CN104479035A - 一种具有糖、脂代谢调节活性的滇黄精多糖提取物及其制备方法 - Google Patents
一种具有糖、脂代谢调节活性的滇黄精多糖提取物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明滇黄精多糖的提取方法及用途,以滇黄精为原料,洗净切片,自然晒干后,打成粗粉。用蒸馏水提取三次后浓缩到一定浓度,用无水乙醇沉淀得黄精多糖粗品。用蒸馏水溶解,加入α-淀粉酶去淀粉,再用无水乙醇沉淀后分别用无水乙醇、丙酮、***洗涤去脂溶性成分,得到黄色粉末。去离子水溶解后用Sevage法去蛋白,挥去有机溶剂后透析,最后冷冻干燥即得白色粉末的黄精多糖。得到的多糖用于制作片剂,具有降血压降血脂血糖的作用。
Description
技术领域
本发明涉及中药提取领域,具体涉及一种滇黄精多糖的提取物及其制备方法。
背景技术
黄精是我国重要的药食两用资源,《中国药典》2010版收载黄精为百合科黄精属植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll. Et Hemsl. 黄精P. sibiricum Red.或多花黄精P. cyrtonema Hua的干燥根茎,分别习称“大黄精”“ 鸡头黄精”或“姜形黄精”。
滇黄精在云南蕴藏量大,《滇南本草》、《云南植物志》等中均有其药用记载,是重要的“云药”品种,也是产量及市场份额最大的一个黄精品种,具有广泛的临床应用基础及良好的深入开发前景。
滇黄精多糖一直被认为是滇黄精中主要的化学成分类型,也是《中国药典》2010版中规定对滇黄精进行质量控制的化学成分。现研究表明滇黄精多糖具有降血糖降血脂以及增强人体免疫功能。
常规的多糖提取方法主要为粉碎药材、脱脂、脱色后,用水提醇沉的方法得到黄精多糖粗品,多糖的精制过程通常为离子交换、凝胶过滤及过层析柱后浓缩、冷冻干燥而得。上述多糖制备方法存在以下不足:首先,药材脱脂过程中频繁受热,多糖损耗较多,影响多糖的提取率;其次,脱脂、脱色过程复杂,时间长,成本高,难以规模化生产;此外,常规方法制备所得的多糖含杂质较多,多含有大分子物质如蛋白质、淀粉及酚类物质等,小分子物质葡萄糖及果糖等。
发明内容
本发明黄精多糖提取的原料为滇黄精,制片剂的原料是滇黄精多糖。
本法特点:
1. 所提粗多糖中常常含有大分子蛋白质、无机盐、木质素、色素及醇不溶的小分子有机物等杂质。本方法采用一次水提加多次醇沉的方法结合冷冻干燥,过程中除去了大分子物质淀粉、蛋白质及小分子物质等,最后一步透析除去无机小分子,挥去有机物质后冷冻干燥得到较纯的白色的黄精多糖。
2. 本法初提精制过程中避免了多糖颜色的变化,粗提精制过后得率为13%,黄精多糖为白色,紫外分光光度法检测精制多糖280nm处无吸收,即不含蛋白。用蒽酮-硫酸法测定多糖含量为85%以上。
3. 本法适用于用80%乙醇提取皂苷后回收的滇黄精粗粉,将回收的滇黄精粉末自然晾干以后,用本法继续提取多糖,提取率为9%。实现了资源回收再利用。
4. 本法得到的黄精多糖用于制备黄精多糖片剂,含糖量为10%,药理证明,黄精多糖具有降低甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、血糖及提高糖耐量的作用。
具体方法如下:
以滇黄精为原料,洗净切片,自然晒干后,打成粗粉;取500-1000g,用6-10倍量的蒸馏水提取三次,过滤,合并滤液后浓缩到含1.2g/ml的原生药,放置室温;在浓缩液中加入4倍量的无水乙醇,静置24h后于4000r/min条件离心10-20min,分离沉淀物,得黄精多糖粗品;用蒸馏水溶解,加入α-淀粉酶去淀粉;再用4倍量无水乙醇沉淀,加入4倍量的无水乙醇,静置24h后于4000r/min条件离心10-20min,分离沉淀物,分别用无水乙醇、丙酮、***洗涤去脂溶性成分,室温挥掉有机溶剂,得到黄色粉末;再用去离子水溶解后用Sevage法去蛋白,挥去有机溶剂后进行流水透析2天,去离子水透析1天,最后冷冻干燥即得白色粉末的黄精多糖。
所述的去淀粉步骤具体为:加入α-淀粉酶充分搅拌后于50℃水浴锅中水解淀粉至碘化钾溶液不变蓝为止;之后直接用沸水浴灭活α-淀粉酶5min;放至室温,离心弃杂。
所述的Sevage法去蛋白的具体步骤为:用去离子水溶解配成5%的溶液后加入氯仿-正丁醇=4:1,充分震荡萃取后于4000r/min条件下离心10min,分离取出上清液,除蛋白。
附图说明
图1 标准曲线图
图2 细胞TC含量图
图3 细胞TG含量
图中,***表示模型组与正常组相比P<0.01;###表示给药组与模型组相比P<0.01。
CON:正常组MOD:模型组GL:多糖低剂量组GM:多糖中剂量组GH:多糖高剂量组LGLT:罗格列酮中剂量组
具体实施方式
实施例1
将生滇黄精洗净自然晒干,晒干后干品得率为20%,将滇黄精打成粗粉,取100g粉末,分别用12倍量、10倍量、8倍量蒸馏水提取,提取时间分别为1.5h、1h、0.5h,提取温度设为80℃。合并三次提取液,浓缩浓度为1g/ml(原生药)。用4倍量无水乙醇沉淀24h后过滤,滤渣用蒸馏水溶解,加入α-淀粉酶去淀粉,再用4倍量无水乙醇沉淀,相同条件下离心取沉淀物,分别用无水乙醇、丙酮、***洗涤去脂溶性成分,室温通风干燥,挥掉有机溶剂,得到黄色粉末湿重含量为67.2g。粉末用蒸馏水溶解,后用Sevage法去蛋,挥去有机溶剂后进行流水透析2天,去离子水透析1天,最后冷冻干燥即得白色粉末的黄精多糖含量为13.7g。
实施例2
将实验室用80%乙醇提取皂苷后回收的滇黄精粉末,自然烘干后,称取100g,用上述同样的方法提取精制,粗提后得到的多糖湿重44g。精制过后冷冻干燥得9 g。
实施例3
滇黄精多糖片剂的制备:以重量份计,以千克为单位,分别称取:滇黄精多糖100份、木糖醇300份、糊精250份、微晶纤维素250份、甲壳素50份、柠檬酸25份、硬脂酸镁25份。
将上述滇黄精多糖、木糖醇、糊精、微晶纤维素、甲壳素充分混合,用水润湿,制软材,过筛、干燥后整粒,加入柠檬酸、硬脂酸镁,混合后压片,每片重250mg,活性成分滇黄精多糖含25mg。
本发明滇黄精总多糖具有降低脂甘油三酯和胆固醇的作用,具有一定的α糖苷酶抑制率,结果表明,黄精多糖可用于预防和调节糖脂代谢紊乱。
实施例4
1. 蒽酮-硫酸法测定滇黄精多糖纯度
1.1 对照品及样品的制备
精密称定于105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品50mg,置100mL容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,得0.5mg/mL的标准品溶液;精密称取滇黄精多糖粉末100mg,置100mL容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,得1mg/mL的样品溶液。
1.2 标准曲线的制定
精密量取对照品溶液0.1mL,0.2mL,0.3mL,0.4mL,0.5mL,0.6mL分别置于10mL试管中,各加蒸馏水至2.0mL,摇匀,在冰水浴中缓缓滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度,摇匀,放冷后置水浴中保温10分钟,取出,以不加样品为空白,用紫外分光光度法于582nm处测定吸光度。结果如表1,图1.
1.3 滇黄精多糖纯度的测定
用1.2的方法分别测定滇黄精多糖的的含量,配制的浓度分别为:0.01mg/mL,0.03mg/mL,0.050mg/mL,0.07mg/mL。根据吸光度带入标准曲线公式测定滇黄精多糖的纯度为85%以上,结果表2.
2. 滇黄精多糖α-糖苷酶抑制活性
2.1 材料与方法
材料及滇黄精总多糖的制备
α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase,EC 3.2.1.20),4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG,批号:101324963,CAS:3767-28-0);胎牛血清(Foetal Bovine Serum,LOT:1413865);其余化学试剂均为分析纯。
精密称取适量滇黄精多糖,分别配制成0.1mg/m,1mg/mL,10mg/mL,20mg/mL的浓度作为待测样品。
方法
在磷酸钾缓冲液(pH6.8)体系中,反应温度37℃,以pNPG为反应底物,加入α-糖苷酶,以Na2CO3为终止液。pNPG溶液无色,但经葡萄糖苷酶水解释放出对硝基苯酚(pNP),pNP在碱性条件下呈黄绿色,在400nm处有最大吸收,当加入α-葡萄糖苷酶抑制剂时,可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性,减少pNP的释放,因此可以通过吸光度的变化来测定抑制活性。
反应体系
取pH 6.8磷酸盐缓冲液725μL,待测样品溶液10μL,α-葡萄糖苷酶(0.15U/mL)100μL,混匀,以不加待测样品溶液作为空白对照( pH 6.8磷酸盐缓冲液补足),以不加酶溶液的反应体系作为背景除去,37℃恒温水浴保温10 min,再向反应体系中加入175μL 4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷( pNPG),恒温10 min后,立即加入2mL的0.1mol/L Na2CO3终止反应。
结果
由表可以看出在体外模型中,滇黄精总多糖对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用。如表3.
3. 滇黄精多糖对脂肪化肝L-02细胞脂代谢的调节作用
3.1 材料与方法
材料
正常人肝L-02细胞,医用脂肪乳(10%胎牛血清、10%医用脂肪乳及RPMI-1640培养液),正常培养液(含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液),及G0(含0.2%胎牛血清的RPMI-1640培养液)溶液等。
方法
造模:将细胞培养到一定数量后传到6孔板中,除正常组用正常培养液培养外,其余均用医用脂肪乳培养细胞48h,诱导肝L-02脂肪化后,分为模型组、滇黄精多糖低(10μg/mL)、中(50μg/mL)、高(100μg/mL)三个浓度组及罗格列酮(50μmol/L)组,每组做三个复孔。给药24h后测定细胞内甘油三酯(TG)及胆固醇(TC)的含量。
统计方法:正常组与模型组比较、给药组与罗格列酮比较用t检验、给药组间比较用单因素方差分析法。
3. 2 结果
由图2和图3可知,模型组细胞TC、TG含量显著高于正常组,通过给予滇黄精多糖及罗格列酮后,细胞TC、TG含量明显下降,且与模型组相比具有显著性差异,而滇黄精多糖作用与罗格列酮相比无显著性差异。由此得知滇黄精总皂苷具有明显的调节脂代谢活性。如图2,图3。
图中,***表示模型组与正常组相比P<0.01;###表示给药组与模型组相比P<0.01。
CON:正常组MOD:模型组GL:多糖低剂量组GM:多糖中剂量组GH:多糖高剂量组LGLT:罗格列酮中剂量组。
Claims (7)
1.滇黄精多糖的提取方法,其特征在于:
以滇黄精为原料,洗净切片,自然晒干后,打成粗粉;取500-1000g,用6-10倍量的蒸馏水提取三次,过滤,合并滤液后浓缩到含1.2g/ml的原生药,放置室温;在浓缩液中加入4倍量的无水乙醇,静置24h后于4000r/min条件离心10-20min,分离沉淀物,得黄精多糖粗品;用蒸馏水溶解,加入α-淀粉酶去淀粉;再用4倍量无水乙醇沉淀,加入4倍量的无水乙醇,静置24h后于4000r/min条件离心10-20min,分离沉淀物,分别用无水乙醇、丙酮、***洗涤去脂溶性成分,室温挥掉有机溶剂,得到黄色粉末;再用去离子水溶解后用Sevage法去蛋白,挥去有机溶剂后进行流水透析2天,去离子水透析1天,最后冷冻干燥即得白色粉末的滇黄精多糖。
2.如权利要求1所述的滇黄精多糖的提取方法,其特征在于:所述的去淀粉步骤具体为:加入α-淀粉酶充分搅拌后于50℃水浴锅中水解淀粉至碘化钾溶液不变蓝为止;之后直接用沸水浴灭活α-淀粉酶5min;放至室温,离心弃杂。
3.如权利要求1所述的滇黄精多糖的提取方法,其特征在于:所述的Sevage法去蛋白的具体步骤为:用去离子水溶解配成5%的溶液后加入4:1氯仿-正丁醇,充分震荡萃取后于4000r/min条件下离心10min,分离取出上清液,除蛋白。
4.权利要求1-3任意一项所述的滇黄精多糖的提取方法获得的滇黄精多糖。
5.一种滇黄精多糖药物制剂,其特征在于:将权利要求4所述的滇黄精多糖作为活性成分制备得到药物制剂。
6.如权利要求5所述的一种滇黄精多糖片剂,其特征在于:以重量份计,以千克为单位,原料为滇黄精多糖100份、木糖醇300份、糊精250份、微晶纤维素250份、甲壳素50份、柠檬酸25份、硬脂酸镁25份。
7.一种滇黄精多糖片剂,其特征在于:包含滇黄精多糖及药学上可接受的辅料。
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