CN104470505A - 微球组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种携带细胞的微球组合物,其中所述微球组合物包含具有三嵌段共聚物基质A-B-A的微球核心,其中A选自聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)或聚丙交酯(PLA),以及B是泊洛沙姆或泊洛沙胺,其中所述微球核心涂覆有细胞粘附涂层并进一步包含与细胞粘附涂层结合的全细胞或细胞碎片,制备所述携带细胞的微球组合物的方法以及其应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种携带细胞的微球组合物,其制备方法及应用。
背景技术
WO03092657涉及基于生物相容的以及可生物降解材料的微粒。其表面包含目标细胞或其片段,并进一步包含上述细胞或其环境上的至少一种活性物质的分子,在微粒植入期间,所述分子以延迟和受控的方式被微粒所释放。
通过移植自体或非自体前体或成熟细胞的细胞疗法是一种修复病变器官的有前途的策略。此外,最近发展起来的干细胞生物学也为细胞为基础的疗法提供了进一步的刺激。一些团队已经使用胚胎干细胞,成人干细胞,组织来源的干细胞或最近诱导的多能干细胞来修复损伤的组织。在本文中,成人干细胞,尤其是骨髓间充质干细胞(MSCs),也叫多能间质基质干细胞,因为其安全性,从不同组织的相对可达性以及进行自体移植的可能性,他们呈现为对组织工程有吸引力的一种细胞来源。的确,这些干细胞因其分化的固有属性,已被成功地用于肌骨骼组织工程以及再生应用。在特定条件下,他们也能够分化为其他细胞系,如神经元样细胞或内皮样细胞。此外,已知间质干细胞能够迁移到损伤组织内,并且其一部分修复性质是由旁分泌机制(包括他们的免疫调节作用)介导。然而,在移植后大部分的细胞死亡,或者如果之前诱导的接近分化的表型不保持这种诱导的表型。因此,由于少的细胞数量以及对其行为非期望的修改,组织修复过程没有效并且细胞不能正确地结合宿主环境。为了治疗中的有效利用,细胞植入需要改进,尤其是短的但也长期存活的和移植后细胞的功能状态。
生长和分化因子可以改进细胞的存活和分化,也可能影响即时环境,从而使移植物更好的整合。各种生长因子,细胞因子或形态发生素已被广泛用于引导MSCs的分化。然而,由于其半衰期短,多向性酌以及有限的通过生物屏障的通道,这些因素的管理仍然是一个技术挑战。因此,这些因素的递送载体的使用,比如纳米或微装置,目前是一个既保护,又允许比如蛋白质的控制并持续释放的关键的选择。
除了细胞因子,几个参数包括细胞外基质(ECM)成分和三维的微环境已经显示出对人间质干细胞的存活和分化的强烈影响。在这方面,提供ECM表面的支架已被开发用于如脑神经元修复(Delcroix etal Biomaterials 2011)。
在这种情况下,一个有吸引力的策略是在一个输送干细胞的可植入小型药理活性支架内提供这些有关的参数,从而通过向体内的细胞提供适宜的微环境来刺激移植干细胞的植入。
本发明涉及其调查的药理活性微载体(包衣的微球),它是生物相容的和可生物降解的微球(优选设计为连续释放活性分子)和具有胞外基质分子或向输送的分子提供三维结构的细胞粘附分子的细胞粘附表面。结合在一个小型的微载体内的这些参数作用于运输的细胞和周围组织。这一种独特并简单的递送细胞和蛋白质的装置的概念已经首先被证明对于利用结合了具有不同的细胞结合表面的包衣微球表面神经细胞、神经前体细胞和成体干细胞(层粘连蛋白,纤维粘连蛋白,聚-D-赖氨酸)和/或生长因子(NGF,GDNF,NT-3)用于神经***疾病治疗的神经保护和组织修复是有效的(Tatard等人2004,Tatard et al 2007,Delcroix等人,2011,Garbayo等人2011)。此外,为了提供用于软骨修复的一种有效的支持,释放与人间质干细胞相关的转化生长因子3(TGF-β3)的药理活性微载体显示在体外和体内诱导其软骨细胞分化[Bouffi C等人,The role of pharmacologicallyactive microcarriers releasing TGF-β3 in cartilage formation in vivo bymesenchymal stem cells.Biomaterials.2010;31:6485-931]。然而,由于蛋白质-聚合物在释放期间的相互作用这些聚(D,L丙交酯-乙交酯)(PLGA)的药理活性载体在低和不完全的方式下(30天内25%生物活性蛋白)释放TGF-β3,导致蛋白质的不稳定性。为了在生理水平上准确递送这些高活性的治疗性蛋白质,通过以低封装荷载工作的必要性增强相互作用。为了解决这个问题,亲水性链段的聚乙二醇(PEG)被引入疏水性聚酯,如PLGA,形成三嵌段共聚物微球。PEG链段的存在增加水分的吸收,因此有较高的蛋白释放(TRAN等人,European Journal of Pharmaceutical Sciences 45(2012)128-137)。
本发明的目的是消除或至少大幅度减少上述现有产品和方法的弊端。
发明概述
目前,本申请人发现基于特定的三嵌段共聚物的包衣微球组合物所携带的全细胞或细胞碎片的数目大大增加了。此外,特定的三嵌段共聚物的使用增加了全细胞的数量。并且,包衣的性质可能会增加由包衣微球组合物携带的全细胞或细胞碎片的数量,并影响细胞分化。此外,特定的三嵌段共聚物能够包埋活性成分,优选一种蛋白,并提供持续释放的基质组合物高活性成分释放的显著性能。因此,与所述基质组合物连接的目标全细胞或其碎片可与活性成分相互作用,因此获得目标全细胞或其片段的更好功效。
优选实例的描述
因此,本申请的主题,是携带细胞的微球组合物,其中所述微球组合物包含含有三嵌段共聚物基质A-B-A的微球核心,其中A选自聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)或聚丙交酯(PLA),以及B是泊洛沙姆或泊洛沙胺(poloxamine),其中所述微球核心涂有细胞粘附涂层,并进一步包含与细胞粘附涂层结合的全细胞或细胞碎片。
优选的三嵌段共聚物基质为
聚(D,L-丙交酯-乙交酯)-泊洛沙姆-聚(D,L-丙交酯-乙交酯),
聚(D,L-丙交酯-乙交酯)-泊洛沙胺-聚(D,L-丙交酯-乙交酯),
以及
聚丙交酯-泊洛沙姆-聚丙交酯。
特别是聚(D,L-丙交酯-乙交酯)-泊洛沙姆-聚(D,L-丙交酯-乙交酯)。
微球是小的,约球形微粒,其直径在微米范围,典型地在1μm与1000μm之间,优选5μm到500μm,特别是10μm到250μm,特别是25μm到150μm,更特别是50μm到80μm。
A-B-A共聚物,尤其是聚(D,L-丙交酯-乙交酯)-泊洛沙姆-聚(D,L-丙交酯-乙交酯),是一种三嵌段共聚物。
优选的第一嵌段为聚(D,L-丙交酯-乙交酯)。
优选第二嵌段为泊洛沙姆或泊洛沙胺,最好为泊洛沙姆。泊洛沙姆本身是非离子型三嵌段共聚物。优选带有聚氧丙烯质量在1000到3500g/mol之间,优选1000到2000g/mol,并且聚氧乙烯含量为40到90%之间,优选80到85%的泊洛沙姆,更特别是泊洛沙姆188。泊洛沙姆188的平均分子量为8400,并且氧乙烯重量为80%。
可以使用三嵌段共聚物的混合物。
PLGA-泊洛沙胺-PLGA的三嵌段可具有4个PLGA分子结合一个泊洛沙胺分子的嵌段聚合物的结构。
在三嵌段共聚物中泊洛沙姆或泊洛沙胺的比例在0.4和40%(w/w)之间,优选在8和20%(w/w)之间。
特别优选聚(D,L-丙交酯-乙交酯)-泊洛沙姆-聚(D,L-丙交酯-乙交酯)三嵌段聚合物,其中泊洛沙姆的分子质量在2,000到20,000g/mol之间,优选2000到15,000g/mol,更优选7,000到10,000g/mol,并且泊洛沙姆含量为0.4到50%,优选8到20%,更优选9到12%。
本发明的携带细胞的微球组合物可用于载带目标细胞。细胞,即细胞碎片或优选全细胞,更优选功能性全细胞,通过细胞粘附表面涂层与微球相互作用。
根据本发明,全细胞或细胞碎片间接与所述微球组合物结合。本申请中“细胞粘附表面涂层”意味着包含或由细胞外基质分子或细胞粘附分子、或上述分子的碎片或分子的碎片构成,从而提高细胞粘附的表面。这种细胞粘附表面涂层也可以修改细胞功能,特别是细胞增殖或存活或更具体是分化。为此目的微球组合物被完全包衣或部分包衣或具有用提高细胞粘附或功能的化合物(例如存活或生化)通过另一种方式获得的细胞粘附表面,化合物包括选自聚D-赖氨酸(PDL)、聚L-赖氨酸、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽(RGD)、聚鸟氨酸、多乙烯多胺、其他合成分子,如纤连蛋白类化合物、或细胞外基质分子(纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白、胶原蛋白)或细胞粘附分子(N-CAM,selectines)或细胞外基质分子或细胞粘附分子的片段。可以使用单一化合物或这些化合物的混合物。纤连蛋白类化合物可商购,比如从SIGMA。
细胞通过涂层(优选包含纤连蛋白和聚D-赖氨酸,优选以60-40的比例)连接到携带细胞的微球表面。
全细胞或细胞碎片与微球结合的机制可能是不同性质的。细胞附着可以通过分子间力获得,例如通过离子力(例如阳离子聚D-赖氨酸)、范德瓦尔斯力或氢键。细胞附着尤其可以通过存在于细胞表面的受体获得,根据传统的配体-受体结合(在细胞表面上的整合素和例如存在于细胞粘附涂层上的细胞外基质分子如FN或层粘连蛋白,或在细胞表面上的细胞粘附分子(N-CAM)和存在于细胞粘附涂层上的N-CAM)。
细胞,优选人细胞,例如可以是成人自体细胞、胎儿细胞、转化的细胞系或不是、干细胞、多能或多能性细胞、重编程细胞。这些细胞可用于再生医学中的各种疾病。
例如这是用于治疗糖尿病的肝细胞和胰岛移植的情形。
在神经移植的情况下,细胞可以是一个在NGF作用下能够分泌多巴胺并分化为交感神经元样的PC12细胞系。细胞的其他例子包括用于肝脏、心肌、中枢神经***的修复的细胞移植,胰岛、骨髓细胞、成人细胞、胎儿细胞、重编程细胞、转化或未转化的细胞系、干细胞、基因修饰细胞、产生用于复制的重组病毒缺陷的细胞、肝细胞、胰岛细胞、神经细胞、肌肉细胞、造血细胞,骨细胞的移植的细胞。
其他合适的细胞是体内基因转移细胞,含有转基因细胞,会感染附近的宿主细胞的产生用于复制的重组病毒缺陷的细胞。
“细胞碎片”,指的是全细胞的药理学活性部分。药理活性细胞碎片可以从全细胞,例如通过破坏细胞膜并释放细胞内容物的超声处理或通过以酶为基础的破裂而得到。传统的测试允许评估是否保持了预期的药理作用。相同的微球可以包含全细胞和细胞碎片。
本领域技术人员可以容易地理解本说明书中“一”表示“至少一个”或“一个或几个”。例如,当文本指出微球核心涂有细胞粘附涂层,这意味着“至少一个细胞粘附涂层”,或当文本指出本发明的微球组合物包含微球内的一种活性成分,它指的是“至少一种活性成分”。
本发明中优选的携带细胞的微球组合物包含包埋在微球内的活性成分。活性成分是包埋在共聚物的基质中。因此,溶解的活性成分必须由扩散通过水填充的孔隙,通过共聚物或由封装共聚物的溶解找到自己的出路。核心提供了一种有高活性成分释放的显著特性的缓释基质。
活性成分也可存在于微球表面。
活性成分(特别是蛋白质)提供了控制细胞的体外或体内增殖和分化,或调节他们的组织环境(避免免疫排斥现象,促进血管生成)的可能性。活性成分也提供了控制细胞碎片的作用的可能性。
在缓释微球组合物携带目标细胞的情况下,活性成分优选为调节细胞或它们的作用的活性剂。如前所述,调节优选是增殖或分化,或对这些细胞的组织环境的修改。
因此,活性成分,优选一种蛋白,有利的是一种免疫调节剂,如细胞因子,最好是白细胞介素或对于所述细胞的存活以随着时间的推移扩展他们的功能有贡献的因子,如生长因子,优选神经营养因子,骨形态发生蛋白大家族包括转化生长因子,或诱导其分化的因子,如蛋白质性质或非蛋白质性质的形态发生素,比如视黄酸。
相反,活性成分可能是一种转运到细胞的毒性分子,编程和他的死亡和处理如Fas配体。
因此蛋白质活性成分有利的是酶、生长因子、细胞因子、激素、抗体、抗体片段、凝血因子或其它已知作用于细胞或改变他们的组织环境的蛋白质。
蛋白质活性成分包括,更特别地,生长因子、细胞因子、或影响细胞分化的免疫调节因子,其包括选自神经营养因子(如NGF、BDNF、NT-3等……)、TGFfis GDNF家族、FGF、EGF、PDGF、白细胞介素(如IL-1、IL-2、趋化因子、视黄酸、***等……)、或它们的混合物。
术语“蛋白质”活性成分包括多肽和寡肽活性成分。
优选的活性成分促进细胞的存活、功能、或引导干细胞分化为确定的表型。
他们还可以通过减少免疫反应和移植排斥反应,或通过增加血管生成促进一体化来改变组织环境。
用于本发明组合物的活性成分也可用于控制在转基因细胞中存在的基因的表达,这是一个响应这些成分的启动子(如生长因子)的控制下。
蛋白活性成分优选作为纳米粒子使用。他们特别通过纳米沉淀得到。
更传统的非蛋白质性质的活性成分,包括例如抗氧化分子(维生素、黄酮类化合物)、化疗药物(5-FU、BCNU、多西他赛、紫杉醇……)、放射增敏剂药物如(5-碘-2’-脱氧尿苷(Idurd…)。
本发明的主题也是制备上述定义的携带细胞的微球组合物的方法,其包括下列步骤:
-提供包括三嵌段共聚物基质A-B-A的微球核心,其中A选自聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)或聚丙交酯(PLA),并且B是泊洛沙姆或泊洛沙胺。
-用细胞粘附化合物完全或部分涂覆微球,并
-使全细胞或细胞碎片与具有细胞粘附表面的微球接触,
用于获得携带包括全细胞或细胞碎片的细胞的微球组合物。
实施本发明优选条件下,细胞粘附表面可以通过聚合物基质的化学表面改性,例如通过接枝合成粘附肽(如聚赖氨酸)或RGD样肽(比如RGD),或细胞外基质分子的肽(如IKVAV)或细胞粘附分子(如KHIFSDDSSE)到微球的表面而得到。
本发明的另一主题也是制备上述的携带细胞的进一步包含活性成分的微球组合物的方法,所述微球组合物进一步包含包埋在三嵌段共聚物中的活性成分(优选一种蛋白质),所述方法包括下列步骤:
-提供A-B-A(最好是聚(D,L-丙交酯-乙交酯)-泊洛沙姆-聚(D,L-丙交酯-乙交酯))三嵌段共聚物在聚合物的溶剂中的(优选有机溶剂)溶液,
-提供一种活性成分(最好是蛋白质),
-将活性成分添加到A-B-A三嵌段共聚物的溶液中,乳化或悬浮,在蛋白质的情况下优选悬浮活性成分,
-在含有表面活性剂的水相中乳化A-B-A三嵌段共聚物溶液,
-去除聚合物的溶剂,由此得到形成基质的微球,其中包埋有活性成分,
-分离微球,
-用细胞粘附化合物完全或部分包覆所得到的微球,和
-使全细胞或细胞碎片与具有细胞粘附表面的微球接触,来获得包含全细胞或细胞碎片的缓释微球组合物。
在实施本发明的上述方法的其他优选的条件下,涂层的步骤可以通过以适当的比例在悬浮液中混合涂层的粘附化合物和微球实施。优选地,涂层是通过将粘附化合物吸附到微球上而得到。
在实施本发明的上述方法的其他优选的条件下,附着步骤可以通过以适当的比例混合细胞悬浮液和涂层的微球悬浮液而进行。
从而得到缓释微球组合物,这种缓释微球组合物含有活性成分(优选蛋白)和进一步含有全细胞或细胞碎片,其中活性成分是包埋在涂层的A-B-A(优选聚(D,L-丙交酯-乙交酯)-泊洛沙姆-聚(D,L-丙交酯-乙交酯))基质中。
微球可被全部涂层或部分涂层,或具有用另外的方式用增强细胞粘附或细胞功能(例如存活)或两者的化合物得到的细胞粘附表面。
溶剂可以是三嵌段共聚物的任何合适的溶剂,优选有机溶剂,特别是二氯甲烷和丙酮或作为注射用溶剂的糖原质的混合物。
一种蛋白活性成分是最好通过纳米沉淀预先获得。因此,减少共聚物和蛋白质之间的相互作用。蛋白质不需要由添加剂(如白蛋白)来稳定化。
有机溶剂的去除是由例如加入萃取介质(优选水)来获得。
由此得到的微球优选通过由物理分离(如过滤)来分离。
此外,分离的微球优选冻干。
由于所使用的特定的三嵌段共聚物,根据本发明的包含携带细胞的包含至少一种活性成分的携带微球组合物具有有益的性能。
所使用的特定的三嵌段共聚物提供具有期望数量的结合的全细胞或细胞碎片的组合物。
特定的三嵌段共聚物的使用也增加了全细胞的数量。
此外,涂层的性质可增加由涂层的微球组合物携带的全细胞或细胞碎片的数量,并可影响细胞的分化。
此外,特定的三嵌段共聚物能够包埋活性成分,优选蛋白,并提供具有控制释放属性和另外的高活性成分释放的显著特性的缓释基质组合物。因此,与所述基质组合物结合的目标全细胞或其片段可与活性成分相互作用,从而得到全细胞或碎片的更好功效。
微球的三嵌段共聚物是生物相容性的,并能够被吸收到人体中。
上述携带细胞的微球组合物可用于组合物的制备,其中所述微球的表面上提供有目标全细胞或其片段以及还任选包含在所述细胞或其环境上的至少一种活性成分,和/或按缓释和控制释放由微粒释放的活性成分。
这就是为什么本发明的进一步的目的是如上所述的涂层的携带细胞的微球组合物用于对人体或动物的治疗性疗法,所述微球组合物提供有目标全细胞或其片段。
本发明的进一步目的是涂层的携带细胞的微球组合物用于人体或动物体的治疗性疗法,其中所述微球在其表面上提供有目标全细胞或其片段,以及进一步包含与如上所述的全细胞或其片段或他们的环境对应的活性成分。
更具体地说,本发明的进一步的目的是携带细胞的微球组合物用于变性疾病的治疗性疗法,其中所述微球在其表面上提供目标全细胞或其片段,以及还包括如上所述的对应于全细胞或其片段或它们的环境的活性成分,所述疾病优选是神经退行变性疾病(帕金森、亨廷顿病、阿尔茨海默……),脊髓损伤、骨关节疾病(骨关节炎、创伤后骨关节炎)、缺血性疾病(脑缺血、***功能障碍、尿失禁、外周肢体缺血)、肾功能障碍。
基于它们的治疗用途,上述组合物优选配制成药物组合物。
因此本发明包括含有本发明的携带细胞的微球组合物的药物组合物,以及药学上可接受的载体,和可选的其他治疗和/或预防性成分。
在一般情况下,由任何用于类似用途的药剂的接受的给药模式给予有效治疗量的本发明的携带细胞的微球组合物。适宜的剂量范围取决于几个因素,如待治疗疾病的严重程度,个体的年龄和相对健康状况,所用活性成分或细胞或碎片的效能,给药途径和给药形式,以及引导给药的指示。治疗这种疾病的领域普通技术人员,不需过度实验和依赖个人的知识和本申请的公开内容,能够确定对于一种给定的疾病的治疗有效量的本发明化合物。
本发明的携带细胞的微球组合物通常作为药物制剂给药,包括适合肠胃外给药的那些药物制剂。
本发明的携带细胞的微球组合物,可连同一种或多种常规佐剂、载体或稀释剂,放入药物组合物和单位剂量形式中。该药物组合物和单位剂量形式可以包括常规比例的常规成分,有或没有额外的活性化合物或成分,以及单位剂型可包含与待用的预期日剂量范围相适应的任何合适的有效量活性成分。
携带细胞的微球组合物尤其可采用胃肠外使用的无菌可注射制剂形式。
胃肠外或局部给药(例如,通过注射,优选大剂量注射或立体定向注射),本发明的携带细胞的微球组合物可以配制并可呈现为在安瓿、瓶、预填充注射器、小体积输注或多剂量容中的单位计量形式,有或没有配制剂或添加剂。
该组合物可以采取诸如油状或水性媒介中的悬浮液形式。非水或油状稀释剂溶剂或媒介的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如,橄榄油)和可注射有机酯(例如,油酸乙酯),并且可以包含配制剂如保存、润湿、乳化或悬浮、稳定和/或分散剂。另外,携带细胞的微球组合物可以是粉末的形式,由溶液通过灭菌固体的无菌分离或通过冻干得到,所述溶液是在使用前与合适的媒介,例如,无菌、无热原水构成。
实施上述的携带细胞的微球组合物的优选条件也适用于上述设想的本发明的其他主题,特别是提供有细胞的携带细胞的微球组合物,上述过程和药物制剂。例如,在所有的情况下,活性成分的使用是优选的蛋白质。
附图说明
图1显示了带有涂层的空载微球。
图2显示了使用光学显微镜(A)和扫描电子显微镜(B)评估的细胞粘附在空载的涂层的微球表面(制备10)。
图3显示了与PLGA相比的三嵌段共聚物(聚合物膜)上的纤连蛋白细胞粘合表面的半定量荧光强度。
图4是说明在孵育后4小时的hMSC粘附于PLGA-p188-PLGA微球、PLGA或PLGA-p188-PLGA涂层的微球(具有纤连蛋白/PDL细胞粘附表面的微球)的图。
图5显示了作为时间的函数的由PLGA或PLGA-p188-PLGA配制的涂层的微球上的hMSC的数量。
图6显示了在7天的移除时间间隔里微球(A)的体外溶菌酶释放和释放介质缓冲液(B),500μΙ的0.05M Tris-HCI,的pH值。
图7是说明PLGA+P1881:10、PLGA-P188-PLGA+P1881:10、PLGA-P188-PLGA+P1881:20微球的活性溶菌酶的累积释放对比时间的图表。
图8是说明分别由PLGA+P1881:1、PLGA-P188-PLGA+P1881:10和PLGA-P188-PLGA+P1881:20构成的微球的总累计释放和生物活性TGF-β3的累计释放的图表。
图9显示了PLGA涂层的微球或PLGA-P188-PLGA涂层的微球释放或不释放TGFβ3时体外培养的hMSCs的软骨分化。软骨细胞标志物(A)、成脂(adypogenic)标记物(B)和成骨细胞标记物(C)的表达。
图10是一个图片显示当hMSC在微球中培养28天时,对于无载涂层的微球(A、D)TGFβ3涂层的微球PLGA(B、E)和TGFβ3涂层的微球PLGA-P188-PLGA(C、F)的,Ⅱ型胶原蛋白(A、B、C)和聚集蛋白聚糖(D、E、F)的免疫染色,软骨细胞外基质的成分。
本发明的范围通过参照下面给出的实施例能够更好地理解,其旨在说明本发明的优点。
制备1:PLGA-P188-PLGA、PLA-P188-PLA和PLGA-泊洛沙胺-PLGA共聚物的制备
三嵌段共聚物PLGA-P188-PLGA(ABA共聚物)是使用泊洛沙姆188为引发剂以及辛酸亚锡[Sn(Oct)2]作为催化剂使DL丙交酯和乙交酯开环聚合而获得的。
根据表1,将各种精确量的泊洛沙姆188(1、2、3)或泊洛沙胺(4)和聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)(1、2、4)或PLA(3)进行混合并引入装有辛酸亚锡[Sn(Oct)2]的100mL圆底烧瓶中。
表1 用于共聚物合成的组分
表1的混合物被加热到140℃并通过15个真空氮气吹扫周期脱气以除去水分和氧气。烧瓶在0℃冷冻并在10-3mbar的动态减压下密封。在不断搅拌下允许在140℃继续聚合。5天之后,通过溶解于500毫升二氯甲烷并然后加入相同体积的乙醇沉淀来回收产品。
最后,三嵌段共聚物进行过滤,用冷乙醇洗涤并在减压下45℃干燥过夜,直到达到恒定的重量。
分析
PLGA-P188-PLGA和其他共聚物由1H NMR和尺寸排除色谱法(SEC)表征。PLGA嵌段的分子量通过在1H NMR谱中PEG单元在3.6ppm和PLGA嵌段在4.76ppm的共振的整合率确定。共聚物的分子量由SEC通过配备有PLgel 5μm混合的-C(60cm)柱作为固定相以及Waters 410refractometric detector的Waters公司设备,用DMF以1ml.min-1洗脱来确定。通常情况下,样品以10mg/ml溶解在DMF中,并且在20μΙ共聚物溶液注入之前,在来自Millipore公司的PTFE过滤器-FH(孔径0.45μm)上过滤。根据对聚(苯乙烯)标准的校准表示Mn和Mw。
结果
通过1H NMR计算
表2
通过尺寸排阻色谱法计算
表3
作为参考的聚合物是未封端的(自由羧基末端)的PLGA 37.5/25(Mn 14,000Da),由Phusis(Saint-lsmier,法国)提供和由Institut desbiomolecules Max Mousseron,CNRS UMR 5247,Montpellier,F-34093法国提供的PLGA-PEG-PLGA(Mn 45,300的PLGA段,Mn 4,000的PEG段)。
制备2:与泊洛沙姆188偶联的纳米沉淀的溶菌酶(1-10比例)的制备。
用于蛋白质纳米粒子制备的一般过程:
利用bouffi C等人
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961210013487-bib55:The role of pharmacologically activemicrocarriers releasing TGF-β3in cartilage formation in vivo bymesenchymal stem cells.Biomaterials.2010;31:6485-93和Giteau A等人Reversible protein precipitation to ensure stability duringencapsulation within PLGA microspheres.European Journal ofPharmaceutics and Biopharmaceutics.2008;70:127-36先前所描述的方法纳米沉淀蛋白质。
在室温下将45μl在0.3M氯化钠中含有900μg溶菌酶和9mg泊洛沙姆188的溶液加入糖原质(1.04g)中形成1ml的悬浮液。通过离心分离(10,000g,30min,4℃)收集复合微粒,并消除上清液。
为了制备100毫克微球批次,使用600μg溶菌酶和6mg泊洛沙姆188。
制备3:与泊洛沙姆188偶联的纳米沉淀的溶菌酶(3A 1-10比例;3B 1-20比例)的制备。
将10μl在NaCl 0.3M中含有150μg溶菌酶和不同量的泊洛沙姆188的溶液根据溶菌酶的添加比率(1.5mg或3mg P188分别为1-10或1-20比例)添加到1.1g糖原质中。通过离心分离(10,000g,30min,4℃)回收复合微粒,并消除上清液。
制备4:与泊洛沙姆188偶联的纳米沉淀的TGF-β3(4A:1-10比例;4B:1-20比例)的制备。
采用一般的过程冻干TGF-β3。
将10μl在TRIS-HCL 0.75M,NaCl 2M(pH=7.4)中包含50μgTGF-β3和不同量的泊洛沙姆188(P188,F68,BASF,Levallois-Perret,法国)的溶液,根据TGF-β3-泊洛沙姆188比例(0.5或1mg P188分别为1-10和1-20的比例)添加到1.077g冷的糖原质(4℃)(Sigma-Aldrich,St Quentin Fallavier,法国)中。通过离心分离(10,000g,30min,4℃)回收复合微粒,并消除上清液。
制备5:与泊洛沙姆188偶联的纳米沉淀的人血清白蛋白(HSA)(5a:1-10比例;5B:1-20比例)的制备。
与制备4类似的方式和如前所述(Delcroix等人Biomaterials 2011)制备比例分别为1-10或1-20蛋白-泊洛沙姆188的纳米沉淀的HSA。将10μl在0.3 M氯化钠中含750μg的HSA和不同量的泊洛沙姆188的溶液根据HSA添加剂比例(7.5mg或15mg P188,比例分别为1-10或1-20)添加到1.1g糖原质中。通过离心分离(10,000g,30min,4℃)回收复合微粒,并消除上清液。
制备6:与泊洛沙姆188纳米微粒偶联的人血清白蛋白(HSA)(6A:1-10比例;6B:1-20比例)的制备。
以与制备5类似的方法和如前所述的(Delcroix等人Biomaterials2011)制备蛋白泊洛沙姆188比例为1–10或1–20的纳米沉淀的HSA。将10μl含有250μg的HSA和不同量的泊洛沙姆188的0.3 M氯化钠溶液,根据HSA添加剂配比(2.5mg或5mg P188,比例分别为1-10或1-20)添加到1.1克糖原质中。通过离心分离(10,000g,30min,4℃)回收复合微粒,并消除上清液。
制备7:人间质干细胞(MSC)的制备。
如前所述[Bouffi等人Biomaterials 2010],在知情同意后,由来自接受髋关节置换手术患者的骨髓抽吸物确立人MSC培养物。简要来说,细胞悬浮液接种在一个完整的一个最小基本培养基(aMEM)(Lonza,Levallois-Perret,法国),补充有10%的胎牛血清(FBS)(Hyclone,ThermoFisherScientific),2mM谷氨酰胺,100U/ml青霉素,100mg/ml链霉素(Lonza)和1ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(R&DSystems,Lille,法国)。MSCs显示对于CD44、CD73、CD90和CD105呈阳性,对于CD14、CD34和CD45呈阴性,并在通道3和通道4之间应用。
制备8:聚合物薄膜
通过溶剂浇铸制备了共聚物1和PLGA的聚合物薄膜;10mg共聚物(共聚物1或PLGA)溶解在二甲基亚砜(DMSO)中,倒入玻璃盘中,随后空气干燥。得到共聚物1的薄膜和PLGA的薄膜。
制备9:参考微球
无溶菌酶参考微球按照下面的制备12制备,并命名为空载-MS。在这种情况下,有机溶液中含有有机溶剂2ml(3:1二氯甲烷/丙酮)和150mg的共聚物。
制备10:涂层的微球的制备
为获得空载微球,聚合物微球(制备9或制备13)用纤连蛋白(FN)(Sigma-Aldrich,St Quentin Fallavier,法国)和聚D-赖氨酸(PDL)(Sigma-Aldrich,St Quentin Fallavier,法国)涂层。
涂层溶液在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水DPBS(LONZA,Levallois-Perret,法国)中制备。涂层分子(15μg/ml)的浓度为6μg/mlFN和9μg/ml PDL(对应于FN:PDL的60:40比例)。
将5毫克的微球再悬浮在DPBS中并且超声处理直到微球充分分散。将含有FN和PDL细胞粘附分子的溶液混合到微球悬浮液中(最终体积:10ml),在37℃下15rpm的旋转下放置1小时30分。涂层后,涂层的微球用蒸馏的无菌水进行3次洗涤,冻干并保持在-20℃下长期存储。每个管子用(Sigma-Aldrich,St QuentinFallavier,法国)覆盖以防止在管壁上的产品损失。
制备11:嵌入在共聚物1、共聚物3、和PLGA微球(微球批次150mg)、以及共聚物5、共聚物6、共聚物7、共聚物8、共聚物9(微球批次100mg)的溶菌酶/泊洛沙姆188颗粒的制备。
在微球中包埋蛋白质活性成分的一般过程:
蛋白质的活性成分的封装是入TRAN等人描述的(Protein-loadedPLGA-PEG-PLGA microspheres:A tool for cell therapy,EuropeanJournal of Pharmaceutical Sciences 45(2012)128-137)进行的。
将制备2中与泊洛沙姆188纳米粒子偶联的溶菌酶(1-10比)小心地分散在有机溶液(2ml;3:1的二氯甲烷:丙酮)中,所述溶液含有150mg的制备1中的共聚物1或3,或PLGA(参考聚合物)(批次100mg:1.34ml,3:1的二氯甲烷:丙酮,含有100mg制备1的共聚物5、6、7、8或9)。将这种有机悬浮液在聚乙烯醇水溶液(90ml,4%W/V)中乳化或(批量100mg:60ml,4%W/V)保持在室温并以550rpm机械搅拌1分钟(Heidolph RZR 2041,Merck Eurolab,Paris,法国)。在加入100ml的去离子水并搅拌10分钟之后,将500ml的去离子水(批次100mg:分别为66ml和334ml的去离子水)添加到所得到的o/w乳液中并以300rpm搅拌20分钟来提取有机溶剂。使悬浮液通过125μm的不锈钢网筛分,然后通过37μm聚丙烯过滤器筛分回收。用500ml去离子水冲洗微球,然后在-20℃储存之前冻干。
蛋白负荷为6μg溶菌酶(Sigma-Aldrich,St Quentin Fallavier,法国)/mg PLGA-P188-PLGA微球、PLA-P188-PLA微球、PLGA-T1107-PLGA微球或PLGA微球。
分析
-所得到的微球的平均体积直径和粒径分布是利用Multisizer–Coulter Counter(Beckman Coulter,Roissy,法国)评价的。
-差示扫描量热法(DSC)是用Mettler Toledo Star System(Mettler-Toledo,Viroflay,France)进行。将样品(10mg)放置在一个密封的铝坩埚中;首先将它们从25℃加热到80℃,然后以10℃min-1的加热速度记录从50℃到100℃范围的热分析。聚合物的Tg由DSC技术确定。
表4 溶菌酶/泊洛沙姆188(1:10)负载的微粒的表征
制备12:在PLGA-P188-PLGA微球(共聚物2)和PLGA(微球批次150mg)中包埋的溶菌酶/泊洛沙姆188颗粒的制备。
制备3和5中的纳米沉淀的蛋白通过离心收获,并分散在含有150毫克的共聚物的有机溶液(2ml;3:1的二氯甲烷/丙酮)中。有机溶液在保持在1℃和机械搅拌1分钟(550rpm)的聚(乙烯醇)的水溶液(90毫升,4%W/V)(Heidolph RZR 2041,Merck Eurolab,Paris,法国)中乳化。在加入100ml的去离子水并搅拌10分钟之后,将所得到的o/w乳液加到500ml的去离子水中并以550rpm搅拌另外20分钟来提取有机溶剂。最后,所形成的微粒在5μm过滤器(HVLP型,Millipore SA,Guyancourt,法国)中过滤,用500mL去离子水洗涤并在4℃保存之前冻干。
制备13:在PLGA-P188-PLGA(共聚物2和PLGA)(微球批次50mg)中TGF-β3/泊洛沙姆188和HSA/泊洛沙姆188颗粒的微胶囊
在PLGA-P188-PLGA和PLGA微球中包埋TGF-β3和泊洛沙姆188颗粒和HSA/泊洛沙姆188颗粒的过程与制备12的过程相同,在这种情况下,微球批次为50mg。
分别使用制备4和6中描述的过程分别进行纳米沉淀。
该纳米沉淀的TGF-β3和HSA通过离心收获,并分散在有机相(670μL的50mg PLGA-P188-PLGA(聚合物2)或PLGA溶解在二氯甲烷:丙酮为3:1的溶液),其在聚(乙烯醇)(4-88,Kuraray Specialities Europe,Frankfurt,德国)水溶液(30ml,4%w/v在1℃)中乳化并以550rpm机械搅拌1分钟(Heidolph,RZR 2041,Merck Eurolab,Paris,法国)。在加入33ml的去离子水并搅拌10分钟之后,将乳液添加到167ml去离子水中搅拌20分钟来提取有机溶剂。最后,所形成的微粒在0.45μm过滤器(HVLP型,Millipore SA,Guyancourt,法国)中过滤,洗涤并冻干。
蛋白质负荷对于TGF-β3是1μg(Peprotech,Paris,法国)并以及5μg的人血清白蛋白(Sigma-Aldrich,St Quentin Fallavier,法国)/mgPLGA-P188-PLGA和PLGA微球。
实施例1:具有结合的人间充质干细胞的FN和PPL涂层的空载PLGA-P188-PLGA微球的制备
步骤1:FN和PDL涂覆的微球的制备
PLGA-P188-PLGA(共聚物2)微球用纤连蛋白(FN)(Sigma-Aldrich,St Quentin Fallavier,法国)和聚D-赖氨酸(PDL)(Sigma-Aldrich,St Quentin Fallavier,法国)涂覆(制备10)。
涂层溶液在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水DPBS(LONZA,Levallois-Perret,法国)中制备。涂层分子的浓度(15μg/mL)为6μg/mLFN和9μg/ml PDL(对应于FN:PDL的比例60:40)。
将5mg的PLGA-P188-PLGA微球悬浮在DPBS中并且超声处理直到微球充分分散。将含有FN和PDL涂层分子的溶液混合到微球悬浮液(最终体积:10毫升)中,并在37℃以15rpm旋转下放置1小时30分钟。涂层后,微球用蒸馏的无菌水进行3次洗涤,冻干并最终保持在-20℃下长期存储。每个管子上用(Sigma-Aldrich,St Quentin Fallavier,法国)覆盖以防止管壁上的产品损失。
使用抗纤连蛋白抗体的免疫荧光染色显示微球的FN涂层。干涉的Nomarsky显微镜以及该实施例中的PLGA-P188-PLGA微球的Nomarsky图像与荧光图像叠加。这种涂层是令人满意的并且FN覆盖所有的如图1所示的涂层的微球表面。
步骤2:具有结合的人间充质干细胞的FN和PDL涂层的微球的制备。
制备7的人间充质干细胞用PBS洗涤,用0.16%胰蛋白酶(Sigma),0.02%EDTA(Lonza)的溶液分离,并且以1400rpm下制粒10分钟。
将细胞颗粒悬浮在添加有3%胎牛血清(PBS)的培养液中。将0.75mg制备10中冻干的FN和PDL涂层的微球组合物悬浮在涂覆的含有a-MEM培养基,3%胎牛血清的Eppendorf管(,Sigma)中15分钟。将步骤1中FN和PDL涂层的微球组合物的悬浮液进行超声处理和简单地涡旋,然后添加细胞悬浮液(0.25χ106细胞/0.5毫克微球组合物)。然后将混合物轻轻冲洗并覆盖在1.9cm2的Costar超低群集板中(#3473,Corning,Avon,法国)。使板在4小时内在37℃下孵育,以使细胞附着在FN和PDL涂层的微球表面。
将微球组合物/细胞聚集体或复合物的悬浮培养物回收,用α-MEM冲洗,并通过离心分离2分钟制粒200g。
制备用于扫描电子显微镜分析的样品,如前所述[Tatard等人2007 Biomaterials]。简单地说,空载涂层微球(制备10)用PBS洗涤后,用1%戊二醛和1%锇固定并用酒精脱水。
之后,将它们浸泡在hexamethyldisylasane中,以及用厚碳层覆盖并最后观察。空载涂层的微球(准备10)表面的细胞粘附性是利用光学显微镜(A)和扫描电子显微镜(B)进行评价的。所得到的图片示于图2中。
图2通过光显微镜显示hMSC/空载涂层的微球(PLGA-P188-PLGA)/细胞复合物。如通过扫描电子显微镜观察到的,这些细胞与涂层的微球形成三维复合物。
实施例2:包含包埋的TGF-β3/HAS和结合的人间充质干细胞的涂层的PLGA-P188-PLGA微球的制备
步骤1:FN和PDL涂层的微球的制备。如实施例1步骤1所述的相同方法进行制备13中微球的涂层。得到了相同的结果。
步骤2:具有人间充质干细胞的FN和PDL涂层的微球的制备。
与实施例1中描述的步骤2完全相同的方式将细胞结合到这些微球。得到了相同的结果。
使用三嵌段共聚物6-9制备了具有结合的人间充质干细胞的涂层的空载三嵌段共聚物微球的类似制剂,以及具有结合的人间充质干细胞的相应微球的类似制剂。
分析方法和结果
1.聚合物膜上的细胞粘附涂层
聚合物薄膜(制备8)在37℃下10μg/ml FN溶液中孵育1.5小时。涂层的聚合物薄膜用PBS洗涤三次。
由免疫荧光法确定FN涂层。简要地说,用含有4%BSA的PBS溶液在室温下进行60分钟的饱和步骤。聚合物薄膜用PBS洗三次,随后在4℃下过夜用单克隆小鼠、抗人、纤连蛋白抗体(1:100)孵育。然后这些部分用PBS清洗,并用有生物素标记的马、抗小鼠、IgG抗体(1:200)孵育60分钟,用PBS洗涤并用链霉亲和素-氟探针(fluoprobe)547(1:500)孵育40分钟。也进行同型对照。
图3显示了与PLGA相比的在三嵌段共聚物(聚合物薄膜)上的纤连蛋白细胞粘附表面的半定量荧光强度。
高荧光强度表明在所研究的聚合物薄膜上的高纤连蛋白吸附,因此显示良好的纤连蛋白涂层。与PLGA相比,PLGA-P188-PLGA共聚物上的荧光强度更高,这意味着用纤连蛋白涂层更好。
2.对空载微球的涂层的分析
利用Malvern(Nano Series DTS 1060,MalvernInstruments S.A.,Worcestershire,UK)测定微球的ζ(zeta)电位。鉴于用斯莫卢霍夫斯基方程(Smoluchowski's equation)将电泳迁移率的值转换为电位,ζ电位的测量由微球悬浮(氯化钠1mM中0.3mg/ml)得到。结果表示为平均±标准偏差。
PLGA与PLGA-泊洛沙姆-PLGA微球显示正的ζ电位值,其中FN细胞粘附的表面对于PLGA-P188-PLGA微球从-8.1±2.3mV提高到+7.9±0.8mV。这些结果表明,微球被良好地涂覆,该涂层对于细胞黏附是令人满意的,因为带正电荷的细胞粘附表面促进细胞的粘附。
3.细胞空载涂层的微球复合物(实施例1、聚合物2、聚合物参考)和细胞微球复合物(制备9+制备7、聚合物2)的形成
hMSCs用PBS洗涤,用0.16%胰蛋白酶0.02%的EDTA溶液分离(Lonza,Levallois-Perret,法国)并以1400rpm制粒10分钟。细胞颗粒再悬浮在添加有3%胎牛血清(FBS)的培养液中。0.75mg冻干的微球(制备9或10)再悬浮在包含α-MEM培养基和3%胎牛血清的涂层的Eppendorf管(Sigmacote,Sigma)中15分钟,涂层的微球悬浮进行超声处理和简单涡旋,然后添加细胞悬浮液(0.25×106细胞/0.5mg涂层的微球)。然后将混合物轻轻冲洗并覆盖在1.9cm2的Costar超低群集板中(#3473,Corning,Avon,法国)。
通过Cyquant法测出存活细胞的数量来估计在4小时的细胞粘附。
结果如图4所示:在4小时细胞粘附到PLGA-P188-PLGA微球(制备9,聚合物2)、空载涂层的PLGA微球(制备10,聚合物参考)和空载涂层的PLGA-P188-PLGA微球(制备10,聚合物2)。
涂层提高细胞粘附,与非涂层微球的86%相比,对于空载涂层的微球细胞粘附是细胞总数的118%。而且,对于涂层的PLGA-P188-PLGA微球细胞粘附比参考聚合物PLGA更好,分别是120%和97%。
4.空载涂层的微球上细胞增殖/存活(制备10)
hMSCs由PBS洗涤,用0.16%胰蛋白酶0.02%的EDTA溶液分离(Lonza,Levallois-Perret,法国)并以1400rpm制粒10分钟。细胞颗粒再悬浮在添加3%胎牛血清的培养液中。将0.75mg冻干的微球再悬浮在包含α-MEM培养基和3%胎牛血清的涂层的Eppendorf管(Sigmacote,Sigma)中15分钟,将涂层的微球悬浮液进行超声处理和简单涡旋震荡,然后添加细胞悬浮液(0.25×106细胞/0.5mg包层的微球)。然后将混合物轻轻冲洗并放置在1.9cm2的Costar超低群集板上(#3473,Corning,Avon,法国)。该悬浮培养液保持一段时间,并且在不同的时间间隔(24h、48h和7天)评估细胞存活率,而且用Cyquant细胞增殖试(Invitrogen,法国)按照制造商的指南量化粘附到涂层的微球上的活细胞。结果如图5所示。星**表示差异显著(P<0.01),n=3。
细胞附着后24h、48h、甚至7天之后,细胞/涂层的微球复合物保持,并在之后的整个时间没有观察到死亡的细胞。
细胞培养7天后,hMSCs单独并没有增殖,而那些形成带有两种涂层的微球的复合物增殖了,导致细胞的数量显著增加。此外,增殖试验表明,细胞数量尤其在hMSCs用空载PLGA-P188-PLGA微球培养时增加。
因此,涂层的PLGA-P188-PLGA微球上的细胞数量再第7天时明显增加,表明这些涂层的微球随着时间的推移刺激细胞增殖和/或存活。
5.包囊化活性溶菌酶的数量和活性溶菌酶释放的体外评价(制备11)
为了检测在封装过程中生物活性的任何损失,在将来自实施例1的微球在DMSO中溶解后,测定从微粒中提取的活性蛋白的数量。
载有溶菌酶的微球(10mg,3批次)溶解在5ml聚四氟乙烯管中的0.9ml DMSO中。1小时后,加入3ml的0.01M盐酸。溶液静置一小时。
通过测量之前提到的(A Aubert-Pouessel等人in vitro deliverysystem for assessing the biological integrity of protein upon release fromPLGA microspheres.Pharm Res.2002;19:1046-51)的溶壁微球菌(M.lysodeikticus)细菌细胞悬浮液中的浊度变化来确定活性溶菌酶的数量。百微升的溶菌酶溶液加到TRIS-HCL缓冲溶液(0.01M,pH 7.4)中的2.9ml的0.015%w/v溶壁微球菌悬浮液中。在孵育(37℃,4小时)后,测定450nm处的吸光度。借助标准曲线计算活性蛋白的数量。
包封率的结果列于表4。包封率根据聚合物介于60%和66%之间,这意味着蛋白质适当地包埋到了聚合物基质中。
蛋白质的体外释放
a)溶菌酶-制备11
从微球(制备11)体外释放溶菌酶的轮廓是通过在离心管中将500μΙ的0.05M TRIS-HCL缓冲液,pH值7.4,含0.1%w/v BSA和0.09%w/v氯化钠,添加到10mg的微球中。管被封闭,并且在摇动的水浴中(37℃,125rpm)孵育。在确定的时间间隔内,管以2800g离心5分钟,以收集上清液,分析pH值、溶菌酶和泊洛沙姆释放。然后用新鲜的缓冲液替换上清液。
图6显示的结果:(A)从微球的溶菌酶体外释放(B)释放介质缓冲液的pH值,在7天间隔中除去500μΙ的0.05M的Tris-HCl。
45%封装的溶菌酶从PLA-P188-PLA共聚物的微球中释放,与PLGA-PEG-PLGA共聚物(参考聚合物)的38%相对比。然而,多数溶菌酶在前15天从PLA-P188-PLA的微球(聚合物3)释放。对于PLGA-P188-PLGA,60%的溶解酶在前22天以连续释放的方式被释放。
释放介质的pH值的变化示于图6B。
不像在PLGA、PLGA-PEG-PLGA和PLGA-P188-PLGA微球的媒介释放中观察到的酸性pH值,由于PLA的缓慢降解,PLA-P188-PLA微球的释放媒介的pH值始终稳定。此外,PLGA-PEG-PLGA和PLGA-P188-PLGA微球的pH的曲线十分相似。微球的室内和室外之间的交换以及聚合物的降解率对于两种微球可以是接近的。
这些结果清楚表明PLGA-P188-PLGA和PLA-P188-PLA增加蛋白质释放百分率的益处。
6.包囊化活性溶菌酶的数量和活性溶菌酶释放的体外评价(制备12)
制备12:管在摇动的水浴中(37℃,125rpm)孵育。在确定的时间间隔,管以2800g离心5分钟以收集200μl上清液进行分析,并用新鲜的缓冲液(250μΙ)替换。
用在第5部分中描述的酶试验法测定生物活性释放溶菌酶的百分比。
结果示于图7中,其显示了微球中生物活性溶菌酶的累积释放。PLGA+P1881:10、PLGA-P188-PLGA+P1881:10、PLGA-P188-PLGA+P1881:20在37℃TRIS-HCL中孵育30天,并不同时间点用生物试验测定培养基中释放的溶菌酶。
每个误差线代表每个配方的n=3的平均累计值的±标准偏差。图7评价并报告了聚合物基质(PLGA或PLGA-P188-PLGA)和在沉淀步骤中与生物活性溶菌酶的释放曲线上的溶菌酶相关的P188添加剂的量的影响。
i)聚合物基质由固定比例1:10的蛋白质-P188修饰,用于纳米沉淀步骤。在这些条件下,当PLGA-P188-PLGA用作一个基质时,溶菌酶从MS的释放明显增加。在第30天,相比基于MS的PLGA为17%,包封的溶菌酶的51%得到释放。事实上,在第3天,12%的溶菌酶从PLGA MS中释放,然后观察到在初始爆发释放后(从12%到第30天的17%)低的后续释放。相反,当使用PLGA-P188-PLGA作为基质时,释放是不显著的,并且从第0天到第15天可以观察到更持续的释放,导致在第30天释放51%的蛋白。
因此,与PLGA组合物相比,PLGA-P188-PLGA三嵌段共聚物的使用显着地增加溶菌酶的释放。
ii)接下来,选择PLGA-泊洛沙姆-PLGA作为聚合物基质,测试不同比例的泊洛沙姆。
结果:当蛋白质/泊洛沙姆比例为1:20时,生物活性释放的蛋白质得到增强。如图7中观察到的,从蛋白/泊洛沙姆比例为1:10(前面提到的)时第20天的溶菌酶释放为51%增加到蛋白/泊洛沙姆比例为1:20时的71%。
因此,与高比例相比,使用越低比例的蛋白/泊洛沙姆越明显增加溶菌酶的释放。
此外,图7和图6的比较,显示对于加载蛋白质含量为0.6%或0.1%,并且蛋白/泊洛沙姆的比例都是1:10的聚合物1和2(PLGA-P188-PLAGA)制备的微球,其释放曲线非常相似。第一种情况下在第22天释放近55%的蛋白质,第二种情况是51%。因此可以通过共同封装单独纳米沉淀并在包封步骤中与治疗性蛋白共混的载体蛋白(如白蛋白)来显著减少治疗性蛋白的装载。该结果对昂贵的活性药物成分格外有益,特别是治疗性蛋白。
7.微球和涂层微球中总TGF-β3的评价。未涂层和涂层的微球中总的和生物活性TGF-β3的释放曲线。
为了检测封装过程中生物活性的任何损失,将实施例3的微球在DMSO(5mg/1mL DMSO)(Bouffi 2010,§212)中溶解一小时(3批次)后测定从中提取的活性蛋白质的量。在此段时间后,离心分离样品并蒸发残留的DMSO。用特定ELISA试剂盒(R&DSystems,Lille,法国)测定包封的蛋白质(如TGF-β3)。
在PLGA微球中TGF-β3的包封收率是116±22%,在PLGA-P188-PLGA微球中是89±12%。三嵌段共聚物更亲水性能,轻微降低了其包封收率。然而,该包封收率是令人满意的,载带TGF-β3的微球可用于生产涂层的微球。
TGF-β3从微球的体外释放
由PLGA+P1881:10、PLGA-P188-PLGA+P1881:10、PLGA-P188-PLGA+P1881:20(制备13)中的任一个构成的微球在PBS 1%BSA中孵育,并且由ELISA(Duoset ELISA human TGF-β3(R&D Systems,Lille,法国)或用之后提到的生物测定方法测定在不同时间点介质中释放的TGF-β3。
为了测定从微球释放的TGF-β3的生物活性,进行由Tesseur等人先前开发的生物测定(Highly sensitive and specific bioassay formeasuring bioactive TGF-beta.BMC Cell Biol.2006;7:15,)。
依赖于从耦合到分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告基因的TGF-β响应Smad-结合元素构成的报告质粒稳定转染的TGFβ1-/-小鼠(MFB-F11)中分离的小鼠成纤维细胞的使用。
MFB F11成纤维细胞以3×104细胞/孔在96孔平底培养板(Nunc,Dutscher,法国)上接种。孵育过夜后,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次,并在添加有100U/ml的青霉素和100mg/mL的链霉素的50μl无血清DMEM培养基中孵育(Lonza,Levallois-Perret,法国)。
2小时后,加入含有样品的50μl的TGF-β3,再孵育24小时。将一系列确定量的标准TGF-β3的稀释液添加到其他孔中以确定标准曲线。根据制造商的指南,使用SEAP报告基因检测,化学发光试剂盒(Roche,Meylan,法国)对50μl培养液上清液测定SEAP活性。
使用微板光度计(Ascent FL,Thermo Fisher Scientific,Cergy-Pontoise,法国)检测化学发光,并通过荧光扫描的Ascent软件(Ascent software for Fluoroscan(Thermo Fisher Scientific,Cergy-Pontoise,法国))分析结果。
图8显示来自微球的总的和生物活性TGF-β3的累积释放。
A.TGFβ3的释放曲线,来自PLGA+P1881:10、PLGA-P188-PLGA+P1881:10、PLGA-P188-PLGA+P1881:20(制备13),通过ELISA和生物测定评估。
B.来自PLGA-P188-PLGA(P1881:20)微球的释放与来自具有TGFβ3(制备13+制备10)的涂层的微球的释放进行比较。每个误差线代表每个配方n=3的平均累计值的±标准偏差。
对几种微球制剂进行了测试:
包封纳米沉淀的P188的PLGA微球,其中含有TGF-β3:P188比例为1:10(w/w)的TGF-β3;PLGA-P188-PLGA微球+P1881:10以及PLGA-P188-PLGA微球+P1881:20(图8A)。由ELISA阵列或通过生物测定检测时,检测到从微球释放相似量的TGF-β3,表明释放的TGF-β3是生物活性的。对于每个制剂生物活性TGF-β3的释放曲线都是类似的,都具有较高的初始释放(第0天到第7天),之后的阶段缓慢释放直到30天(图8A)。
这些结果表明,用ELISA检测的TGF-β3的释放曲线与生物测定的相匹配。因此,从所有不同的制备释放的TGF-β3都显示是生物活性的。
如对于溶菌酶所观察到的,从PLGA微球释放的TGF-β3是低的,在第30天,释放的TGF-β3为25%,提示在释放到基质的过程中蛋白质的降解。
含有比例为1:10的蛋白/P188的PLGA-P188-PLGA的使用允许TGF-β3更明显的释放。第0天到第3天约40%,之后,从第3天到第30天是弱的释放(10%)。
因此,与PLGA组合物比较,PLGA-P188-PLGA三嵌段共聚物的使用显著增加溶菌酶的释放。
对于相同的基质聚合物(PLGA-P188-PLGA),以及比例为1:20的蛋白/P188,释放74%的活性TGF-β3,在第6天释放60%,在第六天到第30天之间释放14%。
对于PLGA制剂,生物活性TGF-β3与总释放TGF-β3的平均值的比例大约是56±8.9%,而对于PLGA-P188-PLGA+P1881:20制剂是96±12.5%,提示后者更有效地保护蛋白质。
因此,相比较高的比例,较低的蛋白/P188比例的使用显著增加TGF-β3的释放。
进行来自无涂层的微球和FN微球的TGF-β3释放的比较,以评价涂层对蛋白释放的影响(图8B)。
来自TGFB3涂层的微球的释放(制备13+制备10)与无涂层的微球(制备13)(在本发明的微球在第三天释放32%对比非涂层的微球释放55%)比较,显示在30天内更持久,表明涂层步骤和细胞粘附表面(纤连蛋白+聚D-赖氨酸)对微球释放蛋白的影响(图8B)。
8.软骨细胞分化
对于空载涂层的微球(制备10)和具有PLGA或PLGA-P188-PLGA基质(聚合物2)释放TGFβ3的涂层的微球(制备13+制备10),通过在微丸的28天的培养诱导hMSC的软骨分化。
对于空载涂层的微球(制备10)和具有PLGA或PLGA-P188-PLGA基质(聚合物2)释放TGFB的涂层的微球(制备13+制备10),hMSC的培养在一个锥形管的微丸中进行。简单地说,MSCs(2.5×105细胞)和0.5mg涂层的微球在15毫升的锥形管中通过离心分离制粒,并在软骨细胞培养基中培养。该培养基是DMEM,添加有0.1mM的***、0.17mM的抗坏血酸和1%的胰岛素铁传递蛋白硒酸(ITS)补充剂(Lonza)。通过在补充有10ng/mL的TGF-B3的软骨细胞培养基中的颗粒中培养来诱导MCSs的标准软骨。这作为比较,因为在微丸中培养进行体外软骨细胞分化是黄金标准。
分析:定量qPCR
在微丸中培养21天后,对于空载涂层的微球和具有PLGA或PLGA-P188-PLGA基质(聚合物2)释放TGFβ3的涂层微球的hMSC在PBS中清洗,并在裂解缓冲液中机械解离。根据制造商的建议,从细胞制剂中提取全部RNA。将细胞溶解在含缓冲液的1%β-巯基乙醇中并用DNAse处理所提取的RNA以去除任何基因组DNA的痕迹(Total RNA isolationRNA II,Macherey Nagel,Hoerdt,France)。第一链cDNA的合成由SuperscriptTMII逆转录酶(Invitrogen)根据制造商的指示进行。第一链cDNA合成后,将cDNA纯化(QiaquickPCR purification kit,Qiagen,Courtaboeuf,France),在50μL无RNase水(Gibco)中洗脱。cDNA(3.125ng)与iQ SYBR Green Supermix(Biorad)和引物混合物(0.2mM)混合,最终体积为10μL。在Chromo4热循环仪(Biorad)上进行扩增,第一变性步骤在95℃进行3分钟,并且在95℃下10秒内进行40个周期,55℃下进行15秒以及72℃下进行15秒。扩增后,产品的熔化曲线确定靶基因的引物的特异性。平均循环阈值(Ct)由每个cDNA的2次测量得到。几个管家基因,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh,NM_002046),β2微球蛋白前体(B2M,NM_004048),β-肌动蛋白(ACTB,NM_001101),和热休克90kD蛋白1β(Hspcb,NM_007355)进行标准化测试。用自由软件(http://medgen.ugent.be/ejvdesomp/genorm/)确定Gapdh、Hprtl和Hspcb是最稳定的三个管家基因。相对转录量(Q)是由三角洲Ct方法[Q=E(在所有测试样品中的Ct分钟-样品的Ct)]其中E与引物的功效有关(如果引物功效=100%,E=2)。使用Vandesompele等人[29]所描述的多个归一化方法,对相对量(Q)进行标准化。
图9说明了对于释放或不释放TGFβ3的PLGA涂层的微球或PLGA-P188-PLGA涂层的微球,体外培养的hMSCs的软骨细胞分化。软骨细胞标记(A)、成脂标记(B)和成骨细胞的标记(C)的表达。
通过RT-qPCR分析体外观察到,与软骨细胞分化的黄金标准相比,由释放TGFβ3的涂层的微球培养的MSCs对所有测试的软骨细胞标记物(II型胶原蛋白B变种、链接蛋白、聚集蛋白聚糖、COMP)的表达均增加(图9)。此外,在两种涂层的微球制剂之间可观察到差异,当hMSC与由PLGA-P1288-PLGA基质(对于TGF-β3PLGA涂层的微球和TGF-β3PLGA-P188-PLGA涂层的微球,2型胶原蛋白的表达分别增加了35到59倍)组成的新制剂关联时2型胶原蛋白和COMP的表达显著上调。重要的是,当细胞由空载的PLGA-P188-PLGA涂层的微球培养时,没有软骨细胞标记物被检测到。这些结果表明一个由FN包层的微球连续释放TGF-β3诱导软骨细胞分化。值得注意的是,在我们的研究中,成骨细胞的标记、AP和骨钙素,无论什么条件与在D0未处理的细胞相比,都表达为低水平(图9)。有趣的是,相比于未处理细胞(D0),在所有其他条件下,除了空载FN PLGA-P188-PLGA涂层的微球,成骨细胞的标记都被下调(图9)。这有力地说明对于有效的和特异性的软骨细胞分化,释放的生长因子的重要性,以及基质性能的影响。
分析:组织学和免疫组织化学
在微丸中培养21天后,含有空载涂层微球和释放TGF-p3的涂层微球的hMSCs被固定在4%多聚甲醛中24小时,在PBS中清洗,并且进行常规组织学处理。石蜡包埋样本切片(5mm)通过梯度的乙醇和二甲苯进行复水,并用苏木精-伊红染色。
免疫组织化学根据制造商的说明使用Ultravision探测***抗多价HRP/DAB试剂盒(LabVision,Microm,Francheville,法国)在样品切片上进行。
对于II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的免疫染色,对于空载涂层的微球和释放TGF-β3的涂层的微球,hMSCs的微丸在37℃用透明质酸酶0.1%(Sigma)孵育1小时用于抗原提取。初级抗体,兔抗蛋白聚糖的多克隆抗体(1:50;Millipore,Molsheim,法国)或抗II型胶原蛋白单克隆小鼠抗体(1:50;lnterchim)与含有空载涂层微球和释放TGF-β3的涂层微球的hMSCs的微丸在室温下培养1小时。他们最后被Mayer苏木精复染(LabVision)3分钟,并通过Eukitt(Sigma)安装。阳性细胞外基质呈棕色。
hMSC在微丸中与TGF-β3PLGA涂层的微球(A、D),TGF-β3PLGA-P188-PLGA涂层的微球(B、E)和空载PLGA-P188-PLGA涂层的微球(C、F)培养。因此形成的配合物在28天后进行石蜡包埋切片以免疫染色。
A、B和C代表表达Ⅱ型胶原蛋白的免疫染色,而D、E、F是聚集蛋白聚糖的免疫染色。
结果示于图10中,显示软骨ECM分子的表达。
为Ⅱ型胶原蛋白的免疫组织化学特异性染色(图10A、B、C)显示了强烈的均匀分布的染色,尤其是当hMSC与释放TGFB3的FNPLGA-P188-PLGA涂层的微球结合的时候(图10C)。对于FN PLGA涂层的微球染色强度较弱,对于空载PLGA-P188-PLGA涂层的微球,没有看到特异性的II型胶原蛋白的表达。相比之下,当细胞与空载PLGA-P188-PLGA涂层的微球结合时观察到蛋白聚糖染色(与该蛋白在hMSC中基础水平一致)(图10D)。然而,当细胞和释放TGF-β3的涂层的微球培养时,这种染色更为激烈(图10E、F)。
这些结果证明了释放TGFB3的涂层的微球诱导分泌软骨ECM分子的hMSC的软骨细胞分化。此外,可能是由于增加的释放曲线,释放TGFB3的FN-PLGA-P188-PLGA涂层的微球可以更好地刺激软骨细胞的分化。
Claims (13)
1.一种携带细胞的微球组合物,其中所述微球组合物包含核心,所述核心包含三嵌段共聚物基质A-B-A,其中A选自聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)或聚丙交酯(PLA),以及B是泊洛沙姆或泊洛沙胺,其中所述微球核心涂有细胞粘附涂层并进一步包含与细胞粘附涂层结合的全细胞或细胞碎片。
2.如权利要求1所述的携带细胞的微球组合物,其中,A是聚(丙交酯-乙交酯)。
3.如权利要求1或2所述的携带细胞的微球组合物,其中,B是泊洛沙姆。
4.如权利要求1或2所述的携带细胞的微球组合物,其中,在三嵌段共聚物中泊洛沙姆或泊洛沙胺的比例在2和40%(w/w)之间。
5.如权利要求1-4中任一所述的携带细胞的微球组合物,其中,包含全细胞。
6.如权利要求1-5中任一所述的携带细胞的微球组合物,其中,进一步包含包埋在微球内的活性成分。
7.如权利要求6所述的携带细胞的微球组合物,其中,所述活性成分是蛋白质。
8.如权利要求1-7中任一所述的携带细胞的微球组合物,其中,所述细胞粘附涂层包含纤维连接蛋白和聚D-赖氨酸。
9.制备如权利要求1-5和8中任一所述的携带细胞的微球组合物的方法,包含以下步骤:
-提供包含三嵌段共聚物基质A-B-A的微球核心,其中A选自聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)或聚丙交酯(PLA),B是泊洛沙姆或泊洛沙胺,
-用细胞粘附化合物全部或部分涂覆微球,和
-使全细胞或细胞碎片与具有细胞粘附表面的微球接触,
用于获得含有全细胞或细胞碎片的携带细胞的微球组合物。
10.制备如权利要求6、7和8中任一所述的携带细胞的微球组合物的方法,包含以下步骤:
-提供A-B-A(优选聚(D,L-丙交酯-乙交酯)-泊洛沙姆-聚(D,L-丙交酯-乙交酯))三嵌段共聚物在聚合物的溶剂中的溶液,优选有机溶剂,
-提供活性成分(优选蛋白质),
-在A-B-A三嵌段共聚物溶液中加入活性成分,乳化或悬浮,在蛋白质的情形,优选将活性成分悬浮,
-将A-B-A三嵌段共聚物溶液在含有表面活性剂的水相中乳化,
-去除聚合物的溶剂,获得形成基质的微球,其中包埋有活性成分,
-分离微球,
-用细胞粘附化合物全部或部分涂覆所得到的微球,和
-使全细胞或细胞碎片与具有细胞粘附表面的微球接触,从而获得含有全细胞或细胞碎片的携带细胞的缓释微球组合物。
11.如权利要求1-8中任一所述的携带细胞的微球组合物,用于人或动物体的治疗性疗法。
12.如权利要求1-8中任一所述的携带细胞的微球组合物用于退行性疾病的治疗性疗法,所述组合物包含用于治疗退行性疾病的活性全细胞或细胞碎片。
13.一种药物组合物,包含如权利要求1-8中任一所述的携带细胞的微球组合物,以及药学上可接受的载体,以及任选的其他治疗性和/或预防性成分。
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