CN104450608B - 促人类间质干细胞增生的佐剂、扩增人类间质干细胞方法、医药组合物、生长因子及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明关于一种人类间质干细胞体外快速增生佐剂，用以解决习知人类间质干细胞培养时细胞扩增效率不佳的问题。本发明的人类间质干细胞培养添加佐剂包括至少一种抗氧化剂、一第二型纤维母细胞生长因子（FGF‑2）。借此，将前述佐剂加入包含人类间质干细胞的培养基中，于常氧环境（约21%氧分压）培养后，出现细胞快速***、细胞周期合成期（S phase）比例提高、减少老化及提高分化潜能等现象，使本发明不仅可快速地扩增人类间质干细胞并获取生长因子，且仍可保有干细胞多功能性的特征，作为人类间质干细胞的培养及扩增的用途。

Description

促人类间质干细胞增生的佐剂、扩增人类间质干细胞方法、医 药组合物、生长因子及其用途

技术领域

本发明有关于一种人类间质干细胞体外快速增生佐剂，尤指一种包含抗氧化剂与生长因子的佐剂以添加于人类间质干细胞的培养基中，用以使人类间质干细胞于初代或继代培养可快速增生并获取生长因子。

背景技术

按，目前科学界对于干细胞下了一些基本定义与具有特性为：指一群具有细胞自我更新（Self-renewal）、增生（Proliferation）能力，同时能长期维持在未分化（Undifferentiation）状态的细胞，并且在受到适当诱导刺激后可以分化成不同世系的细胞群及特定功能的组织的多重分化（multi-differentation）特性。

依据干细胞来源及其分化潜能的不同，可以将其分类为：

1、全能性干细胞 （Totipotent stem cell）：其具有可发展成完整独立生物体的能力，如受精卵（Zygote）或胚胎发育到约八细胞时期的细胞群。

2、多功能性干细胞（Pluripotent stem cell）：受精卵（Zygote）受精约4天后，全功能性干细胞开始分化进入囊胚体期，囊胚体可分为两部分：外滋养层细胞（outer layerof cells）与内细胞团（inner cell mass），在胚胎发育过程中，外滋养层细胞会形成胎盘与胎儿依附在子宫中所需的支持组织，而内细胞团则会形成外胚层、中胚层与内胚层，各个胚层再往下分化成各种不同的***与器官。虽然内细胞团有形成人体各部份的能力，但若单独将内细胞团放入人类成***性健康的子宫内，因为缺乏外滋养层细胞，无法形成胎盘及胎儿生长所需的外在支持***与环境，所以无法发展成一完整个体，故其多功能性仍存有部分限制的。

3、多潜能性干细胞（Multipotent stem cell）：是目前研究最多的干细胞，自上述多功能性干细胞再往下分化，可特化成特定组织的干细胞，如造血干细胞（hematopoieticstem cell）、间叶干细胞（mesenchymal stem cells）等，其中，造血干细胞来自于周边血、脐带血、骨髓等，可分化为各种血球及淋巴，而间叶干细胞可来自于脂肪、骨膜（periosteum）、关节膜 （synovial membrane）、骨髓及某些脏器的间质组织（mesenchymaltissue），如胎盘

4、专一/单一型干细胞（Unipotent stem cell）：泛指有能力分化成特定的某一种组织的干细胞或称之为前驱细胞（progenitor cell），这类的细胞普遍存在于各部分的组织，是最容易被发现的干细胞，如肝前驱细胞、神经前驱细胞等。

间叶干细胞首度在学术上被定义为可形成聚落单元的纤微母细胞（colony-forming unit of fibroblast- CFU-Fs）。在培养的过程中，会单层贴附在塑料培养皿表面，形态类似纤微母细胞，呈现纺锤状，在体外会快速增生形成聚落，并保有分化为骨母细胞（osteoblast）、脂肪细胞（adipocyte）、软骨细胞（chondrocyte）的潜能。近年来也有研究指出可分化为肝细胞、心肌细胞、神经细胞、胰岛细胞等（Minguell et al., 2001）。

间叶干细胞的来源可自人体许多不同组织分离出来，例如由手术直接切除或经由抽脂手术取得的脂肪组织即为一干细胞丰富的来源，可分离出脂肪干细胞（Adiposetissue-derived stem cells, ADSCs），其具有的优点有：取得方式侵入性低，对人体伤害小、且一次取得的量较多、可于体外增生培养等；加上脂肪干细胞亦拥有可分化成硬骨、软骨、肌肉以及脂肪细胞的潜力（Zuk et al., 2002），因此，脂肪干细胞被认为是最具研究发展潜力的干细胞之一。

干细胞的研究与应用，无论在基础医学研究上或是临床治疗上，都需要足够的细胞数，且须培养在一适当的的环境下，包含合适的微环境、生长因子等刺激，以避免干细胞在培养、增生过程中提前老化、失去活性或是分化成其他细胞。然而，由于细胞分离技术、生长培养基以及培养条件的差异导致干细胞于增生与分化能力上有显著不同（Pittenger etal.,2008）。此外，许多文献报导皆一致注意到间质干细胞在培养增生过程中的老化倾向问题（Bonab et al., 2006；Shibata et al., 2007；Wagner et al., 2008）。因此，干细胞增生过程中所遇到细胞性能和老化上的差异，亟可能阻碍了间质干细胞的临床用途。因此，如何能有效且快速的将取得不易的干细胞培养并放大数目，同时又能保持未分化状态与减少老化的现象，且仍具有多功能性特色，一直是科学家们所极力追求的。

而近年来，研究报导亦指出，培养过骨髓间质干细胞（BMMSC）的条件培养基中，被发现有大量可促使伤口愈合的旁分泌因子存在，例如：血管内皮生长因子（VEGF）、类胰岛素生长因子1（IGF-I）、表皮生长因子（EGF）、角质细胞生长因子（KGF）、血管生成素（angiopoietin-1）、基质衍生因子（stromal-derived factor-1）、巨噬细胞发炎性蛋白（macrophage inflammatory protein-1α、macrophage inflammatory protein-1 β）、和***（erythropoietin）等（Martin et al., 1997）。而脂肪间质干细胞（ADSC）已经被证实与骨髓间质干细胞、脐带血间质干细胞、骨膜间质干细胞、滑膜间质干细胞及肌肉间质干细胞在基因表现及表型上，并无显著差异（Sheehy et al., 2012；Hung et al.,2012；Hung et al., 2007）。鉴于脂肪间质干细胞相较于骨髓间质干细胞具有更佳的分离及体外增生条件，目前大有希望应用于伤口修复与再生。目前已知，在条件培养基中，脂肪间质干细胞分泌了以下生长因子，如：第二型纤维细胞生长因子（bFGF）、角质细胞 （KGF）、转型生长因子（TGF-β）、肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）等，而这些生长因子都可能与伤口愈合有关。因此如何使间质干细胞快速增生并产生大量生长因子，实为一值得努力研究的课题。

有如中国台湾专利201331366号一种“体外无血清成体干细胞放大培养技术”，提供一种体外无血清成体干细胞放大培养的方法，其方法利用添加自体生长因子（PRGF）于无血清干细胞培养液中进行人类成体干细胞的初代培养及继代培养，以此方法所培养的人类成体干细胞经过多次的继代培养后，人类成体干细胞仍保持在实质未分化的状态。惟，经其培养方法所获得的干细胞数目在继代培养至第三代（P3）前才达到约55,000细胞数/每平方公分，若要获取更多的干细胞数量，可能得提高培养天数以及继代培养的代数来满足需求，相对的，也必须承担多次继代培养可能受到污染的风险。

又有如中国台湾专利201118172号一种“低密度合并低氧培养扩增间质干细胞的方法”，该方法可在不影响细胞增殖和干细胞特性的下快速和有效率地扩增人类间质干细胞，包括于体外或体内增加增殖、减少老化及增加分化潜力。惟由于大部分研究单位用来培养细胞的培养箱多为仅提供二氧化碳分压以及湿度调整功能，若需于低氧环境下培养，则需零型购置具氧分压调整功能的培养箱；对于研究经费不甚充足的研究单位实为一大负担。

另如中国台湾专利201231087号”一种含有多种生长因子的保养品制程”，首先取出健康脂肪；再将一预定容量的溶剂混入脂肪组织，以对脂肪组织进行清洗；按预定剂量的试剂加入预定容量的脂肪组织，并进行离心分离；经分离后产生的脂肪组织则混入预定剂量的酵素于一离心管，并对该离心管进行震荡；将产生的沉淀物进行细胞培养以产生体细胞；及取得该体细胞后，透过培养上述方式所取得的细胞培养液富含细胞分泌的生长因子（如：VEGF、HGF、b-FGF、TGF、IGF），以完成高效保养品原料。惟其揭示的培养方法是将体细胞置入一包含百分之10胎牛血清（10%FBS）的基础培养基DMEM （Dulbecco`s Modified EagleMedium）中培养，该体细胞增生速度慢，其所分泌的生长因子相对较少，若要获取大量的生长因子，就必须提高培养天数以及继代培养的代数来达成，因此，也具有因多次继代培养可能受到污染的风险存在。

综合上述，为了使体外人类间质干细胞可快速增生，并仍可保有干细胞多功能性的特征，且同时可大量获取人类间质干细胞分泌的生长因子，我们亟需要一人类间质干细胞培养佐剂以及培养方法，以快速又有效率地扩增细胞数目并获取大量生长因子。

发明内容

本发明人有鉴于现有对于人类间质干细胞培养以扩增细胞数目及获取人类间质干细胞分泌的生长因子的缺失再予以研究，提供一种人类间质干细胞体外快速增生佐剂及其培养方法与一种体外快速扩增人类间质干细胞以获取生长因子的方法及其用途，以期达到更快速和有效率地扩增人类间质干细胞并获取生长因子的目的。

为达上述目的，本发明的解决方案是：

本发明提供一种人类间质干细胞体外快速增生佐剂，其包括至少一种抗氧化剂以及一第二型纤维母细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor, FGF-2）。

进一步，前述人类间质干细胞体选自：脂肪间质干细胞、骨髓间质干细胞或脐带间质干细胞所构成群组之一。

进一步，前述抗氧化剂包括一长效型抗坏血酸衍生物（Long-acting ascorbicacid derivative） 及一N-乙酰基-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine, NAC）的组合。

进一步，前述长效型抗坏血酸衍生物为一左旋抗坏血酸-2-磷酸盐（L-ascorbicacid-2 -phosphate, AsA2P）。

进一步，前述第二型纤维母细胞生长因子使用浓度为1毫微克/毫升（ng/mL）至20毫微克/毫升（ng/mL）。

进一步，其借由抑制前述人类间质干细胞的细胞内细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物：p21及p27蛋白的表现以提高细胞周期蛋白依赖性激酶-2（CDK-2）、细胞周期蛋白依赖性激酶-4（CDK-4）及细胞***周期蛋白（CDC2）的表现。

本发明提供一种体外快速扩增人类间质干细胞的方法，包括将前述的佐剂加入一包含人类间质干细胞的培养基中，以扩增人类间质干细胞，并获取实质未分化的一人类间质干细胞。

本发明再提供一种体外快速扩增人类间质干细胞的方法，包括将前述的佐剂加入包含一血清添加物及一人类间质干细胞的一培养基中，以扩增前述人类间质干细胞，并获取实质未分化的一人类间质干细胞。

进一步，前述血清添加物为人类血清或胎牛血清，所使用的体积百分浓度为百分之2至百分之10。

进一步，前述体外快速扩增人类间质干细胞的方法更包括一冷冻保存前述扩增的人类间质干细胞步骤，用于更进一步的使用。

进一步，利用前述方法所冷冻保存的扩增的人类间质干细胞以建立一细胞库。

进一步，前述体外快速扩增人类间质干细胞的方法包括执行一萃取步骤以获得一人类间质干细胞的细胞萃取物。

进一步，前述体外快速扩增人类间质干细胞的方法更包括执行一诱导分化步骤，以获取一自前述人类间质干细胞所分化的细胞。

进一步，前述自人类间质干细胞所分化的细胞，包括骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞之一。

本发明另提供一种医药组合物，其包含由前述体外快速扩增人类间质干细胞的方法所获取实质未分化的一人类间质干细胞或一自前述人类间质干细胞所分化的细胞。

进一步，前述医药组合物结合一生物兼容性材料以应用于再生医学或组织工程。

本发明再提供一种体外快速扩增人类间质干细胞以获取生长因子的方法，经前述体外快速扩增人类间质干细胞的方法培养后，以于前述培养基中获取一生长因子。

进一步，前述生长因子包括：FGF-2、EGF、FGF-4、FGF-6、FGF-7、HB-EGF、HGF、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFPB-4、IGFBP-6、IGF-I、IGF-I SR、IGF-II、M-CSF、M-CSF R、PDGF Rα、PDGF-Rβ、PDAF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、TGF-β3、VEGF、VEGF R2。

本发明提供一种生长因子，根据前述体外快速扩增人类间质干细胞以获取生长因子的方法所获得。

本发明提供一种医药组合物，包含有前述体外快速扩增人类间质干细胞以获取生长因子的方法所获得的生长因子。

本发明提供一种包含有如前述生长因子在制备促伤口愈合的药物的用途。

本发明提供一种包含有如前述生长因子作为皮肤保养品的用途。

本发明的功效在于：

一、细胞快速增生：借由添加本发明的人类间质干细胞体外快速增生佐剂于培养基中，使人类间质干细胞体在初代或继代培养时出现细胞周期合成期（S phase）比例提高，而促使细胞快速***增生的现象，且仍可保有干细胞多功能性分化的潜能。

二、减少细胞老化：借由添加本发明的人类间质干细胞体外快速增生佐剂于培养基中，可使前述人类间质干细胞体中端粒酶反转录酵素（Telomerase ReverseTranscriptase, TERT）提高，可以延长细胞端粒（Telomere）缩短的时间，以减缓细胞老化并延长细胞的寿命。

三、快速获取大量生长因子：借由添加本发明的人类间质干细胞体外快速增生佐剂于培养基中，可较习知培养于一包含体积百分浓度为百分之10%胎牛血清的培养基中，获取至少2至3倍以上的生长因子[如类胰岛素生长因子-1（IGF-1）、肝细胞生长因子（HGF）及表皮生长因子（EGF）]含量。

四、降低病源污染：本发明的人类间质干细胞体外快速增生佐剂于搭配人类血清进行培养时，可避免因使用异体或异种的血清进行培养而存在有异体或异种间的病源交互污染的风险。

附图说明

图1A-图1C为本发明中人类间质干细胞于不同培养条件下的天数与细胞密度关系图；

图2A为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养后对细胞周期的影响分析图；

图2B说明本发明中脂肪干细胞经不同条件培养后，对于负责调控细胞周期的蛋白的表现影响；

图3为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养后，对于细胞相对端粒长度的影响；

图4为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养后，培养天数与细胞总数的关系图；

图4B为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养后，对于负责调控细胞周期的蛋白的表现影响；

图5A为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养后，细胞数量与型态示意图；

图5B-图5D为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养后，细胞培养天数与细胞数量关系图；

图6A为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养后，其细胞表面抗原分析结果图；

图6B为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养后，其干细胞基因相对表现分析图；

图7A-图7B为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养并诱导分化为硬骨细胞后，经化学染色结果图；

图7C为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养并诱导分化为硬骨细胞后，其硬骨细胞分子标志相对表现分析图；

图8A为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养并诱导分化为软骨细胞后，经化学染色结果图；

图8B为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养并诱导分化为软骨细胞后，其软骨细胞分子标志相对表现分析图；

图8C为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养并诱导分化为脂肪细胞后，经化学染色结果图；

图8D为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养并诱导分化为脂肪细胞后，其脂肪细胞分子标志相对表现分析图；

图9A为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养后，细胞因子数组分析图；

图9B为本发明中图9A的细胞因子数组分析结果比较图；

图9C-图9D为图9B中细胞因子的相对表现量化分析图；

图9E为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养后，其细胞中细胞因子的相对表现分析图；

图9F为本发明中脂肪干细胞经不同条件培养后，细胞因子数组分析图；

图9G为本发明中图9F的细胞因子数组分析结果比较图；

图10A为本发明中脂肪间质干细胞培养于一微载体的光学显微镜影像图；

图10B为本发明中图10A的荧光影像图。

具体实施方式

为了让本发明的上述和其他目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图示，作详细说明如下：

本发明提供一种人类间质干细胞体外快速增生佐剂，其包括至少一种抗氧化剂以及一第二型纤维母细胞生长因子（FGF-2）；其中前述抗氧化剂包括一长效型抗坏血酸衍生物及一N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）的组合。较佳的是，该长效型抗坏血酸衍生物为一L-抗坏血酸-2-磷酸盐（Asc 2-P），而第二型纤维母细胞生长因子使用浓度为1至20毫微克/毫升。

较佳的是，前述人类间质干细胞体选自：脂肪间质干细胞、骨髓间质干细胞或脐带间质干细胞所构成群组之一。

较佳的是，本发明的人类间质干细胞体外快速增生佐剂借由抑制前述人类间质干细胞的细胞内细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物：p21及p27蛋白的表现以提高细胞周期蛋白依赖性激酶-2（CDK-2）、细胞周期蛋白依赖性激酶-4（CDK-4）及细胞***周期蛋白（CDC2）的表现，进而促进细胞周期进入合成期（S phase）的比例提高，从而使细胞快速***增生。

本发明同时提供一种体外快速扩增人类间质干细胞的方法，包括将前述的佐剂加入一包含人类间质干细胞的培养基中进行培养，以扩增人类间质干细胞，并获取实质未分化的一人类间质干细胞。

本发明再提供一种体外快速扩增人类间质干细胞的方法，包括将前述的佐剂加入包含一血清添加物及一人类间质干细胞的一培养基中，以扩增前述人类间质干细胞，并获取实质未分化的一人类间质干细胞。

较佳的是，前述血清添加物为人类血清或胎牛血清，所使用的体积百分浓度为百分之2至百分之10。

较佳的是，前述体外快速扩增人类间质干细胞的方法进一步包括执行一萃取步骤以获得一人类间质干细胞的细胞萃取物。

较佳的是，前述体外快速扩增人类间质干细胞的方法更包括一冷冻保存前述扩增的人类间质干细胞步骤，用于更进一步的使用。

较佳的是，此处所使用的“冷冻保存”一词通常是指将细胞加入冷冻保护剂如二甲亚砜（DMSO）或是甘油后冷却至零下的温度保存的方法，例如为负80℃或是负196℃（液态氮的沸点）。冷冻保存可如熟知此技艺的人士所进行的方法与流程，惟非本发明诉求重点因此不予赘述 （参阅1997年HummaPress公司所出版第2版Pollard，J.W.与Walker，J.M.．所著基础细胞培养流程；2000年Wiley-Liss公司所出版第4版Freshney, R.I.，所著动物细胞的培养）。

本发明提供一种细胞库，其包含由前述体外快速扩增人类间质干细胞的方法所冷冻保存的扩增的人类间质干细胞。

较佳的是，前述体外快速扩增人类间质干细胞的方法更包括执行一诱导分化步骤，以获取一自前述人类间质干细胞所分化的细胞。

较佳的是，前述自人类间质干细胞所分化的细胞，包括骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞之一。

本发明再提供一种医药组合物，其包含由前述体外快速扩增人类间质干细胞的方法所获取实质未分化的一人类间质干细胞或一自前述人类间质干细胞所分化的细胞。

较佳的是，该医药组合物包含前述人类间质干细胞、自其所分化的细胞、细胞分泌物或是细胞萃取物之一或其组合与合适的治疗上可接受的一载体/赋形剂。其中，细胞分泌物在一些实施例中可于细胞培养基中纯化及浓缩后取得。

进一步，前述医药组合物结合一生物兼容性材料以应用于再生医学或组织工程。

本发明再提供一种体外快速扩增人类间质干细胞以获取生长因子的方法，经由前述体外快速扩增人类间质干细胞的方法培养后，细胞在快速增生的同时，亦分泌多种细胞生长因子于培养基中，借此可于前述培养基中获取前述生长因子。其中，前述生长因子包括：FGF-2、EGF、FGF-4、FGF-6、FGF-7、HB-EGF、HGF、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFPB-4、IGFBP-6、IGF-I、IGF-I SR、IGF-II、M-CSF、M-CSF R、PDGF Rα、PDGF-Rβ、PDAF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、TGF-β3、VEGF、VEGF R2。

本发明提供一种生长因子，根据前述体外快速扩增人类间质干细胞以获取生长因子的方法所获得。

本发明提供一种一种医药组合物，包含有前述体外快速扩增人类间质干细胞以获取生长因子的方法所获得生长因子，可用于但不限定治疗皮肤创伤。

本发明提供一种包含有如前述生长因子在制备促伤口愈合的药物的用途。

本发明提供一种包含有前述生长因子的皮肤保养品，用以修复皮肤晒伤或延缓皮肤细胞老化。

本发明提供一种包含有如前述生长因子作为皮肤保养品的用途。

本发明所称“人类间质干细胞”一词是指任何得自于人类间质组织的细胞且具有无限自行更新的能力并且可分化为多种细胞或是组织形式，例如但不限于脂肪间质干细胞、骨髓间质干细胞或脐带间质干细胞、脐带血间质干细胞、骨膜间质干细胞、滑膜间质干细胞及肌肉间质干细胞所构成群组之一。本发明的实施例以人类脂肪间质干细胞的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。

实验一：本发明的佐剂对于不同人类间质干细胞在常氧及低氧环境下培养对细胞生长的影响。

1.人类间质干细胞的分离及体外培养

本实验由佛教慈济综合医院的内部审查委员会（IRB100-102）批准进行，分别以人类脂肪组织、脐带及骨髓组织为干细胞取得来源，惟此处人类间质干细胞的分离方法为***方公分3000颗细胞（3000 cells/cm²）的细胞密度培养于6孔细胞培养盘中（6-wellplates, Becton Dickinson），且所有细胞皆培养于摄氏37度、百分之5二氧化碳分压及百分之95湿度环境下的培养箱（Forma Series II Model 3110, Thermo），并每3天更换一次培养基；另低氧培养环境的培养实验则是于另一培养箱（MCO-18M, Sanyo）中进行。借此观察7天内不同人类间质干细胞于不同培养条件下，对细胞增生的影响。

1.1 细胞生长密度分析

将各组干细胞以磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗过一次后，以胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（Trypsin-EDTA）溶液于摄氏37度作用5分钟后再以细胞刮勺小心移除未被作用完全的细胞，加入等比例含胎牛血清的培养基中和胰蛋白酶的酵素作用活性。所有细胞数目皆以细胞计算器（Vi-CELL AS, Beckman Coulter）计算。存活的细胞以0.4%台盼蓝（Trypan-blue,GIBCO-Invitrogen）来与死细胞作区别，计算时判定活的间质干细胞的参数设定为：100images, Size 10–30微米, 75%现场亮度, 5% 现场区域。结果的呈现以每组实验数据测量三重复，以平均值±标准偏差表示之。

1.2 实验结果

以上实验数据经微软Excel软件t测试（t-test）统计分析, 以p＜0.05 为显著水平，并将结果量化为统计图。首先，参见图1A，为脂肪干细胞于上述3种不同培养条件下的生长情形，其中基础培养基加上FGF-2于常氧环境培养组与基础培养基加上FGF-2于低氧环境培养组两组比较，发现干细胞在低氧环境下增生较为快速，尤其在第三天时已有显著差异，第四天开始更是明显，如此显示脂肪间质干细胞的增生速度于低氧环境下较常氧环境下来得好；另基础培养基加上FGF-2于低氧环境培养组与基础培养基加上本发明的佐剂于常氧环境培养组两组比较，发现常氧环境下加入本发明的佐剂培养，可以达到与低氧环境下培养相近的增生速度，甚至第五天起，是超越低氧环境下培养的增生速度，由此可知，本发明的佐剂的添加，可使脂肪间质干细胞在常氧环境培养下，达到快速增生的效果。再参图1B及图1C，相同的结果亦可见于骨髓间质干细胞或脐带间质干细胞的培养实验中；借由本实验可知，本发明的佐剂的添加对于脂肪间质干细胞、骨髓间质干细胞或脐带间质干细胞在常氧环境培养下，皆可达到快速增生的效果。

2. 细胞周期分析

将借由上述脂肪间质干细胞培养于不同培养条件下的各实验组，再加上一仅包含10%胎牛血清的基础培养基作为对照组，以流式细胞仪及其软件（Phoenix Flow Systems）侦测分析其细胞周期的变化情形，各组培养三天后取样，每组实验三重复，以酒精固定后，使用碘化丙啶（propidium iodide, Sigma）染剂染细胞的DNA来分析细胞周期的变化。

2.1 实验结果

参图2A，为对照组与上述三组不同培养条件下，对脂肪间质干细胞的细胞周期影响，其中* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.005。由实验结果发现，基础培养基加上FGF-2于低氧环境培养组与基础培养基加上本发明的佐剂于常氧环境培养组等两组，其脂肪间质干细胞处在细胞周期中的合成期（S phase）的百分比相较该对照组与该基础培养基加上FGF-2于常氧环境培养组，明显提高不少，且基础培养基加上FGF-2于低氧环境培养组与基础培养基加上本发明的佐剂于常氧环境培养组等两组的G0/G1期（停止***期/生长期）的百分比较该对照组与该基础培养基加上FGF-2于常氧环境培养组来得低许多，由此可知，于低氧环境下或添加本发明的佐剂于常氧环境下培养，皆能使细胞周期处于合成期，促进细胞DNA不断合成，进而使细胞快速***增生。其中，添加本发明的佐剂于常氧环境下培养的脂肪间质干细胞，其细胞周期处于合成期的百分比更是超出于低氧环境下培养组，具有显著差异；因此，添加本发明的佐剂于常氧环境培养下，不仅能达到快速增生效果，且甚至能超越于低氧环境下培养所能提高细胞增生速度的效果。

3. 以西方点墨法分析调控细胞周期的相关蛋白的表现情形

习知西方点墨法是利用抗体、抗原专一性结合的特性，配合SDS-PAGE胶体电泳来侦测特定蛋白表现的定性与定量分析，惟该方法为广为知悉的技术，其细节在此便不再赘述。本实验针对已被文献报导对于调控细胞周期有关的蛋白，诸如：Cyclin A2、Cyclin D1、Cyclin D3、CDK2、CDK4、CDK6、CDC2、p21及p27等蛋白，利用上述各蛋白与其抗体间的专一性结合，透过上述西方点墨法来分析观察经由不同培养条件培养的脂肪间质干细胞中，其对于调控细胞周期有关的蛋白表现的影响；其中以一β-actin蛋白表现量为对照，作为上述各蛋白表现量化为数据的标准化的基准依据；因为β-actin蛋白是一种管家基因（Housekeeping gene）所转录、转译而出的蛋白质，为细胞维持正常生理现象所必须，且不因各种实验条件而有太大的变化，故适合作为量化数据标准化的基准依据。

3.1 实验结果

续参图2B，为上述图2A四组实验组，其调控细胞周期的相关蛋白表现分析，由图中各蛋白质于不同实验组中的表现情形，发现已被文献报导认为是抑制细胞周期进行的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物：p21及p27蛋白的表现量，相较于上述对照组与基础培养基加上FGF-2于常氧环境培养组，该基础培养基加上FGF-2于低氧环境培养组与该基础培养基加上本发明的佐剂于常氧环境培养组，明显呈减低状态，甚至该基础培养基加上本发明的佐剂于常氧环境培养组，其p21及p27蛋白的表现量呈现相近或低于该基础培养基加上FGF-2于低氧环境培养组的状况；另细胞周期蛋白依赖性激酶-2（CDK-2）、细胞周期蛋白依赖性激酶-4（CDK-4）及细胞***周期蛋白（CDC2）的表现量，相较于上述对照组与基础培养基加上FGF-2于常氧环境培养组，该基础培养基加上FGF-2于低氧环境培养组与该基础培养基加上本发明的佐剂于常氧环境培养组，明显呈提高状态，甚至该基础培养基加上本发明的佐剂于常氧环境培养组，其CDK-2、CDK-4及CDC2蛋白的表现量呈现相近或高于该基础培养基加上FGF-2于低氧环境培养组的状况。由此可知，添加本发明的佐剂于常氧环境下培养脂肪间质干细胞以达到快速增生的效果，借由抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物：p21及p27蛋白的表现，以提高CDK-2、CDK-4及CDC2蛋白的表现量，进而促进细胞快速复制、***，以达快速增生的效果。

4. 细胞相对端粒（Telomere）长度分析

在细胞内，染色体结构是由DNA组织成，而端粒是染色体末端的DNA重复序列，作用是保护染色体的完整性。染色体在细胞***的前会先复制，DNA每次复制，端粒就会缩短一点，当端粒缩短到一定程度时，便无法维持染色体的稳定，细胞最终会走向死亡，所以可以根据端粒的长度来预测细胞的年龄。将包含前述三组不同培养条件以及上述对照组（包含10%胎牛血清的基础培养基）的四组脂肪间质干细胞培养14天后，利用已被文献报导可用来测量细胞相对端粒长度（T/S ratio）的技术方法（Cawthon, 2002），来观察不同培养条件下，对于脂肪间质干细胞的端粒的影响。

4.1 实验结果

参见图3所示，经由上述习知测量细胞相对端粒长度（T/S ratio）的方法，以获得于前述四组实验组培养条件下，其细胞端粒的T/S ratio，其中* P < 0.05。由结果发现，以该对照组为基准时，该基础培养基加上FGF-2于低氧环境培养组与该基础培养基加上本发明的佐剂于常氧环境培养组相较于该基础培养基加上FGF-2于常氧环境培养组较为提高，且具显著差异；由此可知，于低氧环境下培养或添加本发明的佐剂于常氧环境下培养，皆可提高相对端粒长度的比值，进而达到延缓细胞的老化效果。

5. 脂肪间质干细胞于常氧或高氧环境下培养的影响

本实验将培养条件分为四组，其分别为：基础培养基加上FGF-2于常氧环境培养组、基础培养基加上FGF-2于高氧环境培养组、基础培养基加上本发明的佐剂于常氧环境培养组及基础培养基加上本发明的佐剂于高氧环境培养组等，其中高氧环境指约百分之37.5氧分压下，而其它培养条件参数（如基础培养基、培养箱及细胞培养密度）皆与前述实验一的1.内容相同。

5.1 脂肪间质干细胞的细胞生长密度分析

将细胞以磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗过一次后，以胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（Trypsin-EDTA）溶液于摄氏37度作用5分钟后再以细胞刮勺小心移除未被作用完全的细胞，加入等比例含胎牛血清的培养基中和胰蛋白酶的酵素作用活性。所有细胞数目皆以细胞计算器（Vi-CELL AS, Beckman Coulter）计算。存活的细胞以0.4%台盼蓝（Trypan-blue,GIBCO-Invitrogen）来与死细胞作区别，计算时判定活的间质干细胞的参数设定为：100images, Size 10–30微米, 75%现场亮度, 5% 现场区域。结果的呈现以每组实验数据测量三重复，以平均值±标准偏差表示之。

5.1.1 实验结果

参图4A所示，为脂肪间质干细胞于不同培养条件下，培养天数与总细胞数的关系，由结果发现，随着培养天数增加，该基础培养基加上本发明的佐剂于常氧环境培养组的细胞数目自第二天后就急速上升，于第五天已达到1.5×10⁶以上的数量，相较该基础培养基加上FGF-2于常氧环境培养组明显提高且快速；而该基础培养基加上FGF-2于高氧环境培养组织细胞数目则呈现非常缓慢的增加，甚至第七天的细胞总数仍未达2.5×10⁵数量，可知高氧环境对于细胞的增生有着不利的影响；而该基础培养基加上本发明的佐剂于高氧环境培养组织细胞总数于第二天后相较该基础培养基加上FGF-2于高氧环境培养组呈现快速提高的趋势，至第六天时，其细胞总数已达到1.0×10⁶以上的数量，相较该基础培养基加上FGF-2于高氧环境培养组织细胞总数明显提高且快速。由此可知，添加本发明的佐剂于常氧环境下培养可较未添加本发明的佐剂者，其细胞增生速度较为快速且数目多，而该基础培养基加上本发明的佐剂于高氧环境培养组，虽处于高氧环境下培养，对于细胞增生有不利的影响，但本发明的佐剂确实能减缓因高氧环境对细胞增生造成的不利影响，从而使得部分细胞能继续维持增生的现象。

5.2 脂肪间质干细胞于不同培养条件下对p21蛋白及CDK2蛋白表现的影响

脂肪间质干细胞的培养条件同前述5.中所述分为四组，并利用前述西方点墨法来分析观察经由不同培养条件培养的脂肪间质干细胞中，其对于调控细胞周期有关的蛋白（如p21、CDK2）表现的影响，同样以β-actin蛋白表现量为对照，作为上述各蛋白表现量化为数据的标准化的基准依据。

5.2.1 实验结果

参图4B，结果可发现，该基础培养基加上FGF-2于常氧环境培养组与该基础培养基加上本发明的佐剂于常氧环境培养组的p21蛋白表现量有减低的现象，而该CDK2蛋白的表现量有增加的现象；而该基础培养基加上FGF-2于高氧环境培养组则因高氧环境使其p21蛋白表现量明显提高许多，从而抑制掉其CDK2蛋白的表现，对细胞增生产生不利影响；值得注意的是，该基础培养基加上本发明的佐剂于高氧环境培养组，虽处于高氧环境下培养，但由于添加了本发明的佐剂，所以对p21蛋白表现量相较于该基础培养基加上FGF-2于高氧环境培养组已有明显降低的效果，从而使其CDK2蛋白的表现亦明显提高。因此，再次证实添加本发明的佐剂不论于常氧环境下或高氧环境下，皆能较无添加本发明的佐剂者，明显提高间质干细胞的增生速度。

实验二： 脂肪间质干细胞于不同血清添加物培养下对细胞增生的影响

本实验的细胞培养条件分为四组，其分别为：基础培养基加上10%胎牛血清组、基础培养基加上10%人类血清组、基础培养基加上10%人类血清加上本发明的佐剂组及基础培养基加上2%人类血清加上本发明的佐剂组等四组；该基础培养基为IMDM（Iscove`smodified Dulbecco`s medium, GIBCO-Invitrogen）培养基再加入2 毫摩尔浓度（mM）左旋麸酰胺酸（L-glutamine, GIBCO-Invitrogen）所组成，而前述本发明的佐剂包含2 毫摩尔浓度（mM） N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC, Sigma）以及0.2 毫摩尔浓度（mM） 左旋抗坏血酸-2-磷酸盐（AsA2P, Sigma）。每组干细胞以每平方公分3000颗细胞（3000 cells/cm²）的细胞密度培养于6孔细胞培养盘中（6-well plates, Becton Dickinson），且所有细胞皆培养于摄氏37度、百分之5二氧化碳分压及百分之95湿度环境下的培养箱（Forma Series IIModel 3110, Thermo）中，培养一周并每3天更换一次培养基；借此观察7天内不同脂肪间质干细胞于不同培养条件下，对细胞增生的影响。

1. 细胞生长密度分析

将各组干细胞以磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗过一次后，以胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（Trypsin-EDTA）溶液于摄氏37度作用5分钟后再以细胞刮勺小心移除未被作用完全的细胞，加入等比例含胎牛血清的培养基中和胰蛋白酶的酵素作用活性。所有细胞数目皆以细胞计算器（Vi-CELL AS, Beckman Coulter）计算。存活的细胞以0.4%台盼蓝（Trypan-blue,GIBCO-Invitrogen）来与死细胞作区别，计算时判定活的间质干细胞的参数设定为：100images, Size 10–30微米, 百分之75现场亮度, 百分之5现场区域。结果的呈现以每组实验数据测量三重复，以平均值±标准偏差表示之。

1.1 实验结果

以上实验数据经微软Excel软件t测试（t-test）统计分析, 以p＜0.05 为显著水平，并将结果量化为统计图，其中* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.005。首先，参图5A，是脂肪间质干细胞于不同培养条件下，于显微镜下织细胞型态，比例尺为500 微米（μm）。观察中发现，各组织细胞型态颇为类似，皆具有梭状的细胞型态。参见图5B，为该基础培养基加上10%胎牛血清组与该基础培养基加上10%人类血清组的培养天数与细胞密度关系图，自培养后四天起该基础培养基加上10%人类血清组织细胞密度已较该基础培养基加上10%胎牛血清组明显提高约百分之28至百分之74的细胞数目，且具有显著差异；由此得知，以人类血清做为细胞培养时的血清添加物，可较添加胎牛血清更能使脂肪间质干细胞快速增生。参见图5C，为该基础培养基加上10%人类血清组与该基础培养基加上10%人类血清加上本发明的佐剂组的细胞密度比较图，由结果发现，该基础培养基加上10%人类血清加上本发明的佐剂组于培养后一天的细胞密度已较该基础培养基加上10%人类血清组明显提高约百分之155至百分之324的细胞数目，且具有显著差异；由此得知，于添加本发明的佐剂培养下，更能提高脂肪间质干细胞增生的速度，以于相同培养天数下，获取更为大量的细胞数目。再参图5D，为该基础培养基加上10%人类血清组与该基础培养基加上2%人类血清加上本发明的佐剂组的比较，由结果发现，虽该基础培养基加上2%人类血清加上本发明的佐剂组只有2%人类血清，但借由添加本发明的佐剂培养后，仍可使脂肪间质干细胞于前五天的培养下，细胞增生的速度仍与该基础培养基加上10%人类血清组相近似；由此得知，本发明的佐剂的添加，不仅可减少人类血清的使用量，同时亦能保有促进脂肪间质干细胞快速增生的功效。

2. 典型间叶干细胞的细胞表面抗原分析

本实验以流式细胞仪（FACSCalibur, Becton Dickinson）进行细胞表面抗原的测定。将分别培养于前述四组不同培养条件下的脂肪间质干细胞去附着并以磷酸缓冲液清洗后，回溶于适量的磷酸缓冲液中，分别对不同的抗原以相对应的免疫荧光一级抗体进行染色，包括CD13、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、β2微球蛋白（B2M）以及 HLA-DR等抗体（BectonDickinson）。避光于室温下染色15分钟后，加入适量磷酸缓冲液后上机分析，经流式细胞仪收集数据后，以流式细胞仪分析软件（FACSCalibur, Becton Dickinson）进行分析。其中负控制组为省略上述一级抗体的染色步骤。

2.1 实验结果

参见图6A，由结果可以发现前述四组不同培养条件下的脂肪间质干细胞，其细胞族群为CD13 +、CD34 - 、CD44 + 、CD73 + 、CD90 + 、CD105 +，为类似间质干细胞的细胞族群，亦即表示说，前述四组不同培养条件下的脂肪间质干细胞仍保有类似间质干细胞的表面抗原特征。其中，有添加人类血清的三组实验，其CD44及CD73的表现量高于该基础培养基加上10%胎牛血清组，此结果亦说明有添加人类血清培养的三组实验，其保有类似间质干细胞的表面抗原特征的效果较添加胎牛血清培养的效果来得更好。

3. 干细胞基因表现分析

本实验将分别培养于前述四组不同培养条件下所得的脂肪间质干细胞，以实时聚合酶链锁反应仪（Real-Time PCR System）来分析未分化干细胞的相关基因的表现。将培养出的细胞以磷酸缓冲液清洗后，收集在1.5 ml eppendorf中，加入1 ml TriZol（10296-010,Invitrogen）试剂，于室温放置五分钟，加入100 μl BCP（BP. 151,MRC）溶液，以Vortex混匀至成粉红色溶液后，室温放置15分钟，再以15,000 g离心15分钟在4℃。离心完后，eppendorf内会分三层，下层是红色层，中间一层薄薄的白色层，上层是透明层，将上层吸出放入新的1.5毫升离心管（eppendorf）中，吸取过程中要小心不要吸到另外两层。于新的离心管中加入0.5 毫升异丙醇（isopropanol），摇匀后，室温放置30分钟，之后再以15,000 g离心10分钟在4℃，将上清液抽出，不要吸到团块（pellet），加入1 毫升 75% 酒精（ethanol）清洗，再以15,000 g离心10分钟在4℃，抽掉酒精后，空气干燥10分钟，以含有抑制RNase（DEPC）的水回溶后即完成RNA萃取。吸取约10微克（μg） RNA，加入反转录试剂组（RT-for-PCR kit, Clontech），以聚合酶连锁反应器（PCR machine）完成反转录后加入聚合酶（GoTaq Green Master Mix, M7122, Promega）进行聚合酶链锁反应，P其反应的设定条件因不同引子（Primer）的不同Tm值而略有调整。分析跟干细胞相关未分化的相关基因，像是Nanog, SOX2, CXCR4, TERT等，本实验分析Nanog, SOX2, CXCR4, TERT和控制组β-actin 基因。分析各基因所使用的引子如下表所列：

3.1 实验结果

参见图6B，经由结果我们发现，有添加人类血清的三组实验（10%人类血清、10%人类血清+佐剂、2%人类血清+佐剂），其干细胞基因（Nanog, SOX2, CXCR4, TERT）的表现皆明显高于该基础培养基加上10%胎牛血清组，且同样可以观察到，该基础培养基加上2%人类血清加上本发明的佐剂组虽只有2%人类血清，但借由添加本发明的佐剂培养后，其仍可如添加10%人类血清培养般，保持上述干细胞基因的表现，因此可知，添加本发明的佐剂进行细胞培养，确实可减少人类血清的使用量。

4. 脂肪间质干细胞的分化

文献报导指出，脂肪间质干细胞具有分化成中胚层细胞的能力，像是脂肪和骨头细胞。本实验同如实验二将脂肪间质干细胞经四组不同培养条件下培养六天后，将其诱导分化成硬骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞，以确认经上述四组不同培养条件下培养六天后，是否仍具有干细胞多功能性分化能力。本发明中的诱导分化实验依据习知文献中已被普遍使用的干细胞诱导分化***（Kanda et al., 2011；Song et al., 2010），因非本案诉求重点因此不予赘述，其主要目的在于确认本发明中经上述四组不同培养条件下培养后，是否仍具有干细胞多功能性分化能力。

4.1 细胞的化学染色及分子标记分析

分化的硬骨细胞以碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, ALP）进行染色，该碱性磷酸酶为成熟骨母细胞分化的重要指标，而其染色方法是依照习知染色技术进行（Yoshimura et al., 2011），在此不再赘述；另再进行一习知的Von-kossa染色，以确认有磷酸钙的存在。分化的软骨细胞以阿尔辛蓝染色法（Alcian blue）来确认软骨组织中拥有的蛋白多醣（Proteoglycan）的存在（Song et al., 2010）。分化的脂肪细胞以油红O染色（Oil red O staining），以确认是否有脂质空泡（Lipid vacuoles）的存在（Kanda et al.,2011）。另本实验针对硬骨细胞所拥有的分子标记[核结合因子（cbfa1）、骨钙蛋白（Osteocalcin, OC）及第一型胶原蛋白（COL IA1）等基因]、软骨细胞所拥有的分子标记[软骨聚醣蛋白（ACAN）、第二型胶原蛋白（COL IIA1） 等基因]以及脂肪细胞的脂肪合成相关基因[过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、脂肪结合蛋白（aP2）]的表现，并以β-actin基因为控制组，进行实时聚合酶链锁反应（Real-Time PCR）来分析其相对表现量。分析各基因所使用的引子如下表所列：

4.2 实验结果

参见图7A，为碱性磷酸酶染色结果，比例尺为500 微米（μm），脂肪间质干细胞于前述四组不同培养条件下，经诱导分化为硬骨细胞，经碱性磷酸酶染色后，皆有呈现黑色结晶的部分，亦即代表碱性磷酸酶的存在，更说明了该四组，皆能使脂肪间质干细胞保有干细胞分化的能力；续参见图7B，为冯库萨（Von-kossa）染色结果，比例尺为500 微米（μm），可发现前述四组皆呈现有黑色或茶褐色的磷酸钙结晶，再次说明了该四组，皆能使脂肪间质干细胞保有干细胞分化的能力；再图7C，为硬骨细胞的分子标志表现分析结果，可发现在骨钙蛋白（OC）相对表现量中，该基础培养基加上10%人类血清加上本发明的佐剂组与该基础培养基加上2%人类血清加上本发明的佐剂组等二组，其硬骨细胞的分子标志表现皆比该基础培养基加上10%胎牛血清组与该基础培养基加上10%人类血清组明显提高，其中* P < 0.05,** P < 0.01, *** P < 0.005；尤其该基础培养基加上2%人类血清加上本发明的佐剂组，其cbfa1、OC及COL IA1三者相对表现量更是明显高于该基础培养基加上10%胎牛血清组。由此可知，添加本发明的佐剂加上人类血清进行脂肪间质干细胞培养，能保有干细胞原来的分化能力，且经诱导分化为硬骨细胞的效果更佳。

请参见图8A，为阿尔辛蓝染色结果，比例尺为500 微米（μm），可发现前述四组皆呈现出蓝色的蛋白多醣染色结果，尤其是该基础培养基加上2%人类血清加上本发明的佐剂组的蓝色蛋白多醣染色区域远超过其他三组。续参图8B，为软骨细胞的分子标记表现分析，可发现该基础培养基加上10%人类血清加上本发明的佐剂组与该基础培养基加上2%人类血清加上本发明的佐剂组在ACAN及COL IIA1 等基因的相对表现量上，皆明显高于该基础培养基加上10%胎牛血清组与该基础培养基加上10%人类血清组，其中* P < 0.05, ** P <0.01, *** P < 0.005；尤其该基础培养基加上2%人类血清加上本发明的佐剂组，其软骨细胞的分子标志表现更是明显提高许多。由此可知，添加本发明的佐剂加上人类血清进行脂肪间质干细胞培养，能保有干细胞原来的分化能力，且经诱导分化为软骨细胞的效果更佳。再参图8C，为油红O染色结果，比例尺为500 微米（μm），可发现前述四组皆呈现出红色的脂质空泡染色结果。续参见图8D，为脂肪合成相关基因PPARγ及aP2的相对表现量，其中* P <0.05, ** P < 0.01。可发现该基础培养基加上10%人类血清加上本发明的佐剂组，其PPARγ及aP2的相对表现量较该基础培养基加上10%胎牛血清组与该基础培养基加上10%人类血清组明显提高。由此可知，添加本发明的佐剂加上人类血清进行脂肪间质干细胞培养，能保有干细胞原来的分化能力，且经诱导分化为脂肪细胞的效果较佳。

5. 细胞因子数组分析与相对基因表现分析

本分析实验于脂肪间质干细胞的三种状态（10%人类血清培养前、10%人类血清培养及10%人类血清加上佐剂培养）下，分别取其培养基上清液利用市售包含41种人类细胞因子数组分析套组（Cat #AAH-GF-1, RayBiotech, Norcross, GA）进行分析，以观察脂肪间质干细胞于前述三种状态下，对其分泌细胞因子及生长因子的影响；前述数组分析套组的分析方法非本案诉求重点因此不予赘述，其详细内容可参RayBiotech公司所提供Cat #AAH-GF-1的说明书。另本实验亦将上述经四组不同培养条件下培养后的脂肪间质干细胞以如实验二的3.的分析方法针对特定生长因子如类胰岛素生长因子（IGF-1）、肝细胞生长因子（HGF）及表皮生长因子（EGF）等基因，以β-actin 基因为控制组，进行实时聚合酶链锁反应（Real-Time PCR）来分析其相对表现量。分析各基因所使用的引子如下表所列：

此外，本实验亦针对脂肪间质干细胞在下列三种培养条件如：基础培养基加上10%胎牛血清组、基础培养基加上10%胎牛血清（5%氧分压的低氧环境）组以及基础培养基加上10%胎牛血清加上本发明的佐剂组等三组培养下，分别取其培养基上清液进行人类细胞因子数组分析（Cat #AAH-GF-1, RayBiotech, Norcross, GA） ，以观察对脂肪间质干细胞分泌细胞因子及生长因子的影响。

5.1 实验结果

一并参图9A图及图9B，为细胞因子数组分析结果与细胞因子数组分析结果比较示意图，其中POS表示正控制组，NEG表示负控制组，* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P <0.005。由结果比较可发现，脂肪间质干细胞于添加本发明的佐剂培养后，于条件培养基中分泌有如下细胞因子及生长因子：FGF-2、EGF、FGF-4、FGF-6、FGF-7、HB-EGF、HGF、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFPB-4、IGFBP-6、IGF-I、IGF-I SR、IGF-II、M-CSF、M-CSF R、PDGF Rα、PDGF-Rβ、PDAF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、TGF-β3、VEGF、VEGF R2。其中图9B所示10%人类血清培养前与10%人类血清培养的比较图中呈向左下斜线的区块如：第二型纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF），血小板衍生生长因子（PDGF-AA、AB、BB）和血管内皮生长因子（VEGF R3）等，是呈现被细胞吸收利用的情形；而图中呈向右下斜线的区块如：肝细胞生长因子（HGF）、类胰岛素生长因子结合蛋白（IGFBP-1、IGFBP-4、IGFBP-6）、类胰岛素生长因子1（IGF-1），血管内皮生长因子（VEGF）等，是呈现由细胞分泌至培养基中的情形。再参图9C及图9D，为前述10%人类血清培养及10%人类血清加上佐剂培养结果比较的量化示意图，可发现血小板衍生生长因子（PDGF-AA、AB、BB）是持续呈现被细胞吸收利用的情形，而肝细胞生长因子（HGF）、类胰岛素生长因子结合蛋白（IGFBP-1）及血管内皮生长因子（VEGF）则不仅是持续呈现由细胞分泌至培养基中的情形，而且经10%人类血清加上佐剂培养的结果明显提高。由此可知，借由添加本发明的佐剂加上人类血清进行脂肪间质干细胞培养，具有提高某些生长因子如HGF、IGFBP-1及VEGF的分泌产生效果。

续参图9E，为脂肪间质干细胞经四组不同培养条件下培养后，其生长因子IGF-1、HGF及EGF的相对表现量结果，其中* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.005。由结果得知，有添加人类血清培养的三组（10%人类血清、10%人类血清+佐剂、2%人类血清+佐剂）其IGF-1、HGF及EGF的相对表现量皆较该基础培养基加上10%胎牛血清组明显提高，尤其以该基础培养基加上2%人类血清加上本发明的佐剂组的相对表现量最高。由此可知，添加本发明的佐剂加上人类血清进行脂肪间质干细胞培养后，可提高生长因子如IGF-1、HGF及EGF的相对表现量。

再请一并参阅图9F及图9G，为细胞因子数组分析结果图及上述细胞因子数组分析结果比较图，其中图9G中，各细胞因子区块中若显示有中央空白饼图样者，代表该基础培养基加上10%胎牛血清组的脂肪间质干细胞有分泌此细胞因子；同理，若显示有全黑饼图样者，代表该基础培养基加上10%胎牛血清（5%氧分压的低氧环境）组的脂肪间质干细胞有分泌此细胞因子；而显示有斜线饼图样者，代表该基础培养基加上10%胎牛血清加上本发明的佐剂组的脂肪间质干细胞有分泌此细胞因子或生长因子。由图9G可发现，脂肪间质干细胞培养于条件下，即会分泌bFGF、EGF、HB-EGF、HGF、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-6、IGF-II、M-CSF、M-CSF R、NT-4、PDGF Rβ、PIGF、TGF-β3、VEGF等细胞因子或生长因子。值得注意的是，虽该基础培养基加上10%胎牛血清（5%氧分压的低氧环境）组以及基础培养基加上10%胎牛血清加上本发明的佐剂组都可以多增加脂肪间质干细胞分泌的细胞激素种类，但是该基础培养基加上10%胎牛血清加上本发明的佐剂组所增加的种类及量皆更多，例如β-NGF、FGF-4、FGF-6、FGF-7、IGFBP-3、IGFBP-4、IGF-I、IGF-I SR、GCSF、GDNF、GM-CSF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、SCF、VEGF R2、VEGF R3、VEGF-D等细胞因子或生长因子。由此可知，添加本发明的佐剂进行脂肪间质干细胞的培养可较于低氧环境培养下，更增加脂肪间质干细胞所分泌的细胞因子或生长因子的种类及量。

综合上述结果说明了脂肪间质干细胞不论是培养于添加本发明的佐剂加上人类血清的基础培养基或是仅添加本发明的佐剂于含10%胎牛血清的基础培养基下，不仅皆可达到快速增生的效果，同时亦能获取脂肪间质干细胞培养期间所大量分泌的生长因子，其中又以培养于添加本发明的佐剂加上人类血清的基础培养基条件下为最佳培养条件；借此以作为后续用于制备促伤口愈合药物及用于制备促伤口愈合药物的用途，或是做为制备皮肤保养品及用于制备皮肤保养品的用途。

实验三： 脂肪间质干细胞微载体培养

在体外培养的人类间质干细胞多以贴附式（Anchorage-dependent cells）的培养方式进行，所以使用一种符合贴附式的培养***来产生大量且质量一致的细胞对于再生医学与组织工程的应用上是需要的。本实验利用搅拌式微载体培养反应器（Spinner Flasks,Bellco Glass, Inc., Vineland, NJ, USA ）进行脂肪间质干细胞培养。接种细胞入反应器前，先将前述培养反应器内部表面以硅胶（Sigmacote, Sigma, St. Louis, MO, USA）处理过；而所使用的微载体（CultiSpher-G；HyClone, Logan, UT, USA）则依照操作手册上的步骤依序秤重、加入水合之，以及使用灭菌釜15分钟121℃处理；于混入细胞前先移除多余磷酸盐缓冲溶液，再加入欲培养细胞细胞的培养液使的平衡约24小时。将脂肪间质干细胞加入含有预先平衡培养液及微载体共约50毫升的搅拌式培养反应器中，最初以间歇式的方式开启外加式电磁搅拌***，以每次25 r.p.m 30分钟后休息10至20分钟的频率转动2小时；于前述2小时后以25 r.p.m的转速开始培养，并每3天更换一次陪养液，每次更换约百分之50至70的培养液，并于更换前先停止搅拌约5分钟，使细胞与微载体可以落至反应器底部。其中微载体培养过程在37℃、湿度95%及5%二氧化碳分压的环境下培养7天，而前述培养基包含IMDM再加入10% 人类血清、2 毫摩尔浓度（mM）左旋麸酰胺酸以及本发明的佐剂所组成；而前述佐剂包含10 ng/mL FGF-2、2 毫摩尔浓度N-乙酰基-L-半胱氨酸以及0.2 毫摩尔浓度左旋抗坏血酸-2-磷酸盐。

为观察细胞在微载体上生长与分布情形，每天取出1毫升含有微载体的细胞液，并离心移除培养基且以磷酸缓冲溶液清洗一次；续以百分之十***固定液于室温固定10分钟后，移除固定液并以磷酸缓冲溶液清洗；再以5毫克/毫升绿色荧光双乙酸钠（FDA）与2毫克/毫升碘化丙啶（PI）分别染活细胞与死细胞，于室温避光5分钟后，将染剂移除并以磷酸缓冲溶液清洗三次，再将细胞与微载体平均分布于玻片上，使用荧光显微镜观察。

实验结果

请参见图10A与图10B，为脂肪间质干细胞培养于微载体7天，于光学显微镜下影像以及荧光显微镜下的影像，其中绿色荧光代表活细胞，红色荧光代表死细胞。由图10B的影像观察得知，脂肪间质干细胞较易贴附于微载体，并形成微组织状态。借此可知，将脂肪间质干细胞培养于一生物兼容性材料，如微载体，可以形成微组织状态，以作为后续再生医学或组织工程的用途。

综合上述实验结果可知，将本发明的人类间质干细胞体外快速增生佐剂加入包含人类间质干细胞的培养基中，于常氧环境（约21%氧分压）培养后，可如同于低氧环境（约5%氧分压）下培养般出现细胞快速***、细胞周期合成期（S phase）比例提高、减少老化及提高分化潜能等现象，且搭配使用人类血清取代胎牛血清进行培养时，其细胞增生速度更佳，且细胞分泌的生长因子量提高、种类增加，使本发明不仅可快速和有效率地扩增人类间质干细胞，且仍可保有干细胞多功能性的特征，用以达成人类间质干细胞的快速扩增及获取生长因子的功效。

上述实施例和图式并非限定本发明的产品形态和式样，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。

Claims (16)

1.一种人类间质干细胞体外快速增生培养基，其特征在于：包括人类间质干细胞体外快速增生佐剂及人类血清，前述人类间质干细胞体外快速增生佐剂包括一长效型抗坏血酸衍生物及一N-乙酰基-L-半胱氨酸的组合以及一第二型纤维母细胞生长因子。

2.如权利要求1所述的人类间质干细胞体外快速增生培养基，其特征在于：人类间质干细胞选自：脂肪间质干细胞、骨髓间质干细胞或脐带间质干细胞所构成群组之一。

3.如权利要求1所述的人类间质干细胞体外快速增生培养基，其特征在于：长效型抗坏血酸衍生物为一L-抗坏血酸-2-磷酸盐。

4.如权利要求1所述的人类间质干细胞体外快速增生培养基，其特征在于：第二型纤维母细胞生长因子使用浓度为1毫微克/毫升至20毫微克/毫升。

5.如权利要求1所述的人类间质干细胞体外快速增生培养基，其特征在于：前述人类间质干细胞体外快速增生佐剂借由抑制前述人类间质干细胞的细胞内细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物：p21及p27蛋白的表现，用以提高细胞周期蛋白依赖性激酶-2、细胞周期蛋白依赖性激酶-4及细胞***周期蛋白的表现。

6.一种体外快速扩增人类间质干细胞的方法，其特征在于：包括将权利要求1至5任一所述的佐剂加入包含人类血清及一人类间质干细胞的培养基中，以扩增前述人类间质干细胞，并获取实质未分化 的一人类间质干细胞。

7.如权利要求6所述的体外快速扩增人类间质干细胞的方法，其特征在于：前述人类血清的体积百分浓度为百分之2至百分之10。

8.如权利要求6或7所述的体外快速扩增人类间质干细胞的方法，其特征在于：更包括一冷冻保存前述扩增的人类间质干细胞步骤，用于更进一步的使用。

9.一种细胞库，其特征在于：包含由如权利要求8所述的体外快速扩增人类间质干细胞的方法所冷冻保存的扩增的人类间质干细胞。

10.如权利要求6或7所述的体外快速扩增人类间质干细胞的方法，其特征在于：进一步执行一萃取步骤以获得一人类间质干细胞的细胞萃取物。

11.如权利要求6或7所述的体外快速扩增人类间质干细胞的方法，其特征在于：进一步执行一诱导分化步骤，以获取一自前述人类间质干细胞所分化的细胞。

12.一种医药组合物，其特征在于：包含由如权利要求11所述的体外快速扩增人类间质干细胞的方法所获取实质未分化的一人类间质干细胞或一自前述人类间质干细胞所分化的细胞。

13.如权利要求11所述的体外快速扩增人类间质干细胞的方法，其特征在于：人类间质干细胞所分化的细胞，包括骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞之一。

14.一种体外快速扩增人类间质干细胞以获取生长因子的方法， 其特征在于：经权利要求6或7的方法培养后，以于前述培养基中获取一生长因子。

15.如权利要求14所述的体外快速扩增人类间质干细胞以获取生长因子的方法，其特征在于：生长因子包括：FGF-2、EGF、FGF-4、FGF-6、FGF-7、HB-EGF、HGF、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFPB-4、IGFBP-6、IGF-I、IGF-I SR、IGF-II、M-CSF、M-CSF R、PDGF Rα、PDGF-Rβ、PDAF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、TGF-β3、VEGF、VEGF R2。

16.如权利要求12所述的医药组合物，其特征在于：进一步结合一生物兼容性材料以应用于再生医学或组织工程。