CN104450684A - 一种磁珠法提取细菌中核酸的试剂盒及提取方法 - Google Patents

Abstract

一种磁珠法提取细菌中核酸的试剂盒及提取方法，包含组分为细菌裂解液、磁珠结合液、磁珠洗涤液和核酸洗脱液。所述细菌裂解液含有十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷和氯化钠；所述磁珠结合液含有聚乙二醇-8000和氯化钠；所述磁珠洗涤液含有乙醇；所述核酸洗脱液含有羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸；本发明的试剂盒中含有独特的细菌裂解液，对各种细菌均有较强的裂解作用；该试剂盒可以用于手工提取，也可以结合现在市售的核酸提取仪进行仪器提取，均能提取出纯度和浓度较高的细菌核酸。

Description

一种磁珠法提取细菌中核酸的试剂盒及提取方法

技术领域

本发明涉及核酸提取的生物技术领域，特别是一种基于磁珠法提取细菌中核酸的试剂盒。本发明还涉及使用磁珠法提取细菌中核酸的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术自80年代面世以来，越来越多的应用于分子生物学领域，核酸的分子生物学技术是进行病原微生物检测，构建基因库，物种起源、多样性评估及其亲缘关系、***进化等常用研究手段之一。但核酸的提取是PCR技术应用的前提，且能否提取出高质量的核酸分子是许多核酸分子生物学试验中的关键，提取方法的灵敏度、特异性也将直接关系到后续试验的成败。碱裂解提取法到柱纯化等提取技术，目前广泛地用于细菌的DNA和RNA的提取，但这些方法还是存在诸多缺点，如耗时长、效率低，并且由于采用苯酚等毒性有机溶剂，操作有一定的风险性。

相比上述核酸提取技术，磁性分离法是一种简单有效的核酸提纯方法。该方法使用的磁珠表面连接了可特异地与DNA发生作用的功能基团，具有可逆吸附DNA的特性。磁珠法提纯核酸最大的优点是自动化，以及提供的试剂可用于磁性工具，该种方法不需要任何有机溶剂，也不需要反复离心，真空过滤或柱分离等步骤，仅仅是以核酸结合磁粉为基础，大大减少了试验对工作人员的危害，以及降低了对试验设备的特殊要求。磁珠法所用试剂种类与浓度等参数的选择决定了提取核酸的质量与效率，也与成本密切相关，因此不断探索更为便捷和高效的提取工具和提取方法，对核酸提取相关的基因工程的各项研究具有重大的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的细菌核酸快速提取的试剂盒及提取核酸的方法，该试剂盒具有操作简单快速、使用安全、提取效率高、制造成本低的特点。应用该试剂盒及方法，可以对用于PCR技术检测的生物学中的多种细菌中的核酸实现快速提取。

本发明的技术方案为：

一种磁珠法提取细菌中核酸的试剂盒，包含组分为：细菌裂解液、磁珠结合液、磁珠洗涤液和核酸洗脱液。所述细菌裂解液含有十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷和氯化钠；所述磁珠结合液含有聚乙二醇-8000和氯化钠；所述磁珠洗涤液含有乙醇；所述核酸洗脱液含有羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸；

优选的，所述磁珠结合液中，聚乙二醇-8000的浓度为20-30mmol/L，氯化钠的浓度为3mol/L；

优选的，所述磁珠洗涤液中，乙醇的体积比浓度为70％-90％；

优选的，所述核酸洗脱液中，三羟甲基氨基甲烷的浓度为为5-15mmol/L，所述乙二胺四乙酸的浓度为1.30-1.50mmol/L；

进一步优选的，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为10mmol/L，所述乙二胺四乙酸的浓度为1.35mmol/L；

优选的，在所述细菌裂解液中，十二烷基硫酸钠的浓度为40-60mmol/L，所述乙二胺四乙酸的浓度为20-40mmol/L，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为90-115mmol/L，所述氯化钠的浓度为480-520mmol/L，余量为无菌水；所述细菌裂解液通过加入氢氧化钠调节pH值至7.5-8.5。

一种磁珠法提取细菌中核酸的提取方法，包括以下步骤：

步骤1：将细菌及培养液混合物离心分离，去上清除去细胞培养液，留下细菌菌体；离心分离的转速为13000r/min，离心分离的时间为2分钟；

步骤2：向菌体中加入细菌裂解液，混匀；

步骤3：加入磁珠及磁珠结合液，磁铁吸附去上清；

步骤4：加入磁珠洗涤液，使用磁铁吸附磁珠，去上清；

步骤5：加入核酸洗脱液，使用磁铁吸附磁珠，转移洗脱液，得到细菌的核酸溶液。

优选的，上述步骤2中加入的细菌裂解液的体积与细菌培养液的体积比为1:1-1:5，步骤3中加入的磁珠与磁珠结合液与细菌裂解液的体积比为1:10-1:20，步骤4中磁珠洗涤液与细菌裂解液的体积比为1:0.1-1:0.5，步骤5中核酸洗脱液与细菌裂解液的体积比为1：10-1:20。

一种磁珠法提取细菌中核酸的提取方法，包括以下步骤：

步骤1：将细菌及培养液混合物离心分离，去上清除去细胞培养液，留下细菌菌体；离心分离的转速为13000r/min，离心分离的时间为2分钟；

步骤2：向菌体中加入细菌裂解液，混匀后，转移至96孔反应板的1排和7排；在2排和8排加入磁珠及磁珠结合液；在3排、4排、5排和9排、10排、11排加入磁珠洗涤液；在6排和12排加入核酸洗脱液；

步骤3：将注入试剂的96孔反应板放入核酸提取仪，自动运行结束后得到细菌核酸洗脱液。

优选的，上述步骤2中注入96孔反应板的细菌裂解液的体积为200-300μL，与200-400μL无水乙醇混匀；注入的磁珠及磁珠结合液的体积为50-150μL，与300-400μL双蒸水混匀；注入的磁珠洗涤液的体积为500-700μL；注入的核酸洗脱液的体积为50-300μL。

本发明技术方案具有以下优点：

1.本发明的试剂盒中含有独特的细菌裂解液，对各种细菌均有较强的裂解作用；

2.本发明提供了手动和自动两种方法，利用试剂盒可以进行手工提取，也可以结合现在市售的核酸提取仪进行仪器提取，均能提取出纯度和浓度较高的细菌核酸；使用仪器提取过程为一步自动完成，整个提取过程无须再次打开仪器进行二次操作；

3.使用本发明试剂盒提取核算过程中无需加热，与传统试剂盒相比操作更加简便；

4.本发明使用较少的步骤，减少管间的交叉污染和对环境的污染，核酸提取过程中不使用有毒试剂和有机溶剂，大大减少了对实验人员的身体伤害。

附图说明

图1为本发明方法提取核酸时使用的96深孔反应板的立体图；

图2为按照本发明方法向96深孔反应板各排中注入试剂的示意图。

具体实施方式

以下结合附图通过实施例对本发明做进一步说明，以便更好地理解本发明。

实施例1：

1.细菌中核酸提取试剂盒及其试剂的配制方法：

①细菌裂解液的配制：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为55mmoL/L的十二烷基硫酸钠、加入浓度为25mmol/L的乙二胺四乙酸、加入浓度为100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、加入浓度为500mmol/L的氯化钠，加入无菌水至所需体积，使用氢氧化钠调节pH值使所述细菌裂解液的pH值为8.0，高压蒸汽灭菌10分钟。

②磁珠结合液的配制：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为25mmol/L的聚乙二醇-8000，浓度为3mol/L的氯化钠，加入无菌水至所需体积，高压蒸汽灭菌10分钟。

③磁珠洗涤液的配制：100％乙醇。

④核酸洗脱液的配制：先在容量瓶中加入少量无菌水，加入浓度为10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，加入浓度为13.7mmol/L的乙二胺四乙酸，加入无菌水至所需体积，高压蒸汽灭菌10分钟。

2.试剂盒的应用：

试剂盒的应用对象为培养16个小时的大肠杆菌。应用的具体操作为：培养大肠杆菌，配置大肠杆菌培养液，称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加水定容至1L，高压蒸汽灭菌10分钟，安全柜内接种对数生长期的大肠杆菌，接种后摇床37摄氏度摇晃16小时；取大肠杆菌菌液1ml加入至EP管中，13000r/min离心2分钟后，弃去上清液，加入细菌裂解液1ml，混匀；5分钟后加入磁珠10ug/ml的磁珠50μL，加入磁珠结合液50μL，混匀；5分钟后磁铁吸附磁珠，弃去上清液；加入磁珠洗涤液500μL，混匀后，磁铁吸附磁珠，弃去上清液，洗涤3次；加入核酸洗脱液100μL，混匀；5分钟后磁铁吸附磁珠，将洗脱液转移至新的EP管中，得到可用于PCR扩增的DNA溶液。

对比的传统方法为：取培养16小时的大肠杆菌菌液2mL，5000r/min离心3min后弃上清；加生理盐水0.1mL，混匀后加入100μL5mol/L蛋白酶K充分震荡10min，加氯仿/异戊醇(24:1)200μL震荡30s，10000r/min离心5min，取上清100μL；加异丙醇60μL轻轻混匀，10000r/min离心5min，弃上清；加冷无水乙醇1mL，10000r/min离心5min，弃无水乙醇(轻轻倒出，并倒置于滤纸上吸净乙醇)，真空干燥后加30μL无菌超纯水混匀溶解。

3.对试剂盒应用的效果检测盒评价：

One-Drop OD-1000分光光度计检测核酸浓度及纯度对上述洗脱液进行检测，结果是，采用发明中的试剂盒提取培养16个小时的大肠杆菌的核酸的浓度和纯度均较高，说明本发明提供的试剂盒能有效的提取细菌中的核酸。

另外，本发明试剂盒提取出的细菌核酸，在不经过PCR的情况下，琼脂糖凝胶电泳显示出明显的DNA条带和RNA条带，核酸浓度的平均值为220ng/μL，OD260/OD280平均值为1.78。说明本发明的试剂盒不仅操作简单且有更高的提取效率。

对比的传统方法使用氯仿等有机溶剂，对人的身体伤害大，与实施例1的磁珠法相比，提取细菌核酸的效率低，相同体积的菌液提取的核酸的浓度和纯度都偏低，且耗时较长，还需使用多次离心。

实施例2：

1.细菌中核酸提取试剂盒及其试剂的配制方法：同实施例1。

2.试剂盒的应用：

细菌培养同实施例1；

取大肠杆菌菌液1ml加入至EP管中，13000r/min离心2分钟后，弃去上清液，加入细菌裂解液300μL，混匀；将上述液体加入96深孔反应板的1排、7排，并加入300μL乙醇；将磁珠100μL、磁珠结合液100μL、双蒸水400μL加入至96深孔反应板的2排、8排；将磁珠洗涤液600μL加入至96深孔反应板的3-5排、9-11排；将核酸洗脱液100μL加入至96深孔反应板6排、12排；将96深孔反应板放至核酸提取仪中，设置裂解时间5分钟，结合时间5分钟，洗涤时间2分钟，洗脱时间5分钟，运行核酸提取仪；将洗脱液孔(6排、12排)内的液体转移至新的EP管中，得到可用于PCR扩增的DNA溶液。使用One-Drop OD-1000分光光度计检测核酸浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳检测核酸提取效果。

对比的现有技术磁珠法一般为：取大肠杆菌菌液1ml加入至EP管中，13000r/min离心2分钟后，弃上清，加入细菌裂解液200μl，混匀；将上述液体加入96深孔反应板的1排、7排，将96深孔板放入仪器内，裂解一段时间后，将仪器打开，将96深孔板取出，然后再向1排、7排中加入磁珠及磁珠结合液，2-5排、8-11排加入四种洗涤液，6排、12排加入洗脱液，将96深孔反应板放入核酸提取仪中，运行核酸提取仪，自动运行的提取仪在洗脱过程中需要加热；结束后，将洗脱液孔6排、12排内的液体转移至新的EP管中，得到可用于PCR扩增的DNA溶液。

3.对试剂盒应用的效果检测盒评价：

One-Drop OD-1000分光光度计检测核酸浓度及纯度对上述洗脱液进行检测，结果是，采用发明中的试剂盒提取培养16个小时的大肠杆菌的核酸的浓度和纯度均较高，说明本发明提供的试剂盒能有效的应用核酸提取仪提取细菌中的核酸。

与现有技术磁珠法提取核酸的试剂盒相比，本实施例的试剂盒在洗脱时不需加热；整个提取过程无需取出96孔板，放入96孔板后即可一步自动完成。

应理解，上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于供本领域技术人员了解本发明的内容并据以实施，并非具体实施方式的穷举，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种磁珠法提取细菌中核酸的试剂盒，所述试剂盒中的试剂含有以下组分：细菌裂解液、磁珠结合液、磁珠洗涤液和核酸洗脱液，其特征在于：

所述细菌裂解液含有以下组分：十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷和氯化钠；

所述磁珠结合液含有以下组分：聚乙二醇-8000和氯化钠；

所述磁珠洗涤液含有以下组分：乙醇；

所述核酸洗脱液含有以下组分：三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸。

2.根据权利要求1所述的磁珠法提取细菌中核酸的试剂盒，其特征在于：在所述磁珠结合液中，聚乙二醇-8000的浓度为20-30mmol/L，氯化钠的浓度为3mol/L。

3.根据权利要求1所述的磁珠法提取细菌中核酸的试剂盒，其特征在于：在所述磁珠洗涤液中，乙醇的体积比浓度为70％-90％。

4.根据权利要求1所述的磁珠法提取细菌中核酸的试剂盒，其特征在于：在所述核酸洗脱液中，三羟甲基氨基甲烷的浓度为5-15mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为1.30-1.50mmol/L。

5.根据权利要求4所述的磁珠法提取细菌中核酸的试剂盒，其特征在于：所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为10mmol/L，所述乙二胺四乙酸的浓度为1.35mmol/L。

6.根据权利要求1至5任一项所述的磁珠法提取细菌中核酸的试剂盒，其特征在于：所述十二烷基硫酸钠的浓度为40-60mmol/L，所述乙二胺四乙酸的浓度为20-40mmol/L，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为90-115mmol/L，所述氯化钠的浓度为480-520mmol/L，余量为无菌水；所述细菌裂解液通过加入氢氧化钠调节pH值至7.5-8.5。

7.一种磁珠法提取细菌中核酸的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1：将细菌及培养液混合物离心分离，去上清除去细胞培养液，留下细菌菌体；离心分离的转速为13000r/min，离心分离的时间为2min；

步骤2：向菌体中加入细菌裂解液，混匀；

步骤3：加入磁珠及磁珠结合液，磁珠与核酸结合后，磁铁吸附磁珠去上清；

步骤4：加入磁珠洗涤液，使用磁铁吸附磁珠，去上清；

步骤5：加入核酸洗脱液，使用磁铁吸附磁珠，转移洗脱液，得到细菌的核酸溶液。

8.根据权利要求7所述的磁珠法提取细菌中核酸的提取方法，其特征在于：步骤2中加入的细菌裂解液的体积与细菌培养液的体积比为1:1-1:5，步骤3中加入的磁珠与磁珠结合液与细菌裂解液的体积比为1:10-1:20，步骤4中磁珠洗涤液与细菌裂解液的体积比为1:0.1-1:0.5，步骤5中核酸洗脱液与细菌裂解液的体积比为1：10-1:20。

9.一种磁珠法提取细菌中核酸的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1：将细菌及培养液混合物离心分离，去上清除去细胞培养液，留下细菌菌体；离心分离的转速为13000r/min，离心分离的时间为2min；

步骤2：向菌体中加入细菌裂解液，混匀后，转移至96孔反应板的1排和7排；在2排和8排加入磁珠及磁珠结合液；在3排、4排、5排和9排、10排、11排加入磁珠洗涤液；在6排和12排加入核酸洗脱液；

步骤3：将注入试剂的96孔反应板放入核酸提取仪，自动运行结束后得到细菌核酸洗脱液。

10.根据权利要求9所述的磁珠法提取细菌中核酸的提取方法，其特征在于：步骤2中注入96孔反应板的细菌裂解液的体积为200-300μL，与200-400μL无水乙醇混匀；注入的磁珠及磁珠结合液的体积为50-150μL，与300-400μL双蒸水混匀；注入的磁珠洗涤液的体积为500-700μL；注入的核酸洗脱液的体积为50-300μL。