CN104459124B - 一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，其公开了一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法及应用，用于快速检测猪瘟病毒抗原CSFV。其制作方案是：以裸铂碳电极为工作电极，将MWCNTs-CD-Fc-Ab1对其进行修饰，然后依次加入牛血清白蛋白、猪瘟病毒抗原CSFV以及Ab2-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物。HS-β-CD-Ag-GOD共轭物可以转化葡萄糖为葡萄糖酸，并传递两个质子和两个电子给氧分子，产生双氧水，HS-β-CD-Ag纳米材料作为一种模拟酶，催化双氧水的还原，实现了电化学信号的双重放大，实现了较高的灵敏度，检测限可低至0.33pg/mL。

Description

一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明属于免疫分析与生物传感技术领域，具体涉及一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备及应用，研制一种快速检测猪瘟病毒抗原CSFV的夹心型电化学免疫传感器。
背景技术
猪瘟病毒抗原CSFV，或称猪霍乱，是一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。由于其高度的致病性和可引起广泛的死亡，给养猪业造成严重的经济损失。许多国家制定兽医法规，将猪瘟病毒列为法定传染病之一，也就是必须列表上报的疾病。发生疫情或可疑疫情，要尽快上报，立刻对疫点及其邻近牧场采取紧急兽医卫生防疫措施。
目前国内外绝大多数检测机构都在使用酶联免疫法对猪瘟病毒抗原CSFV进行检测。由于其检测周期长，程序复杂所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学生物化学，分子生物学的不断发展，电化学免疫传感器已经引起广泛的研究兴趣。
本发明采用夹心型电化学免疫传感器，结合双重放大技术，提高了传感器的检测灵敏度，另外，电化学免疫传感器以其选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点，可以被广泛的应用预防检测当中。
发明内容
本发明的目的在于避免传统检测方法的仪器设备复杂、操作过程繁琐、检测人员要求高、检测成本高等缺点，提供了一种灵敏度高、特异性强、重现性好、操作简便且价廉易得的检测猪瘟病毒抗原CSFV的夹心型电化学免疫传感器的制备方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下措施来实现的。本发明的技术方案，包括以下步骤。
1. 一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法
（1）将直径4 mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol·L-1铁***溶液中，在-0.2 ~ 0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于80 mV；
（2）将pH 7.0，0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液分散的MWCNTs-CD-Fc-Ab1修饰于玻碳电极表面，室温干燥，所述MWCNTs-CD-Fc-Ab1的浓度为1.0 ~ 3.0 mg·mL-1；
（3）滴涂3 μL、100 μg·mL-1的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下湿润条件下晾干；
（4）滴涂6 μL、0.001 ~ 5.0 ng·mL-1的猪瘟病毒抗原CSFV标准溶液至电极表面，4℃下湿润条件下晾干；
（5）滴涂6 μL的Ab2-CD-Ag-GOD溶液至电极表面，4℃下湿润条件下晾干，制得一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器。
2. 如上所述Ab2-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物溶液的制备方法
（1）HS-β-CD-Ag纳米材料的制备
将1 mL，0.005-0.015 mol/L的AgNO3和1 mL，0.02-0.04 mol/L的柠檬酸三钠加入到97 mL的高纯水中，搅拌均匀，震荡滴加1 mL，1.5-2.0 mg/mL的NaBH4，充分搅拌20 min，加入0.0238 g的巯基化β环糊精HS-β-CD，磁力搅拌24 h，转速为11000 rpm的条件下离心10 min，恒温60 ℃真空干燥；
（2）金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD的制备
称取25-41 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μL，0.5-1.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μL，0.5-1.5 mg/mL的葡萄糖氧化酶，恒温4 ℃过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，于-20 ℃的条件下保存，制得100-300 μg/mL的金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD溶液；
（3）金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2的制备
称取25-41 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μL，0.5-1.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μL，0.5-1.5 mg/mL检测抗体 Ab2，恒温4 ℃过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，加入1 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 ℃的条件下保存，制得100-300 μg/mL的金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2溶液；
（4）Ab2-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物溶液的制备
将金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2和金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD稀释至40-60 μg/mL，取200 μL，40-60 μg/mL ADA-Ab2和200 μL，40-60 μg/mL ADA-GOD，加入200 μL，3-5 mg/mL HS-β-CD-Ag，恒温4 ℃孵化过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，弃去上清液，加入200 μL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 ℃的条件下保存，制得Ab2-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物溶液；
（5） 多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料的制备
称取0.4-0.6 g多壁碳纳米管MWCNTs，加入到已配好的H2SO4和HNO3为3:1的混合溶液中，恒温40 ℃超声3 h，冷却至室温，用超纯水稀释到500 mL，使用0.22 μm的滤膜进行真空抽滤，超纯水洗涤到pH为中性，恒温60 ℃真空干燥，制得羧基化多壁碳纳米管MWCNTs-COOH；
称取20-30 mg MWCNTs-COOH，分散到50 mL超纯水中，然后加入150-250 mg的β-环糊精CD，震荡12 h，离心，水洗4次，恒温60 ℃真空干燥，60-100 mg二茂铁甲酸Fc加入到50 mL的二氯甲烷中，加入20-30 mg MWCNTs-CD，搅拌12 h，离心干燥，得多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料；
（6）多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-CD-Fc-Ab1的制备
称取3-5 mg的MWCNTs-CD-Fc分散到2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液中，加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS，恒温4 ℃搅拌0.5 h, 加入200 μL, 0.5-1.5 mg/mL 捕获抗体Ab1, 恒温4 ℃震荡12h，制得多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-CD-Fc-Ab1。
3. 猪瘟病毒抗原CSFV的检测方法
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL、40~60 mmol/L的pH6.0 ~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；
（2）根据所得电流差值与猪瘟病毒抗原CSFV浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
（3）依据工作曲线的绘制方法进行样品中猪瘟病毒抗原CSFV的检测，检测结果从工作曲线中查得。
本发明的有益成果
（1）本发明是基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物，构建了一种夹心型电化学免疫传感器，金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD可以转化葡萄糖为葡萄糖酸，并传递两个质子和两个电子给氧分子，产生双氧水，HS-β-CD-Ag纳米材料作为一种模拟酶，催化双氧水的还原，实现了电化学信号的双重放大；
（2）本发明采用的HS-β-CD-Ag纳米材料具有良好的分子识别能力，可以有效地捕捉金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD和金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2；
（3）本发明利用MWCNTs-CD-Fc复合材料大的比表面积，良好的生物相容性和高的导电性，来有效地固定捕获抗体Ab1，提高免疫传感的检测灵敏度；
（4）本发明将该传感器应用于猪瘟病毒抗原CSFV的高灵敏、特异性检测，线性范围为0.001-5 ng/mL，检出限为0.33 pg/mL。
具体实施方式
实施例1  HS-β-CD-Ag纳米材料的制备
将1 mL，0.005 mol/L的AgNO3和1 mL，0.02 mol/L的柠檬酸三钠加入到97 mL的高纯水中，搅拌均匀，震荡滴加1 mL，1.5 mg/mL的NaBH4，充分搅拌20 min，加入0.0238 g的巯基化β环糊精HS-β-CD，磁力搅拌24 h，转速为11000 rpm的条件下离心10 min，恒温60 ℃真空干燥；
实施例2  HS-β-CD-Ag纳米材料的制备
将1 mL，0.01 mol/L的AgNO3和1 mL，0.03 mol/L的柠檬酸三钠加入到97 mL的高纯水中，搅拌均匀，震荡滴加1 mL，1.79 mg/mL的NaBH4，充分搅拌20 min，加入0.0238 g的巯基化β环糊精HS-β-CD，磁力搅拌24 h，转速为11000 rpm的条件下离心10 min，恒温60 ℃真空干燥；
实施例3  HS-β-CD-Ag纳米材料的制备
将1 mL，0.015 mol/L的AgNO3和1 mL， 0.04 mol/L的柠檬酸三钠加入到97 mL的高纯水中，搅拌均匀，震荡滴加1 mL， 2.0 mg/mL的NaBH4，充分搅拌20 min，加入0.0238 g的巯基化β环糊精HS-β-CD，磁力搅拌24 h，转速为11000 rpm的条件下离心10 min，恒温60 ℃真空干燥；
实施例4  金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD的制备
称取25 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μL，0.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μL，0.5 mg/mL的葡萄糖氧化酶，恒温4 ℃过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，于-20 ℃的条件下保存，制得100 μg/mL的金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD溶液；
实施例5  金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD的制备
称取33 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μL，1 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在2 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μL，1 mg/mL的葡萄糖氧化酶，恒温4 ℃过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，于-20 ℃的条件下保存，制得200 μg/mL的金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD溶液；
实施例6  金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD的制备
称取41 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μL，1.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μL， 1.5 mg/mL的葡萄糖氧化酶，恒温4 ℃过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，于-20 ℃的条件下保存，制得300 μg/mL的金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD溶液；
实施例7  金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2的制备
称取25 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μL，0.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μL，0.5 mg/mL检测抗体 Ab2，恒温4 ℃过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，加入1 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 ℃的条件下保存，制得100 μg/mL的金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2溶液；
实施例8  金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2的制备
称取33 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μL，1 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在2 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μL，1 mg/mL检测抗体 Ab2，恒温4 ℃过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，加入1 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 ℃的条件下保存，制得200 μg/mL的金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2溶液；
实施例9  金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2的制备
称取41 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μL，1.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μL， 1.5 mg/mL检测抗体 Ab2，恒温4 ℃过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，加入1 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 ℃的条件下保存，制得300 μg/mL的金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2溶液。
实施例10  Ab2-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物溶液的制备
将金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2和金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD稀释至40 μg/mL，取200 μL，40 μg/mL ADA-Ab2和200 μL，40 μg/mL ADA-GOD，加入200 μL，3 mg/mL HS-β-CD-Ag，恒温4 ℃孵化过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，弃去上清液，加入200 μL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 ℃的条件下保存，制得Ab2-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物溶液；
实施例11  Ab2-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物溶液的制备
将金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2和金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD稀释至50 μg/mL，取200 μL，50 μg/mL ADA-Ab2和200 μL，50 μg/mL ADA-GOD，加入200 μL，4 mg/mL HS-β-CD-Ag，恒温4 ℃孵化过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，弃去上清液，加入200 μL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 ℃的条件下保存，制得Ab2-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物溶液；
实施例12  Ab2-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物溶液的制备
将金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2和金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD稀释至60 μg/mL，取200 μL，60 μg/mL ADA-Ab2和200 μL，60 μg/mL ADA-GOD，加入200 μL，5 mg/mL HS-β-CD-Ag，恒温4 ℃孵化过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，弃去上清液，加入200 μL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 ℃的条件下保存，制得Ab2-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物溶液；
实施例13  多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料的制备
称取0.4g多壁碳纳米管MWCNTs，加入到已配好的H2SO4和HNO3为3:1的混合溶液中，恒温40 ℃超声3 h，冷却至室温，用超纯水稀释到500 mL，使用0.22 μm的滤膜进行真空抽滤，超纯水洗涤到pH为中性，恒温60 ℃真空干燥，制得羧基化多壁碳纳米管MWCNTs-COOH；
称取20mg MWCNTs-COOH，分散到50 mL超纯水中，然后加入150 mg的β-环糊精CD，震荡12 h，离心，水洗4次，恒温60 ℃真空干燥，60 mg二茂铁甲酸Fc加入到50 mL的二氯甲烷中，加入20 mg MWCNTs-CD，搅拌12 h，离心干燥，得多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料；
实施例14  多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料的制备
称取0.5 g多壁碳纳米管MWCNTs，加入到已配好的H2SO4和HNO3为3:1的混合溶液中，恒温40 ℃超声3 h，冷却至室温，用超纯水稀释到500 mL，使用0.22 μm的滤膜进行真空抽滤，超纯水洗涤到pH为中性，恒温60 ℃真空干燥，制得羧基化多壁碳纳米管MWCNTs-COOH；
称取25 mg MWCNTs-COOH，分散到50 mL超纯水中，然后加入200 mg的β-环糊精CD，震荡12 h，离心，水洗4次，恒温60 ℃真空干燥，80 mg二茂铁甲酸Fc加入到50 mL的二氯甲烷中，加入25 mg MWCNTs-CD，搅拌12 h，离心干燥，得多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料；
实施例15  多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料的制备
称取0.6 g多壁碳纳米管MWCNTs，加入到已配好的H2SO4和HNO3为3:1的混合溶液中，恒温40 ℃超声3 h，冷却至室温，用超纯水稀释到500 mL，使用0.22 μm的滤膜进行真空抽滤，超纯水洗涤到pH为中性，恒温60 ℃真空干燥，制得羧基化多壁碳纳米管MWCNTs-COOH；
称取30 mg MWCNTs-COOH，分散到50 mL超纯水中，然后加入250 mg的β-环糊精CD，震荡12 h，离心，水洗4次，恒温60 ℃真空干燥，100 mg二茂铁甲酸Fc加入到50 mL的二氯甲烷中，加入30 mg MWCNTs-CD，搅拌12 h，离心干燥，得多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料；
实施例16 多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-CD-Fc-Ab1的制备
称取3 mg的MWCNTs-CD-Fc分散到2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液中，加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS，恒温4 ℃搅拌0.5 h, 加入200 μL, 0.5 mg/mL 捕获抗体Ab1, 恒温4 ℃震荡12h，制得多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-CD-Fc- Ab1；
实施例17 多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-CD-Fc-Ab1的制备
称取4 mg的MWCNTs-CD-Fc分散到2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液中，加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS，恒温4 ℃搅拌0.5 h, 加入200 μL, 1 mg/mL 捕获抗体Ab1, 恒温4 ℃震荡12h，制得多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-CD-Fc-Ab1；
实施例18 多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-CD-Fc-Ab1的制备
称取5 mg的MWCNTs-CD-Fc分散到2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液中，加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS，恒温4 ℃搅拌0.5 h, 加入200 μL, 1.5 mg/mL 捕获抗体Ab1, 恒温4 ℃震荡12h，制得多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-CD-Fc-Ab1；
实施例19  猪瘟病毒抗原CSFV的检测方法
实施例1~18中任一所述的一种高灵敏猪瘟病毒抗原CSFV免疫传感器，用于猪瘟病毒抗原CSFV的检测，包括以下步骤：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL、40mmol/L的pH6.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；
（2）根据所得电流差值与猪瘟病毒抗原CSFV浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
（3）依据工作曲线的绘制方法进行样品中猪瘟病毒抗原CSFV的检测，检测结果从工作曲线中查得。
实施例20 猪瘟病毒抗原CSFV的检测方法
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH7.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；
（2）根据所得电流差值与猪瘟病毒抗原CSFV浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
（3）依据工作曲线的绘制方法进行样品中猪瘟病毒抗原CSFV的检测，检测结果从工作曲线中查得。
实施例21猪瘟病毒抗原CSFV的检测方法
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL、60 mmol/L的pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；
（2）根据所得电流差值与猪瘟病毒抗原CSFV浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
（3）依据工作曲线的绘制方法进行样品中猪瘟病毒抗原CSFV的检测，检测结果从工作曲线中查得。

Claims (2)

1. 一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）HS-β-CD-Ag纳米材料的制备
将1 mL，0.005-0.015 mol/L的AgNO3和1 mL，0.02-0.04 mol/L的柠檬酸三钠加入到97 mL的高纯水中，搅拌均匀，震荡滴加1 mL，1.5-2.0 mg/mL的NaBH4，充分搅拌20 min，加入0.0238 g的巯基化β环糊精HS-β-CD，磁力搅拌24 h，转速为11000 rpm的条件下离心10 min，恒温60 ℃真空干燥；
（2）金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD的制备
称取25-41 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μL，0.5-1.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μL，0.5-1.5 mg/mL的葡萄糖氧化酶，恒温4 ℃过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，于-20 ℃的条件下保存，制得100-300 μg/mL的金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD溶液；
（3）金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2的制备
称取25-41 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μL，0.5-1.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μL，0.5-1.5 mg/mL检测抗体 Ab2，恒温4 ℃过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，加入1 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 ℃的条件下保存，制得100-300 μg/mL的金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2溶液；
（4）Ab2-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物溶液的制备
将金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2和金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD稀释至40-60 μg/mL，取200 μL，40-60 μg/mL ADA-Ab2和200 μL，40-60 μg/mL ADA-GOD，加入200 μL，3-5 mg/mL HS-β-CD-Ag，恒温4 ℃孵化过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，弃去上清液，加入200 μL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 ℃的条件下保存，制得Ab2-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物溶液；
（5） 多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料的制备
称取0.4-0.6 g多壁碳纳米管MWCNTs，加入到已配好的H2SO4和HNO3为3:1的混合溶液中，恒温40 ℃超声3 h，冷却至室温，用超纯水稀释到500 mL，使用0.22 μm的滤膜进行真空抽滤，超纯水洗涤到pH为中性，恒温60 ℃真空干燥，制得羧基化多壁碳纳米管MWCNTs-COOH；
称取20-30 mg MWCNTs-COOH，分散到50 mL超纯水中，然后加入150-250 mg的β-环糊精CD，震荡12 h，离心，水洗4次，恒温60 ℃真空干燥，60-100 mg二茂铁甲酸Fc加入到50 mL的二氯甲烷中，加入20-30 mg MWCNTs-CD，搅拌12 h，离心干燥，得多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料；
（6）多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-CD-Fc-Ab1的制备
称取3-5 mg的MWCNTs-CD-Fc分散到2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液中，加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS，恒温4 ℃搅拌0.5 h, 加入200 μL, 0.5-1.5 mg/mL 捕获抗体Ab1, 恒温4 ℃震荡12h，制得多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-CD-Fc-Ab1；
（7）传感器的制备
1）将直径4 mm 的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm 的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol·L-1铁***溶液中，在-0.2 ~ 0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于80 mV；
2）将pH 7.0，0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液分散的MWCNTs-CD-Fc-Ab1修饰于玻碳电极表面，室温干燥，所述MWCNTs-CD-Fc-Ab1的浓度为1.0 ~ 3.0 mg·mL-1；
3）滴涂3 μL、100 μg·mL-1的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下湿润条件下晾干；
4）滴涂6 μL、0.001 ~ 5.0 ng·mL-1的猪瘟病毒抗原CSFV标准溶液至电极表面，4℃下湿润条件下晾干；
5）滴涂6 μL的Ab2-HS-β-CD-Ag-GOD溶液至电极表面，4℃下湿润条件下晾干，制得一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器。
2.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器在检测猪瘟病毒抗原CSFV中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL、40~60 mmol/L的pH6.0 ~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；
（2）根据所得电流差值与猪瘟病毒抗原CSFV浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
（3）依据工作曲线的绘制方法进行样品中猪瘟病毒抗原CSFV的检测，检测结果从工作曲线中查得。
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