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺1-丙磺酸、30mmol/L三羟甲基氨基甲烷形成的混合溶液,反复冻融细胞5~8次;放入冰盐浴中静置30min;然后升温至10℃的条件下离心2h;离心完成后取上清液测定蛋白浓度,并根据测得的蛋白质浓度标记、分装,转移至70℃的保温箱中储存存储备用;
步骤3):将步骤2)中存储备用的上清液取出两组,每组各50ug,与等量10mol/L尿素、5%的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸,20mmol/L二硫苏糖醇0.5%的IPG缓冲液组成的混合液体混合;混合后加入IPG持胶槽中,IPG干胶条的胶面向下放入槽中,并于其表面涂抹一层有机矿物油,IPG持胶槽加盖后置于IPGphor水平电泳仪电极板上进行等电聚焦;等电聚焦结束后,IPG干胶条在平衡液中平衡30min;平衡完成后将IPG干胶条移至SDS-PAGE分离胶上,并以琼脂糖封胶,将玻璃板置于电泳槽中以恒流方式进行电泳,至电泳槽中溴酚蓝前沿延伸至距凝胶底边5mm处停止电泳,得到凝胶;
步骤4):将由步骤3)得到的凝胶染色,并用凝胶扫描仪透射扫描;将得到图像用PDQUEST软件进行分析,图像分析过程包括图谱的剪切,蛋白质点的检测,不同凝胶间的匹配,量的归一化以及利用内标2DMARKER的标准分了量和等电点确定胶内蛋白点的相对分子量和等电点;以正常条件下免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱为参考胶,与环孢素A作用下培养的免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱进行配比,获得环孢素A作用于免疫T细胞的差异表达蛋白质;
步骤5):将由步骤4)得到的差异表达蛋白质经胶内酶切后,通过质谱,测定差异表达蛋白质;与质谱库比较,筛选出差异表达蛋白质;明确差异蛋白后,其生物学功能确定,通过蛋白印迹验证,即得环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位。
本发明筛选环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位的方法,操作思路明确、结果真实可靠,克服了常规筛选手段由于分析数据过于庞大和复杂,造成筛选结果误差较大,准确率低的缺陷,为临床用药提供了具有药理意义和指导作用的检测结果。
具体实施方式
本将培养至第五日的免疫T细胞,分为等量的对照组和若干试验组,向试验组中分别加入不同浓度的环孢素A,整体形成环孢素A对免疫T细胞模型的药物作用样品组群;
步骤2):将步骤1)所述的环孢素A对免疫T细胞模型的药物作用样品组群培养至对数生长期;弃去培养液,刮取细胞收集细胞到若干对应的离心管;收集完成后用磷酸缓冲液冲洗细胞5次,经冲洗后吸干离心管内残留磷酸缓冲液,然后加入等体积10mol/L脲、50mmol/L DTT、5%的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺1-丙磺酸、30mmol/L三羟甲基氨基甲烷形成的混合溶液,反复冻融细胞5~8次;放入冰盐浴中静置30min;然后升温至10℃的条件下离心2h;离心完成后取上清液测定蛋白浓度,并根据测得的蛋白质浓度标记、分装,转移至70℃的保温箱中储存存储备用;
步骤3):将步骤2)中存储备用的上清液取出两组,每组各50ug,与等量10mol/L尿素、5%的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸,20mmol/L二硫苏糖醇0.5%的IPG缓冲液组成的混合液体混合;混合后加入IPG持胶槽中,IPG干胶条的胶面向下放入槽中,并于其表面涂抹一层有机矿物油,IPG持胶槽加盖后置于IPGphor水平电泳仪电极板上进行等电聚焦;等电聚焦结束后,IPG干胶条在平衡液中平衡30min;平衡完成后将IPG干胶条移至SDS-PAGE分离胶上,并以琼脂糖封胶,将玻璃板置于电泳槽中以恒流方式进行电泳,至电泳槽中溴酚蓝前沿延伸至距凝胶底边5mm处停止电泳,得到凝胶;
步骤4):将由步骤3)得到的凝胶染色,并用凝胶扫描仪透射扫描;将得到图像用PDQUEST软件进行分析,图像分析过程包括图谱的剪切,蛋白质点的检测,不同凝胶间的匹配,量的归一化以及利用内标2DMARKER的标准分了量和等电点确定胶内蛋白点的相对分子量和等电点;以正常条件下免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱为参考胶,与环孢素A作用下培养的免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱进行配比,获得环孢素A作用于免疫T细胞的差异表达蛋白质;
步骤5):将由步骤4)得到的差异表达蛋白质经胶内酶切后,通过质谱,测定差异表达蛋白质;与质谱库比较,筛选出差异表达蛋白质;明确差异蛋白后,其生物学功能确定,通过蛋白印迹验证,即得环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位。
本发明包括但不限于上述实施方式,任何符合本权利要求书描述的产品,均落入本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种筛选环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位的方法,其特征是:本方法利用蛋白质组学技术,对环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选,其具体方法包括以下步骤:
步骤1):将培养至第五日的免疫T细胞,分为等量的对照组和若干试验组,向试验组中分别加入不同浓度的环孢素A,整体形成环孢素A对免疫T细胞模型的药物作用样品组群;
步骤2):将步骤1)所述的环孢素A对免疫T细胞模型的药物作用样品组群培养至对数生长期;弃去培养液,刮取细胞收集细胞到若干对应的离心管;收集完成后用磷酸缓冲液冲洗细胞5次,经冲洗后吸干离心管内残留磷酸缓冲液,然后加入等体积10mol/L脲、50mmol/L DTT、5%的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺1-丙磺酸、30mmol/L三羟甲基氨基甲烷形成的混合溶液,反复冻融细胞5~8次;放入冰盐浴中静置30min;然后升温至10℃的条件下离心2h;离心完成后取上清液测定蛋白浓度,并根据测得的蛋白质浓度标记、分装,转移至70℃的保温箱中储存存储备用;
步骤3):将步骤2)中存储备用的上清液取出两组,每组各50ug,与等量10mol/L尿素、5%的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸,20mmol/L二硫苏糖醇0.5%的IPG缓冲液组成的混合液体混合;混合后加入IPG持胶槽中,IPG干胶条的胶面向下放入槽中,并于其表面涂抹一层有机矿物油,IPG持胶槽加盖后置于IPGphor水平电泳仪电极板上进行等电聚焦;等电聚焦结束后,IPG干胶条在平衡液中平衡30min;平衡完成后将IPG干胶条移至SDS-PAGE分离胶上,并以琼脂糖封胶,将玻璃板置于电泳槽中以恒流方式进行电泳,至电泳槽中溴酚蓝前沿延伸至距凝胶底边5mm处停止电泳,得到凝胶;
步骤4):将由步骤3)得到的凝胶染色,并用凝胶扫描仪透射扫描;将得到图像用PDQUEST软件进行分析,图像分析过程包括图谱的剪切,蛋白质点的检测,不同凝胶间的匹配,量的归一化以及利用内标2DMARKER的标准分了量和等电点确定胶内蛋白点的相对分子量和等电点;以正常条件下免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱为参考胶,与环孢素A作用下培养的免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱进行配比,获得环孢素A作用于免疫T细胞的差异表达蛋白质;
步骤5):将由步骤4)得到的差异表达蛋白质经胶内酶切后,通过质谱,测定差异表达蛋白质;与质谱库比较,筛选出差异表达蛋白质;明确差异蛋白后,其生物学功能确定,通过蛋白印迹验证,即得环孢素A于免疫T细胞中药物作用靶位。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410843729.5A CN104483376A (zh) | 2014-12-30 | 2014-12-30 | 一种筛选环孢素a于免疫t细胞中药物作用靶位的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410843729.5A CN104483376A (zh) | 2014-12-30 | 2014-12-30 | 一种筛选环孢素a于免疫t细胞中药物作用靶位的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104483376A true CN104483376A (zh) | 2015-04-01 |
Family
ID=52757945
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410843729.5A Pending CN104483376A (zh) | 2014-12-30 | 2014-12-30 | 一种筛选环孢素a于免疫t细胞中药物作用靶位的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104483376A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110731340A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-01-31 | 河南农业大学 | 一种防治黏虫的药物增效剂及其使用方法 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1627074A (zh) * | 2003-12-08 | 2005-06-15 | 胡军 | 活化淋巴细胞特异性的检测方法 |
CN1793933A (zh) * | 2004-12-27 | 2006-06-28 | 山东大学 | 利用蛋白质组学技术筛选强心苷药物作用靶位的方法 |
CN101062942A (zh) * | 2007-04-29 | 2007-10-31 | 北京大学第一医院 | 来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白及其编码基因 |
CN101200483A (zh) * | 2007-05-11 | 2008-06-18 | 中国人民解放军第四军医大学 | 抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反义核酸 |
CN101199836A (zh) * | 2007-11-07 | 2008-06-18 | 安徽省药物研究所 | 一种阶段释放型环孢素a固体微乳制剂及其微乳固化方法 |
CN101329300A (zh) * | 2008-07-18 | 2008-12-24 | 浙江大学 | 心肌细胞蛋白质差异表达图谱的构建与应用 |
CN102174111A (zh) * | 2011-01-25 | 2011-09-07 | 江苏省弗泰生物科技有限公司 | 人白介素2-Fc融合蛋白 |
-
2014
- 2014-12-30 CN CN201410843729.5A patent/CN104483376A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1627074A (zh) * | 2003-12-08 | 2005-06-15 | 胡军 | 活化淋巴细胞特异性的检测方法 |
CN1793933A (zh) * | 2004-12-27 | 2006-06-28 | 山东大学 | 利用蛋白质组学技术筛选强心苷药物作用靶位的方法 |
CN101062942A (zh) * | 2007-04-29 | 2007-10-31 | 北京大学第一医院 | 来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白及其编码基因 |
CN101200483A (zh) * | 2007-05-11 | 2008-06-18 | 中国人民解放军第四军医大学 | 抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反义核酸 |
CN101199836A (zh) * | 2007-11-07 | 2008-06-18 | 安徽省药物研究所 | 一种阶段释放型环孢素a固体微乳制剂及其微乳固化方法 |
CN101329300A (zh) * | 2008-07-18 | 2008-12-24 | 浙江大学 | 心肌细胞蛋白质差异表达图谱的构建与应用 |
CN102174111A (zh) * | 2011-01-25 | 2011-09-07 | 江苏省弗泰生物科技有限公司 | 人白介素2-Fc融合蛋白 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110731340A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-01-31 | 河南农业大学 | 一种防治黏虫的药物增效剂及其使用方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Fang et al. | Quantitative T cell repertoire analysis by deep cDNA sequencing of T cell receptor α and β chains using next-generation sequencing (NGS) | |
Idrisova et al. | Role of patient-derived models of cancer in translational oncology | |
CN107022548A (zh) | 一种人体抗aqp4自身抗体检测材料及其制备方法 | |
CN107167616A (zh) | 血型检测方法及装置 | |
CN103468735B (zh) | 重组华溪蟹金属硫蛋白(rcMT)及其单克隆抗体的制备 | |
CN101782585A (zh) | 肺癌组织蛋白印迹膜片及其制备方法 | |
CN104483376A (zh) | 一种筛选环孢素a于免疫t细胞中药物作用靶位的方法 | |
CN102766212A (zh) | 用于检测氟喹诺酮类药物残留的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒 | |
CN105319366A (zh) | 检测甲基对硫磷的时间分辨荧光免疫试剂盒及其检测方法 | |
CN103266164B (zh) | 一种亮氨酸氨基肽酶检测试剂 | |
CN106908291A (zh) | 一种血清葡萄糖标准物质的制备方法 | |
CN104749371B (zh) | 人肾母细胞瘤过度表达基因编码蛋白酶联免疫试剂盒 | |
CN102183577B (zh) | 同时检测血清中多种疾病特异的蛋白标志物的试剂盒 | |
CN104483371A (zh) | 一种筛选他克莫司于免疫t细胞中药物作用靶位的方法 | |
CN104483493A (zh) | 一种筛选咪唑立宾于免疫t细胞中药物作用靶位的方法 | |
Dzik et al. | Toward standardization of CD34+ cell enumeration: an international study | |
CN106085980A (zh) | 乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法 | |
CN105753932A (zh) | 猪脂肪组织中总蛋白的提取及ChREBP蛋白的Western blot检测方法 | |
CN113917160A (zh) | 采用her2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法 | |
CN103743906B (zh) | 用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微环境的试剂盒、***及方法 | |
CN102095776A (zh) | 脐带来源间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法 | |
RU2546531C1 (ru) | Способ определения пиридоксальфосфата в эритроцитах периферической крови | |
CN117659199A (zh) | 一种抗ca199抗体及其应用 | |
CN108070568A (zh) | 一种罕见病全基因组移植扩增方法 | |
Daniel et al. | ESM: Endothelial cell-derived triosephosphate isomerase attenuates insulin secretion from pancreatic beta cells male rats |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150401 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |