CN104450918B - 检测fgf13基因第2外显子突变位点的方法及其试剂盒 - Google Patents

检测fgf13基因第2外显子突变位点的方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测FGF13基因第2外显子突变位点的方法及其试剂盒，该方法包括步骤：1)提取样本DNA，作为DNA模板；2)利用如SEQ ID NO.1‑3所示的ARMS引物和如SEQ ID NO.11所示的探针，对DNA模板进行荧光PCR扩增；3)检测荧光PCR扩增中的反应体系的荧光强度，并根据荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值来判断FGF13基因第2外显子突变位点的突变。该试剂盒包括：SEQ ID NO.1‑3所示的ARMS引物和一个如SEQ ID NO.11所示的探针。本发明能克服现有测序技术低通量、耗时长、检测能力有限等缺点，且具有快速、通量高、灵敏度高等优点。

Description

检测FGF13基因第2外显子突变位点的方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测基因突变的方法及其试剂盒，特别是涉及一种检测FGF13(成纤维细胞生长因子13)基因第2外显子(EXON 2)突变位点的方法及其试剂盒。
背景技术
FGF13是FGF11亚家族成员，这类FGF分子因缺乏信号肽而无法分泌，只在细胞内发挥功能。研究发现，FGF13与X-连锁智力障碍有关，在人类和小鼠上FGF13基因定位在X染色体q26区段，该区域的遗传变异可能导致Borjeson-Forssman-Lehmann(BFLS)综合征。小鼠的神经发育研究发现，FGF13是微管稳定蛋白，可以聚合和稳定微管。FGF13调节大脑皮层和海马神经元发育和迁移，FGF13缺失会阻碍神经元从多极性向双极性转化，还导致轴突或前导突起的过度分支，从而减缓神经元的迁移，造成大脑皮层和海马结构异常，皮层丘脑神经束的轴突分支增多。FGF13敲除小鼠的学习记忆能力受到明显损害。临床病例研究发现，FGF13基因突变与儿童智力障碍密切相关。这些发现提示FGF13是一种重要的调控神经发育和影响智力障碍综合征的关键分子。
研究显示FGF13基因5’UTR的一个点突变在293T细胞系中导致FGF13蛋白水平表达量下降，而相应的mRNA水平没有发生改变。该位点位于FGF13基因2号外显子中，基因组物理位置为chrX:138286301，突变为一C>G点突变。大样本量人群筛查发现，在302例智力发育障碍患儿中，有3位男性患儿在该位点存在突变。3位患儿的父亲均没有携带这一突变位点，而3个母亲则均为携带突变位点的杂合体，这说明了这一位点的遗传性。另外，在对照组的1245位样本中，只有2位女性为携带这一位点的杂合体，其频率远远小于智力障碍组。这些数据证明该突变位点对于智力发育障碍的发生起着重要的作用。
扩增阻滞突变***(amplification refractory mutation system,ARMS)是在PCR的基础上发展起来的识别突变位点或多态性的技术。ARMS已成功用于基因多态性分析，包括体细胞突变和生殖细胞突变。该技术的优点是可在大量野生DNA背景下成功分辨出低含量的突变。
ARMS***是基于3’端错配原则，即在扩增反应时，若3’端碱基对形成错配，在无3’-5’外切酶活性的PCR***中，链延伸反应会因3’-5’磷酸二酯键形成的障碍而受阻，因此，只有模板链是特定的等位基因时，才会产生特异的扩增产物。为避免引物同靶DNA错配时存在错配延伸，可在引物的3’端第2-3位引入错配碱基，使同模板之间形成多重错配从而阻止错配延伸。
而ARMS-qPCR***在ARMS***上添加特异荧光探针，可提高检测结果的特异性和灵敏度。因而，基于ARMS-qPCR***，对FGF13基因第2外显子突变位点进行检测的方法具有进一步研究和应用的价值，以便能简单、快捷地检测FGF13基因第2外显子突变位点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测FGF13基因第2外显子突变位点的方法及其试剂盒。该方法是基于ARMS-qPCR***的荧光PCR检测方法，其能克服现有测序技术低通量、耗时长、检测能力有限等缺点，且具有快速、通量高、灵敏度高等优点。
为解决上述技术问题，本发明的检测FGF13基因第2外显子突变位点的方法，包括以下步骤：
1)提取样本DNA，将其作为DNA模板；
2)利用一组如SEQ ID NO.1-3所示的ARMS引物和一个如SEQ ID NO.11所示的探针(特异性双环探针)，对步骤1)的DNA模板进行荧光PCR扩增(即进行荧光PCR扩增突变基因序列)；
3)检测荧光PCR扩增中的反应体系的荧光强度，并根据荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值来判断FGF13基因第2外显子突变位点的突变。
所述步骤1)中，样本包括：血液或唾液。
所述步骤2)中，所述特异性双环探针的5’端和3’端分别连接有荧光基团和淬灭基团；其中，5’端的荧光基团包括：FAM、HEX、CY5或ROX，优选FAM、HEX或ROX；3’端的淬灭基团可包括：BHQ(如BHQ 1等)；
所述荧光PCR扩增的总体积为20μl的反应体系如下：
其中，所述荧光PCR扩增中的1×PCR缓冲液、MgCl2、各dNTP和Taq酶和水可均来自于LIFE TECH公司。
所述荧光PCR扩增的反应条件如下：
95℃预变性10分钟；15个循环，94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟；35个循环，94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟；并且在后35个循环的退火阶段检测FAM和HEX的荧光信号，或者检测FAM和ROX的荧光信号。
所述步骤2)中，还包括：利用如SEQ ID NO.13-14所示的质控基因引物和SEQ ID NO.15所示的质控基因探针对步骤1)的DNA模板进行荧光PCR扩增。
所述步骤3)中，判断FGF13基因第2外显子突变位点的突变的标准为：
检测荧光PCR扩增中的反应体系的FAM与HEX的荧光信号，或者FAM与ROX的荧光信号，以HEX或ROX信号达到设定阈值(12<Ct<20)时，表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为突变阴阳性判断的标准，Ct值>20：阴性(未突变)；Ct值<20：阳性(突变)。
表1 序列
另外，本发明还提供一种用于上述方法的检测试剂盒，其包括：SEQ ID NO.1-3所示的ARMS引物和一个如SEQ ID NO.11所示的探针。
所述试剂盒还可包括：如SEQ ID NO.13-14所示的质控基因引物和SEQ ID NO.15所示的质控基因探针。
进一步地，所述试剂盒还可包括：PCR反应所需要的试剂，如常规的PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和Taq酶。
本发明中，根据人类成纤维细胞生长因子FGF13基因第2外显子突变位点野生型基因序列和相应突变基因序列，设计一组ARMS引物和一个特异性双环探针，并配制荧光PCR扩增突变位点基因序列的反应体系，以及用上述引物和特异性双环探针同时扩增待测的基因序列，利用双环探针与扩增产物的杂交，检测反应体系的荧光强度，从而最终进行FGF13基因第2外显子突变位点的检测。
本发明的有益效果如下：
1)通量高：可一次性分析48个样本；
2)灵敏度高：20ng基因组DNA即可完成精准分析；
3)特异性好，精度高，检测成功率为100％；
4)污染少：检测过程为闭管检测，减少污染的可能性；
5)操作简单快速，整个检测过程耗时短；
6)多类型样本检测：如对血液样本、唾液样本等复杂样本来源的DNA样本都可检测；
7)安全：整个体系不包含有毒有害物质，避开电泳检测，对实验人员和环境无危害。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1是不同质粒模板拷贝数条件下的标准曲线；
图2是质粒模板为1000拷贝和100拷贝的重复性检测结果，其中，1为质粒模板1000拷贝，2为质粒模板100拷贝；
图3是纯合突变样本扩增曲线图；
图4是野生样本扩增曲线图；
图5是杂合型样本扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围。
本发明以基因工程构建的突变质粒和野生质粒为模板，构建人类FGF13EXON2突变位点ARMS实时荧光PCR检测体系，以FAM为检测对象，通过特异ARMS引物的优化组合以及荧光探针检测体系优化，从而实现快速准确、简单地，通量化检测。
检测FGF13 EXON2突变位点的方法，包括以下步骤：
1.针对突变位点设计合成ARMS引物组合和探针
根据FGF13 EXON2突变位点的序列，针对突变位点设计多对ARMS引物组合和探针，通过实验优化，实现高灵敏和特异性检测。突变位点信息详见表2中的带横线的碱基。
针对突变位点序列，应用primer 5.0引物设计软件设计多对ARMS引物组合和探针，引物和探针序列如表2所示。其中，引物Actin forward和Actin reverse作为质控基因引物，探针Actin Probe作为质控基因探针，以进行质控。
表2
2、待测样本制备和提取
采用商业化的DNA提取试剂盒提取样本DNA，具体操作参考试剂盒说明书。
3、荧光PCR扩增，建立扩增反应体系
将步骤2中得到的DNA样本(即DNA模板)，经紫外分光光度计检测并读取其含量。将DNA模板稀释至10ng/μL。
按照如下扩增体系进行PCR扩增(总体积20μL)：
其中，所述荧光PCR扩增中的1×PCR缓冲液、MgCl2、各dNTP和Taq酶和水可均来自于LIFE TECH公司。
实时PCR反应条件为：95℃预变性10分钟；15个循环94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟；35个循环94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟；在后35个循环的退火阶段检测FAM和HEX的荧光信号，或检测FAM和ROX的荧光信号。
4、检测荧光信号，以达到设定阈值时所需的循环数Ct值作为结果判断的标准：
其中，以FAM和HEX的荧光信号为例，具体如下：
检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(12<Ct<20)时，表明DNA上样量在允许范围内，FAM信号可信。以FAM达到设定阈值所需Ct值作为判断标准：
扩增突变(mutation)位点的Ct值<20，且同HEX信号的Ct值的差值绝对值小于4，扩增野生型(wild)位点的Ct值>20且与扩增mutation位点Ct值的差值大于7，为纯合突变型；
扩增wild位点的Ct值<20，且同HEX信号的Ct值的差值绝对值小于4，扩增mutation位点的Ct值>20且与扩增mutation位点Ct值的差值大于7，为野生型；
扩增mutation和wild位点的Ct值均小于20，两者ct值差值小于7，并且两者Ct值均同HEX信号的Ct值差值绝对值小于4，则判为杂合型。
另外，对于FAM和ROX的荧光信号的判断如同上述FAM和HEX的判断标准。
实施例1
运用含FGF13基因第2外显子突变位点的质粒模板(一个待测位点处为C，一个待测位点处为G)，利用表2中引物和探针，分别进行qPCR以优化选择最佳的ARMS引物。
其中，对于下述表格中涉及的野生型质粒——FGF13 wild vector(待测位点处为C)，突变型质粒——FGF13 mutation vector(待测位点处为G)均可按照常规的质粒构建方法并利用PCR克隆方法制备得到。
1)质粒处理和抽提：
质粒的提取采用TIANGEN(HighPure Plasmid Kit，DP116)的质粒提取试剂盒进行，具体操作步骤详见产品说明书。所提DNA溶解于Tris-HCl中(10mmol/L，pH8.0)，紫外分光光度计检测样本质量并测定浓度。然后，将样本稀释至10ng/μL。取1μL进行PCR反应。
2)按照如下扩增体系进行PCR扩增(qPCR体系，总体积20μL)
其中，所述荧光PCR扩增中的1×PCR缓冲液、MgCl2、各dNTP和Taq酶和水可均来自于LIFE TECH公司。
3)PCR反应条件为95℃预变性10分钟，15个循环94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟；35个循环94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟；在后35个循环的退火阶段检测FAM荧光信号和HEX荧光信号。
4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准(参考上述)。
5)优化ARMS引物，将表中引物分为三组。
组1：FGF13 Wild C，FGF13 Mutation G，FGF13 RV；
组2：FGF13 Wild-2 C，FGF13 Mutation-2 G，FGF13 RV；
组3：FGF13 Wild-1 C，FGF13 Mutation-1 G，FGF13 RV。
下游引物均为FGF13 RV，探针均为FGF13 Probe，组内上游引物同下游引物配对检测相应突变位点。其他qPCR体系中成分固定不变，结果如表3-5所示，引物组1(FGF13 Wild C，FGF13 Mutation G，FGF13 RV)结果最佳。
表3 引物组1同FGF13probe探针以含突变位点的质粒模板为模板的荧光PCR检测结果
表4 引物组2同FGF13probe探针以含突变位点的质粒模板为模板的荧光PCR检测结果
表5 引物组3同FGF13probe探针以含突变位点的质粒模板为模板的荧光PCR检测结果
6)灵敏度分析：将质粒模板从10000个拷贝开始稀释，直至稀释至5拷贝，然后分别对其进行检测，结果表明本发明的荧光PCR方法灵敏度高，引物检测对应质粒样本，5拷贝即可检出(如图1所示)。
7)重复性实验：每个反应分别加入阳性对照模板质粒DNA 1000拷贝，100拷贝，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不超过0.5个循环(如图2所示)。
检测结果表明，本发明的检测体系选择最优的ARMS引物对和探针(即SEQ ID NO.1-3所示的引物和SEQ ID NO.11所示的探针)，可准确识别突变位点，检测的灵敏度可达到5拷贝。
实施例2
运用本发明检测临床样本，获取待测者的外周血样本，抽提DNA，利用本发明中特异ARMS引物和荧光探针PCR体系对其检测，并同时进行测序验证。
步骤如下：
1)样本处理和DNA提取：
采用商业化的DNA提取试剂盒提取样本DNA，具体操作参考试剂盒说明书。
将样本DNA稀释至10ng/μL。
2)按照如下扩增体系进行PCR扩增(总体积20μL)
其中，上述PCR扩增中的引物为如SEQ ID NO.1-3所示的引物以及SEQ ID NO.13-14所示的质控基因引物，探针为如SEQ ID NO.11所示的探针和如SEQ ID NO.15所示的质控基因探针。
另外，PCR扩增中的1×PCR缓冲液、MgCl2、各dNTP和Taq酶和水可均来自于LIFE TECH公司。
3)PCR反应条件为95℃预变性10分钟，15个循环94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟；35个循环94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟；在后35个循环的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号。
4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准
检测反应体系的FAM和HEX的荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(12<Ct<20)时，表明DNA上样量在允许范围内，FAM信号可信。以FAM达到设定阈值所需Ct值作为结果判断标准：
扩增mutation位点的Ct值<20，且同HEX信号的Ct值的差值绝对值小于4，而扩增wild位点的Ct值>20且与扩增mutation位点Ct值的差值大于7，为纯合突变型，扩增图详见图3；
扩增wild位点的Ct值<20，且同HEX信号的Ct值的差值绝对值小于4，扩增mutation位点的Ct值>20且与扩增mutation位点Ct值的差值大于7，为野生型，扩增图详见图4；
扩增mutation和wild位点的Ct值均小于20，两者Ct值差值绝对值小于7，并且两者Ct值均同HEX信号的Ct值差值绝对值小于4，则判为杂合型，扩增图详见图5。
5)检测结果表明本发明检测结果同DNA测序结果一致：1225例样本中有8例杂合，4例纯合突变(如表6所示)。
表6
实施例3
运用本发明检测唾液样本，唾液样本抽提DNA后，利用本发明中特异ARMS引物和荧光探针PCR体系对其检测，并同时进行测序验证。
步骤如下：
1)样本处理和DNA提取：
采用商业化的DNA提取试剂盒提取样本DNA，具体操作参考试剂盒说明书。
样本稀释至10ng/μL。
2)按照如下扩增体系进行PCR扩增(总体积20μL)
其中，上述PCR扩增中的引物为如SEQ ID NO.1-3所示的引物以及SEQ ID NO.13-14所示的质控基因引物，探针为如SEQ ID NO.11所示的探针和如SEQ ID NO.15所示的质控基因探针。
另外，PCR扩增中的1×PCR缓冲液、MgCl2、各dNTP、Taq酶和水可均来自于LIFE TECH公司。
3)PCR反应条件为95℃预变性10分钟，15个循环94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟；35个循环94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟；在后35个循环的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号。
4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准
检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(12<Ct<20)时，表明DNA上样量在允许范围内，FAM信号可信。以FAM达到设定阈值所需Ct值作为结果判断标准：
扩增mutation位点的Ct值<20，且同HEX信号的Ct值的差值绝对值小于4，而扩增wild位点的Ct值>20且与扩增mutation位点Ct值的差值大于7，为纯合突变型；
扩增wild位点的Ct值<20，且同HEX信号的Ct值的差值绝对值小于4，扩增mutation位点的Ct值>20且与扩增mutation位点Ct值的差值大于7，为野生型；
扩增mutation和wild位点的Ct值均小于20，两者Ct值差值绝对值小于7，并且两者Ct值均同HEX信号的Ct值差值绝对值小于4，则判为杂合型。
5)检测结果表明本发明检测结果同DNA测序结果一致：8例样本中有2例杂合突变，1例纯合突变(如表7所示)。
表7
6)本发明实验体系可用于检测复杂样本，如唾液样本，样本取材便捷，并且无创取样，病人无痛苦。检测时间仅需100分钟。因此，本发明省时省力，准确性高，可满足临床无创快速检测。
实施例4
根据上述实施例中的检测方法，为了更加简便和快捷地用来检测待测样品(如唾液或血液等)，将本发明的检测方法中所用到的试剂制备成一种试剂盒。
该试剂盒的组分为如SEQ ID NO.1-3所示的ARMS引物和一个如SEQ ID NO.11所示的探针。
另外，根据需要，该试剂盒还可包括：如SEQ ID NO.13-14所示的质控基因引物和SEQ IDNO.15所示的质控基因探针。
进一步地，所述试剂盒还可包括：PCR反应所需要的试剂，如常规的PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和Taq酶。

Claims (8)

1.一种非诊断目的的检测FGF13基因第2外显子突变位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取样本DNA，将其作为DNA模板；
2)利用一组如SEQ ID NO.1-3所示的ARMS引物和一个如SEQ ID NO.11所示的探针，对步骤1)的DNA模板进行荧光PCR扩增；
3)检测荧光PCR扩增中的反应体系的荧光强度，并根据荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值来判断FGF13基因第2外显子突变位点的突变。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤2)中，探针的5’端和3’端分别连接有荧光基团和淬灭基团；其中，荧光基团选自：FAM、HEX、CY5或ROX；淬灭基团选自：BHQ。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述荧光基团为FAM、HEX或ROX；淬灭基团为BHQ1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，荧光PCR扩增的总体积为20μl的反应体系如下：
加水补足至20μl；
步骤2)中，荧光PCR扩增的反应条件如下：
95℃预变性10分钟；15个循环，94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟；35个循环，94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟；并且在后35个循环的退火阶段检测FAM和HEX的荧光信号，或者检测FAM和ROX的荧光信号。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，还包括：利用如SEQ IDNO.13-14所示的质控基因引物和SEQ ID NO.15所示的质控基因探针对步骤1)的DNA模板进行荧光PCR扩增。
6.一种用于如权利要求1～5任一项所述的方法的检测试剂盒，其特征在于，包括：SEQID NO.1-3所示的ARMS引物和一个如SEQ ID NO.11所示的探针。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：如SEQ ID NO.13-14所示的质控基因引物和SEQ ID NO.15所示的质控基因探针。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和Taq酶。
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CN1414021A (zh) * 2002-07-12 2003-04-30 人体基因组科学有限公司 成纤维细胞生长因子13的抗体、拮抗剂及激动剂

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