CN104478828B - 2-氨基-7-取代苯并噻唑类化合物及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物化学领域，具体地涉及2-氨基-7-取代苯并噻唑类化合物及其制备方法与用途。本发明2-氨基-7-取代苯并噻唑类化合物能够显著抑制活化了的大鼠肝星状细胞胶原Ⅰ型和胞外基质的合成，并调控相关合成基因和酶类的表达，对小鼠肝纤维化模型细胞外周质生成也有明显的抑制作用，可以作为抗肝炎或抗肝纤维化的药物；2-氨基-7-取代苯并噻唑类化合物的制备方法，其制备原料来源广泛、反应步骤较短、后处理简便，并且产率较高。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体地涉及2-氨基-7-取代苯并噻唑类化合物及其制备方法与用途。
背景技术
肝病是严重威胁人类健康的疾病之一。按照病因，大致可分为感染性肝病和非感染性肝病。感染性肝病包括：乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)和丁型肝炎(HDV)、血吸虫病所导致的肝病等；非感染性肝病包括：先天性代谢缺陷(肝豆状核变性、血色病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症等)所导致的肝病、化学代谢缺陷(慢性酒精性肝病、慢性药物性肝病)所导致的肝病、自身免疫性肝炎、原发性肝汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎等。
据统计，肝炎是目前全世界患病面积巨大且患病人数众多的疾病之一，中国也是肝炎的高发区之一，大约超过10％的中国人被肝炎病毒感染过。
现有技术中对肝炎的防治主要以注射疫苗为主，并且乙肝疫苗已取得了较好的预防效果。但是，还没有研发出针对丙肝等其他类型肝炎的疫苗，这也导致还不能全面预防感染性肝炎。酗酒、吸烟等不良习惯、生活环境、遗传因素等因素，可使肝炎进而发展成为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等更严重的疾病。肝炎和肝癌病人常年受病魔折磨，医疗费用奇高，目前治疗肝炎和肝癌的干扰素，白细胞介素和抗病毒药物等都所费不菲，而效果差强人意，其引发个人与社会的经济损失数以百千亿计,因此，研发新的治疗肝炎和肝纤维化的药物具有重大的意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种2-氨基-7-取代苯并噻唑类化合物，并进一步公开了其制备方法及用于制备治疗肝炎和肝纤维化药物的用途。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明如式(Ⅰ)所示的2-氨基-7-取代苯并噻唑类化合物：
其中，R1选自甲基、乙基、OCH3、CF3、SCF3、OH、乙酰基。
优选地，本发明上述化合物，R1为CF3、SCF3、乙酰基。
本发明上述化合物的可药用盐、水合物、溶剂化物、无定型体、单晶及共晶体。
本发明上述化合物的制备方法，包括以下步骤：将0.01-0.05mmol3-取代苯胺溶于10-20mL醋酸中，加入30-50mmol硫氰酸钾搅拌15分钟。5-15mmol溴溶于0.3-1.0mL乙酸，缓缓加入前述反应物中，水浴反应温度20-40℃，搅拌过夜，过滤，取沉淀物用10-30mL乙酸乙酯洗涤2-5次。合并滤液和洗涤液，用氨水溶液碱化后，再用50-150mL浓盐水冲洗1-4次，浓缩至20-40mL，上快速色谱，用正己烷：丙酮6:1-3:1(v/v)洗脱，收集洗脱液，挥干溶剂，得2-氨基-7-取代苯并噻唑类化合物。
优选地，本发明上述制备方法，所述3-取代苯胺与所述硫氰酸钾、所述液溴的摩尔比为3:45:10。
优选地，本发明上述制备方法，所述溶于醋酸的3-取代苯胺的浓度为0.6-3.0mol/L。
本发明上述化合物在制备治疗肝炎或肝纤维化药物中的用途。
本发明一种治疗肝炎或肝纤维化的药物，以上述化合物为有效成分。
以本发明上述化合物为有效成分，按照常规工艺，选择性加入常规辅料制成的临床可接受的制剂。
本发明式(Ⅰ)所示的2-氨基-7-取代苯并噻唑类化合物能够显著抑制活化了的大鼠肝星状细胞胶原蛋白I型和胞外基质的合成，并调控相关合成基因和酶类的表达，对小鼠肝纤维化模型细胞外周质生成具有明显的抑制作用，可以作为抗肝炎和/或抗肝纤维化的药物；另外，本发明式(Ⅰ)所示的2-氨基-7-取代苯并噻唑类化合物的制备方法，其制备原料来源广泛、反应步骤较短、后处理简便，并且产率较高。
实验例
实验例12-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑治疗肝炎和肝纤维化的研究
1、实验方法
1.1细胞培养-大鼠肝细胞的分离和培养
含有10-15％FBS、100U/mLpenicillin和100ug/mLstreptomycin的DMEM或RPMI-1640培养液，37℃、5％CO2培养细胞，培养液每4天更换一次。
分别利用MTT法和原位细胞凋亡(TUNEL)试剂盒检测细胞的增殖和生存/死亡率。
大鼠肝细胞的分离和培养将按照Riccalton-Banks在2003年，Yata等1999年描述的方法，收获新鲜大鼠的肝脏分离和纯化大鼠肝细胞(HSC)，建立完整的肝细胞系。即用链霉蛋白酶和胶原酶通过原位灌流技术分离成年雄性大鼠(500-600g)的肝脏。原始细胞悬液通过非连续性的逐级离心获得，其纯化程度达到95％以上的同质性。细胞用未密封的塑料组织容器悬浮培养于含10％FCS的DMEM培养液，细胞密度为1.5×105cells/cm2。两天后，洗掉细胞碎片和未粘附的细胞，每2-3天更换一次培养液。评价培养细胞的纯度可以用显微镜检测维生素A的自发荧光性，还可以用免疫细胞化学的方法检测，如单克隆抗体α-SMA和desmin.细胞活性用台盼兰方法来检测。
HSC通常呈圆形，当培养于培养皿时呈静止状态。然而，经过大约10天的培养后，它们变的活跃并且很平，呈星形。它们表达α-SMA和desmin生物标记物，过度增殖，反分化成为高度浓缩的细胞肌成纤维细胞。
实验中，最初的24小时在活跃的HSC中加5-10μM的实施例1制备的2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑，之后换成DMEM+10％FCS。在初步研究中，已经知道暴露于2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑24小时足够影响活跃的HSC。用微阵列收获细胞，处理后24-48小时内用免疫荧光和RT-PCR的方法进行分析。
1.2小鼠肝纤维化模型的产生及给药处理
实验采用6-8周龄的雄性Balb/c小鼠，采用12小时光照、12小时黑暗的条件，给予充足的标准实验用动物饲料和水。
动物肝纤维化模型组，采用每周2次腹腔注射CCl4(0.56mL/kg动物体重，溶解于0.1mL橄榄油)，连续注射4周。CCl4对照组，采用CCl4连续注射4周，然后给予口服相应的水或含Triton-X100的水。口服采用22号带球规头的动物饲养针进行灌胃，并在CCl4处理后两周内每天给予灌胃。阴性对照组，小鼠采用口服灌胃水或者含2％Triton-X100的水，但未给予CCl4处理。在实验组中，动物在连续注射4周CCl4后继续口服5mg/kg，5mg/kg以及50mg/kg的实施例1制备的2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑两周(1天1次)。2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑母液(10mg/mL)为将实施例1制备的2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑溶解于2％TritonX-100的去离子水中、每次配制的新鲜溶液。
实验结束后，将小鼠用过量的麻醉剂处理后处死，然后解剖获得肝脏、肾脏及胃等组织，切成小块后固定于10％的***缓冲液中，并做好实验记录。肝脏组织样品先用石蜡包埋，然后在切片机上切成4um的薄片，经过去蜡处理后，总胶原蛋白用苏木素-伊红染色。染色的定量采用20X的放大倍数，每个切片的样品中随机选取5个位点，然后通过MetaMorph图像分析软件来定量阳性染色的区域。
1.3免疫组化和免疫荧光法
抗体TIMP购于SantaCruzBiotechnology，包括抗体胶原蛋白-I、胶原蛋白-II和胶原蛋白-III，1:100稀释等购于Pharmingen、BDLab以及SantaCruzLab。抗体和检测试剂来自SantaCruzLab、SigmaLab、InvitrogenLab、PharmingenLab、BDLab和ZymedLab等。
切割的组织样品立即用4％的多聚甲醛固定24小时，之后用石蜡浸泡；将组织切成5um厚度的切片；二甲苯脱蜡，梯度酒精复水之后，切片在置于微波炉内10mM、pH6.8的柠檬酸钠缓冲液中煮10min；切片用3％的过氧化氢甲醇溶液处理，封闭内源性过氧化物酶的活性，然后用封闭液(5％干牛奶用PBS稀释)封闭10min，在室温下用一抗孵育1到2个小时。
用PBS清洗三次，每次5min；之后，二抗和抗生物素蛋白连接的辣根过氧化物酶孵育10min；切片用过氧化物酶或者碱性磷酸酶显示底物，然后用苏木素复染并用PBS清洗；免疫荧光如前所述操作，细胞种于用多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，用4％的多聚甲醛固定细胞。除了二抗是荧光染料之外，其它都与免疫组化的过程相似，染色强度和定位将由OlympusFV-1000共聚焦显微镜记录和分析。
1.4SDS-PAGE凝胶电泳法和Westernblot蛋白分析
SDS-PAGE在10％的凝胶上完成，将蛋白质转移到0.2μm的硝酸纤维素膜或Hybond硝酸纤维素膜上，以120Vh通宵转移。
免疫印迹实验，用200ul的细胞裂解物(50mMNaCl，20mMTris，pH7.6，1％诺乃洗涤剂NonidetP-40，1xproteaseinhibitormixture)裂解细胞1小时。之后4℃，16，000xg，离心10min去除细胞裂解产物。用蛋白质检测试剂盒测量天然蛋白质的浓度。取总蛋白量25μg的蛋白裂解液以及彩色分子量marker作为标记物，用胶原蛋白-I、胶原蛋白-II和胶原蛋白-III和TIMP的单克隆抗体(SantaCruzLab)来检测，也用兔b-actin单克隆抗体(1:1000稀释)或者β-tubulin(1:1000稀释)孵育印迹。然后，用抗小鼠或抗兔的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗进行检测，通过增强的化学发光(ECL)的方法和ECL膜观察检测结果。
1.5半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR检测
用TRIzol试剂或者Qiagen试剂盒提取总RNA。按SuperscriptFirstStrandSynthesisSystem合成cDNA第一链，实时定量RT-PCR的操作根据制造商提示(SuperScriptIIIPlatinumTwo-StepqRT-PCRKitwithSYBRGreen，Invitrogen)。用1μL的cDNA样品，1xPCR缓冲液，1.5mMMgCl2，0.2mMdNTP，1μM的引物混合进行PCR反应。
2、实验结果
2.12-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑抑制活化肝星状细胞胶原的合成
实验结果如图1所示，实施例1制备的2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑能高效抑制活化了的大鼠星状细胞的I型胶原蛋白的合成。
2.22-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑抑制胞外基质合成并调控相关合成基因和酶类的表达
采用半定量实时PCR检测Ⅰ型、III型、IV型胶原蛋白，MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9和TIMP-1的表达水平。
实验结果如图2所示，实施例1制备的2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑对Ⅰ型、III型胶原蛋白的表达量有显著抑制作用，而对IV型胶原蛋白则较弱。半定量实时PCR结果还显示，随着2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑浓度的增加，2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑的药物剂量与MMP-1、MMP-3的活力成正相关。
正是因为MMP-3是一个促进MMP-1降解Ⅰ型胶原蛋白的催化剂，2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑以剂量依赖方式抑制Ⅰ型胶原蛋白的基因表达，同时增加MMP-1和MMP-3的表达量。另一方面，Reversine浓度与MMP-2和MMP-2呈负相关。MMP-2和MMP-9被认为是参与变性的胶原蛋白3和胶原蛋白4的降解，因此，Ⅰ、III型胶原蛋白没有直接的关系。此外，研究了基质金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)的表达。研究结果显示，MMP2/9和TIMP-1之间成负相关。
可见，2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑作为与TIMP-1类似的抑制剂抑制MMP2/9，进而与TIMP-1共同起到累积效应。新MMP抑制剂的发现依赖于进一步的研究。实时PCR的数据，不仅证实了先前的研究结果，并且表明2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑比Reversine在抑制人肝星状细胞Ⅰ型胶原的表达方面更有效。
2.32-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑对小鼠肝纤维化模型细胞外周质生成的抑制作用
建立小鼠肝纤维化模型组，采用每周2次腹腔注射CCl4(剂量：0.56mL/kg动物体重，溶解于0.1mL橄榄油)，连续注射4周。动物在连续注射4周CCl4后继续口服5mg/kg，5mg/kg以及50mg/kg的实施例1制备的2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑两周(1天1次)。由于2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑疏水，并且生物利用度较差、口服后较快被机体清除，采用2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑和TritonX-100复合物来最大化其水相溶解度(10mg/mL)。TritonX-100是一种常见的表面活性剂，用于亲脂药物的复合以及药物总体治疗效应的增强，和无处理对照组做对比。
如图3所示，和CCl4单独注射组相比，只出现了轻微的胶原蛋白沉积颗粒增加和偶尔的脂肪肝炎。半定量PCR实验进一步验证了这个结果。低剂量组(5mg/kg)2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑能够减少CCl4处理后肝脏的细胞外基质沉积；与注射TritonX-100的对照组相比更明显地减少了CCl4处理后肝脏的细胞外基质沉积。结果显示，和对照组相比，5mg/kg，25mg/kg，和50mg/kg2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑能够显著的降低细胞外基质的累积。50mg/kg2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑处理后，肝小叶显示和无CCl4处理组相似的结果，只出现了极少量的胶原蛋白沉积物。尽管，可能需要更长的药物作用时间才能使2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑处理后的总体胶原蛋白水平恢复到与未处理组水平，但是上述结果已表明，2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑可作为治疗肝纤维化的药物。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细地说明，其中：
图1是实验例1中2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑抑制活化肝星状细胞胶原蛋白I型的合成的实验结果，其中，图A为对照组的实验结果，图B为31.3μM2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑处理后的实验结果，C表示的为Ⅰ型胶原蛋白，N表示的为细胞核；
图2是实验例1中定量实时PCR方法研究2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑对肝纤维化相关基因的作用的实验结果；
图3是实验例1中2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑处理后总胶原蛋白苏木素-伊红染色的实验结果，其中，NT_C为无CCl4处理组，NT_MC为无CCl4处理组+溶剂组，CC_C为CCl4处理组，CC_MC为CCl4处理+溶剂组，CC_A1(CCl4处理组+5mg/kg实施例1化合物)，CC_A5(CCl4处理组+25mg/kg实施例1化合物)，CC_A10(CCl4处理组+50mg/kg实施例1化合物)。
具体实施方式
实施例12-氨基-7三氟甲基巯基苯并噻唑的合成
将0.01mmol3-三氟甲基巯基苯胺溶于10mL醋酸中，加入30mmol硫氰酸钾搅拌25分钟。13mmol溴溶于0.7mL乙酸，缓缓加入前述反应物中，水浴反应温度20℃，搅拌过夜，过滤，取沉淀物用25mL乙酸乙酯洗涤3次。合并滤液和洗涤液，用氨水溶液碱化后，再用120mL浓盐水冲洗2次，浓缩至20mL，上快速色谱，用正己烷：丙酮5:1-4:1(v/v)洗脱，收集洗脱液，挥干溶剂，得2-氨基-7-三氟甲基巯基苯并噻唑1.38g，产率为55％。1H-NMR(CDCl3，500MHz)，4.14(brs，2H)，6.79(dd，J＝8.5Hz，J＝2.5Hz，1H)，7.06(d，J＝2.5Hz，1H)，7.54(d，J＝8.0Hz，1H)；ESI-MS(m/z，％)：249.26(M-H)-。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (8)
1.如式(Ⅰ)所示的2-氨基-7-取代苯并噻唑类化合物：
其中，R1为SCF3。
2.一种权利要求1所述化合物的制备方法，包括以下步骤：将3-三氟甲基巯基苯胺溶于醋酸中，加入硫氰酸钾混匀，然后缓慢加入液溴乙酸溶液，于25℃下反应；将反应物过滤，取沉淀物用乙酸乙酯冲洗，合并滤液和洗涤液，用常规方法进行纯化，即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述3-三氟甲基巯基苯胺与所述硫氰酸钾、所述液溴的摩尔比为1-5:30-50:5-15。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述3-三氟甲基巯基苯胺与所述硫氰酸钾、所述液溴的摩尔比为3:45:10。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述溶于醋酸的3-三氟甲基巯基苯胺的浓度为0.6-3.0mol/L。
6.权利要求1所述化合物在制备治疗肝炎或肝纤维化药物中的用途。
7.一种治疗肝炎或肝纤维化的药物，以权利要求1所述化合物为有效成分。
8.一种临床可接受的制剂，以权利要求1所述化合物为有效成分，按照常规工艺，选择性加入常规辅料制成。
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