CN104459137A - 抗苯乙醇胺a单克隆抗体、抗原检测试剂盒及应用 - Google Patents

抗苯乙醇胺a单克隆抗体、抗原检测试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗苯乙醇胺A单克隆抗体，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株、含有该抗苯乙醇胺A单克隆抗体的检测试剂盒，属于免疫学技术领域和瘦肉精检测技术领域。本发明所述的抗苯乙醇胺A单克隆抗体的效价高达1：409600，亲和常数为8.8×108L/mol，与β-激动剂类似物的交叉反应率CR(％)均小于0.1％，半数抑制率IC50为0.18ng/ml。以该抗体为基础的试剂盒灵敏度高、稳定性好、精密度高，可用于苯乙醇胺A残留的快速检测。

Description

抗苯乙醇胺A单克隆抗体、抗原检测试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及抗苯乙醇胺A单克隆抗体，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株、含有该抗苯乙醇胺A单克隆抗体的检测试剂盒，属于免疫学技术领域和瘦肉精检测技术领域。
背景技术
苯乙醇胺A(Phenylethanolamine A，PEAA)俗称克伦巴胺，化学结构式为2-[4-(4-硝基苯基)丁基-2-羟基氨基]-1-甲氧基苯乙醇，英文名称2-(4-(nit rophenyl)butan-2-ylamino)-1-(4-me-thox yphenyl)ethanol，分子式为C19H24N2O4，化学结构式如下：
苯乙醇胺A具有典型的苯乙醇胺结构，由于同β-肾上腺素能受体激动剂结构类似，因而被认为是一种新型“瘦肉精”。PEAA饲喂动物同样具有促进骨骼生长，减少脂肪蓄积，增加瘦肉率等作用，由于PEAA的检测手段滞后，替代克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等瘦肉精被广泛应用，造成PEAA在可食性动物体内蓄积性残留，人食用后可引起头晕、心跳加快、肌肉震颤、心悸、呼吸困难等症状，严重可引起中毒，甚至死亡，严重威胁人类的健康。我国农业部的第1519号公告将PEAA列为禁止在饲料和动物饮水中使用的物质。
目前，苯乙醇胺A检测方法多为仪器分析法。尽管仪器分析法比较准确，但所用仪器价格昂贵、操作复杂，样品预处理复杂，检测费用高，需要专业人员操作，不适合现场大批量样本的快速筛选。
免疫分析方法是20世纪八九十年代优先研究开发和利用的兽药残留分析技术之一，是将有机化学、免疫学与理化分析等学科有机结合起来，开辟了一个新的分析技术领域，具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强、检测费用低等优点，在现场快速检测方面具有广阔的应用前景和开发潜力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种抗苯乙醇胺A单克隆抗体，进一步的，本发明提供该单克隆抗体的应用、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞、含有该单克隆抗体的检测试剂。
本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。
一种抗苯乙醇胺A单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2014222的杂交瘤细胞株PEAA-3B5产生。
上述抗苯乙醇胺A单克隆抗体亚型为IgG1(κ)。
上述苯乙醇胺A单克隆抗体在用于配制检测生物样品中的苯乙醇胺A残留的非诊断目的试剂盒中的应用。
一种产生上述抗苯乙醇胺A单克隆抗体的杂交瘤细胞株PEAA-3B5，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2014222。
一种检测试剂盒，该试剂盒含有上述苯乙醇胺A单克隆抗体。
进一步的，该检测试剂盒，含有经辣根过氧化物酶(HRP)、黑曲霉葡萄糖氧化酶小牛肠碱性磷酸酶(AKP)、或大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶标记的苯乙醇胺A单克隆抗体。
更进一步的，该检测试剂盒，还含有用苯乙醇胺A和载体蛋白的偶联物PEAA-OVA预包被的检测板、苯乙醇胺A标准品液、显色液和洗涤液。
一种制备上述苯乙醇胺A单克隆抗体的方法，包括如下步骤：
⑴将苯乙醇胺A与牛血清白蛋白或鸡卵白蛋白采用重氮化法连接，制备抗原；
⑵用步骤⑴所得抗原免疫小鼠，免疫后小鼠断尾取血，检测该血清的效价和抑制，选取免疫效果好的小鼠；
⑶取步骤⑵所述免疫效果好的小鼠的脾细胞，使其与小鼠骨髓瘤细胞融合，以选择性培养基培养所得融合细胞，测定抗体的效价和抑制，筛选阳性孔，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直至建立单一抗苯乙醇胺A单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
⑷将步骤⑶中所得的单一抗苯乙醇胺A单克隆抗体的杂交瘤细胞株注入石蜡油致敏的同系小鼠腹腔，制备腹水；
⑸将步骤⑷制备的腹水经过辛酸硫酸铵和Protein G亲和层析柱纯化，获得抗苯乙醇胺A的单克隆抗体。
本发明所述的抗苯乙醇胺A单克隆抗体的效价高达1：409600，亲和常数为8.8×108L/mol，与β-激动剂类似物的交叉反应率CR(％)均小于0.1％，半数抑制率IC50为0.18ng/ml。以本发明所述的抗苯乙醇胺A单克隆抗体为基本构建了检测苯乙醇胺A的试剂盒，为新型“瘦肉精”——苯乙醇胺A的抗原检测奠定了基础。目前，由于苯乙醇胺A检测方法存在所用仪器价格昂贵、操作复杂、样品预处理复杂、检测费用高、需要专业人员操作、不适合现场大批量样本的快速筛选的缺点，本发明则为苯乙醇胺A的检测提供了新的思路。以本发明所述的抗苯乙醇胺A单克隆抗体为基本构建了检测苯乙醇胺A的试剂盒灵敏度高、稳定性好、精密度高，可用于苯乙醇胺A残留的快速检测。
附图说明
图1为苯乙醇胺A(PEAA)、牛血清白蛋白(BSA)、苯乙醇胺A-牛血清白蛋白的交联物(PEAA-BSA)的紫外-可见光谱图。
图2为苯乙醇胺A单克隆抗体亚型测定。
图3为苯乙醇胺A抑制曲线。
本发明所述产生抗苯乙醇胺A单克隆抗体的杂交瘤细胞株PEAA-3B5，已于2014年11月28日送中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)，保藏号为CCTCC NO：C2014222。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，所列举的实施例不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 本发明所述抗苯乙醇胺A单克隆抗体的制备
1、苯乙醇胺A抗原的合成
⑴5mg PEAA溶于0.5ml 1mol/l的HCL中，然后加入5mg Zn粉，在室温条件下缓慢搅拌3-8小时；
⑵反应完毕后，4000rpm离心20min除去Zn粉，上清液用冰水冷却到0-4℃；
⑶用1M HCL调pH至pH1.5，然后向其中滴加已预冷的0.1mL 0.15mol/L NaNO2，期间不断搅拌；
⑷此反应液在0-4℃反应2-5h，注意此反应过程中必须保持温度低于4℃，防止生成的重氮盐分解；
⑸过量的NaNO2用0.1mol/L氨基磺酸中和，用淀粉碘化钾试纸检测，直至颜色由深蓝色变为浅蓝色为止，显色时间应该在滴加后0.5～2S；
⑹将混合液的pH用NaOH调至7.4；
⑺将此混合液逐滴加入到0.5ml溶解有5mg牛血清白蛋白(BSA)的0.05mol/L的PBS中，在4℃下搅拌反应过夜；
⑻用0.01mol/lpH7.4的PBS透析3天，即得到苯乙醇胺A-牛血清白蛋白交联物(PEAA-BSA)。
同法，可制备苯乙醇胺A-鸡卵白蛋白交联物(PEAA-OVA)。
PEAA、BSA和PEAA-BSA的紫外-可见光谱图如图1所示。PEAA、OVA和PEAA-OVA的紫外可见光谱图与图1相似。
2、苯乙醇胺A单克隆抗体的制备
选取5只6-8周龄的雌性BLAB/c小鼠，将PEAA-BSA用生理盐水稀释，直接进行尾静脉注射，免疫剂量10μg/只，每隔2周加强一次免疫，免疫流程如表1所示，3免后7-10天断尾取血，间接ELISA检测小鼠血清抗体效价，阻断ELISA测定抗血清抑制，选取最佳免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直至建立单一抗苯乙醇胺A单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
表1 免疫流程图
实施例2 本发明所述抗苯乙醇胺A单克隆抗体特性鉴定
1、亲和力测定
采用非竞争酶联免疫法测定苯乙醇胺A的亲和常数，结果测定亲和常数为8.8×108L/mol。
2、亚型测定
采用购自Sigma公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒进行亚型测定，结果见图2所示，亚型为IgG1(κ)。
3、效价测定
以1：40000稀释包被原PEAA-OVA包被检测板，将纯化后的单克隆抗体进行1:200，1:400，1:800，……1:800000稀释，加入到酶标板孔内，反应后加入HRP标记的羊抗鼠二抗，最后用TMB显色，结果显示纯化后的苯乙醇胺A单克隆抗体浓度为1mg/ml时的效价达1：409600。
4、特异性测定
用竞争ELISA测定抗苯乙醇胺A单克隆抗体与苯乙醇胺A、沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺、西马特罗、福莫特罗、妥布特罗等β-激动剂类似物的交叉反应率，结果见表2所示，CR(％)均小于0.1％。
表2 抗PEAA单克隆抗体与7种β-激动剂类似物交叉反应结果
5、抑制测定
向包被有PEAA-OVA抗原的检测板孔内，分别加入浓度为8.1ng/ml、2.7ng/ml、0.9ng/ml、0.3ng/ml、0.1ng/ml、0ng/ml的PEAA小分子标准品，同时加入纯化后的苯乙醇胺A单克隆抗体，反应后加入HRP标记的羊抗鼠二抗，最后用TMB显色，用H2SO4中止反应，酶标仪OD450测定吸光度值。
以标准品小分子浓度的对数为横坐标，以不同浓度小分子的OD450与零浓度小分子的OD450比值(B/B0)为纵坐标绘制标准曲线，结果见图3。
在0.1-8.1ng/ml的范围内，线性关系良好，半数抑制率IC50为0.18ng/ml。
实施例3 本发明所述检测苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒
1、包被抗原酶标板制备，将PEAA-OVA偶联物用CB包被液稀释至1：40000倍，包被到酶标板孔中，100μl/孔，37℃孵育2h，洗板，用封闭液200μl/孔37℃封闭1h，弃去液体，干燥，封装；
2、所述的CB包被液：pH9.6，具体成分和浓度为：无水碳酸钠(Na2CO3)1.59g/L，碳酸氢钠(Na2HCO3)2.93g/L。
3、苯乙醇胺A标准液为7个不同浓度梯度的溶液，其浓度分别为0ng/ml、0.1ng/ml、0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml、8.1ng/ml、100ng/ml，每个试剂盒中配各浓度各1瓶，每瓶7ml；
4、试剂盒中，以HRP标记抗苯乙醇胺A抗体较为常用，例如用高碘酸钠法合成辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗苯乙醇胺A单克隆抗体；
5、所述的洗涤液可以是ELISA试剂盒中常用洗涤液，例如是PBST洗涤液。
6、所述的显色液可以从商业途径购买到，例如是Sigma公司。
实施例4 本发明所述检测苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒性能检测
1、检测限
根据欧盟《动物源性食品中兽药残留检测方法》的规定，测定20份猪尿的空白样品，其测定平均值加3倍标准差即为最低检测限。经测定，最小检测值为0.1ng/ml。
2、精密度和准确度
将PEAA标准储液用正常尿液配成0.18ng/ml、0.36ng/ml、0.72ng/ml，每个浓度6次重复，分别计算批间和批内的变异系数及回收率，其中CV％＝SD均值/平均值X×100％。如表3所示，批内、批间的变异系数CV％都小于10％，说明本试剂盒的准确性在实验误差范围内；平均回收率在80-110％之间，表明该试剂盒的准确性和平行性较高，能够用于实际尿样的检测。
表3 猪肉组织批内、批间变异系数及回收率测定
上述实施例只为说明本发明的技术构思和优点，本发明也可以具有其它的形式变化，如本领域技术人员所熟知，上述实施例仅仅起到对上述发明保护范围内的示范作用，对本领域普通技术人员来说，在本发明所限定的保护范围内还有很多常规变形和其它实施例，这些变形和实施例都将在本发明待批的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种抗苯乙醇胺A单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2014222的杂交瘤细胞株PEAA-3B5产生。
2.根据权利要求1所述的抗苯乙醇胺A单克隆抗体，其特征在于，该抗苯乙醇胺A单克隆抗体的亚型为IgG1(κ)。
3.如权利要求1或2所述的苯乙醇胺A单克隆抗体在用于配制检测生物样品中的苯乙醇胺A残留的非诊断目的试剂盒中的应用。
4.一种产生如权利要求1或2所述抗苯乙醇胺A单克隆抗体的杂交瘤细胞株PEAA-3B5，其特征在于，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2014222。
5.一种检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有如权利要求1所述的苯乙醇胺A单克隆抗体。
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有经辣根过氧化物酶、黑曲霉葡萄糖氧化酶、小牛肠碱性磷酸酶或大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶标记的苯乙醇胺A单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有用苯乙醇胺A和载体蛋白的偶联物PEAA-OVA预包被的检测板、苯乙醇胺A标准品液、显色液和洗涤液。
8.一种制备权利要求1或2所述的苯乙醇胺A单克隆抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
⑴将苯乙醇胺A与牛血清白蛋白或鸡卵白蛋白采用重氮化法连接，制备人工抗原；
⑵用步骤⑴所得抗原免疫小鼠，免疫后小鼠断尾取血，检测该血清的效价和抑制，选取免疫效果好的小鼠；
⑶取步骤⑵所述免疫效果好的小鼠的脾细胞，使其与小鼠骨髓瘤细胞融合，以选择性培养基培养所得融合细胞，测定抗体的效价和抑制，筛选阳性孔，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直至建立单一抗苯乙醇胺A单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
⑷将步骤⑶中所得的单一抗苯乙醇胺A单克隆抗体的杂交瘤细胞株注入石蜡油致敏的同系小鼠腹腔，制备腹水；
⑸将步骤⑷制备的腹水经过辛酸硫酸铵和Protein G亲和层析柱纯化，获得抗苯乙醇胺A的单克隆抗体。
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