CN104436306A - 一种细胞-凝胶材料复合微球及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞-凝胶材料复合微球及其制备方法和应用，属于生物医学材料领域。包括凝胶微球和分布在所述凝胶微球内部的细胞。所述制备方法为将凝胶材料-细胞混合液分散于油性溶液，经乳化和凝胶化处理，得到细胞-凝胶材料复合微球。所述复合微球中细胞装载率可控，细胞存活率高，体积收缩小，不易破碎，且营养物质和代谢产物传输能力良好。还可用于制备非匀质水凝胶，得到仿生度更高的材料。且制备方法简单，便于推广应用。

Description

一种细胞-凝胶材料复合微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种细胞-凝胶材料复合微球及其制备方法和应用。

技术背景

生物医用凝胶材料(如胶原等)能够营造与细胞外基质接近的环境，为细胞的黏附、生长和增殖提供空间，具有良好的生物相容性、可生物降解性，同时还表现出一定的生物学活性与功能，因此已经成为生物医学材料研究与应用中的重要材料，在科学研究与临床应用领域都表现出较高的价值。

现有的报道中，绝大多数胶原水凝胶是在毫米至厘米的尺寸范围内，以块状形式进行研究或应用。在这些研究和应用中，胶原基生物材料除了表现出良好的生物学性能以外，也暴露出力学性能差而导致材料破碎、通透性差而导致传质缓慢等缺陷；而对胶原材料进行化学交联等处理虽然能改进其力学性能，但是改性过程对装载细胞是极大的威胁。

发明内容

发明人通过对现有技术的综合分析发现现有技术中存在以下不足：

1.块状的水凝胶材料力学性能较差且不耐酶作用，在装载细胞后易发生破碎降解、体积剧烈收缩、内部细胞明显凋亡等现象，难以体现凝胶材料的作用与优势；

2.现有的凝胶微球及其技术，主要目的是装载药物或生物活性物质，通过交联处理实现药物或生物活性物质的传送与缓释，不能实现细胞的装载，不能体现凝胶微球在营养物质输送和代谢产物排放等方面的优势。

针对上述问题，本发明提供了提供细胞-凝胶材料复合微球，其制备过程简单且可以通过工艺参数的选择控制产品的性能，细胞的装载率和存活率都较高，具有广阔的应用前景。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种细胞-凝胶材料复合微球，包括凝胶微球和分布在所述凝胶微球内部的细胞。所述复合微球中细胞装载率可控，细胞存活率高，体积收缩小，不易破碎，且营养物质传输能力强。还可用于制备非匀质水凝胶，得到仿生度更高的材料。

作为可选方式，在上述细胞-凝胶材料复合微球中，所述凝胶微球为球形或接近球形，尺寸分布为30-1000μm。该尺寸的微球具有较大的比表面积，便于与周围环境接触响应，也有利于物质传输。

作为可选方式，将包载了不同细胞的复合微球混合在一起共同培养，可以构建多种细胞混合共培养体系。

本发明还提供了一种包载细胞的非匀质水凝胶，包括凝胶化的连续相和上述的细胞-凝胶材料复合微球，所述细胞-凝胶材料复合微球分布在所述凝胶化的连续相中。所述水凝胶是非匀质的，所述连续相和微球可以采用相同的凝胶材料，获得材料形态结构分布不均匀的非匀质材料；也可以采用不同的凝胶材料，采用不同的凝胶材料时可以仿生天然组织中不同部位的局部微环境组成与结构，获得材料组成与结构不均匀的非匀质材料；还可以根据需要在制备时对连续相进行改性处理，或采用经过不同改性处理的凝胶微球来制备所述非匀质水凝胶，可以获得材料性能(如力学性能、降解性能等)分布不均匀的非匀质材料。另外，采用微球和连续相配合的方式可以在水凝胶内部提供丰富的界面，一方面便于营养物质和代谢产物的传输，另一方面可以充分发挥同种细胞间的相互作用和不同细胞间的相互影响，促进细胞的生长、增殖并进一步分泌形成天然细胞外基质。

作为可选方式，在上述非匀质水凝胶中，在所述凝胶化的连续相***还包覆有至少一层凝胶化的连续相或者所述凝胶化的连续相作为凝胶单元又分布在另外一层凝胶化的连续相中。

作为可选方式，在上述非匀质水凝胶中，构成所述连续相和凝胶微球的材料为具有良好生物相容性的凝胶材料。采用良好生物相容性好的凝胶材料有利于细胞的黏附生长及组织的形成。

作为可选方式，在上述非匀质水凝胶中，所述凝胶材料的前体材料具有良好水溶性。便于在制备过程中乳化成球。

作为可选方式，在上述非匀质水凝胶中，构成所述连续相和凝胶微球的材料为环境敏感型凝胶材料。采用环境敏感型凝胶材料便于进行凝胶化处理。

作为可选方式，在上述非匀质水凝胶中，所述环境敏感性凝胶材料为温敏材料、光敏材料或者离子敏感材料中的至少一种。进一步的，所述温敏材料可以是胶原、聚异丙基丙烯酰胺及其衍生物等凝胶温度低于40℃的材料中的至少一种；所述光敏材料可以是甲基丙烯酸酐或马来酸酐改性的透明质酸衍生物、硫酸软骨素衍生物、普鲁兰多糖衍生物等水溶性光敏多糖材料中的至少一种，光引发剂可以是2-羟基-4’-(羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959)、1-羟基环己基苯基丙酮(I184)、2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮(I651)中的一种；所述离子敏感材料可以是海藻酸衍生物。

作为可选方式，在上述非匀质水凝胶中，包载两种或两种以上的细胞，可以形成多种细胞有限接触三维共培养体系。在该共培养体系中可以在所述连续相中装载一种细胞，将其余不同种类的细胞分别装载在不同的凝胶微球中(一个凝胶微球中装载同种细胞)；也可以将两种或两种以上的细胞分别装载在不同的凝胶微球中(一个凝胶微球中装载同种细胞)。在干细胞的定向诱导研究方面，研究人员已确认材料的三维结构以及力学强度等物理性能会影响干细胞的分化命运，同时也已经意识到不同种类细胞之间的相互作用是不能被忽略的，多种细胞的三维共培养是研究该问题的有效手段之一。现有的报道中，实现共培养的方式有两种，一种为直接接触，即将不同种类的细胞直接混合后再在支架材料上进行共培养，另一种为间接接触，即在不同支架上分别接种不同细胞后在同一个培养基环境中共培养，如transwell培养体系。同样的，从仿生角度看，不管是直接接触还是间接接触都存在一定的缺陷，不能模拟生理环境中不同细胞有局部接触但又不混杂的情况。通过本发明所述有限接触共培养体系，在同一个培养载体中将不同种类的细胞隔开，仅通过有限接触进行共培养，可以更好的模拟生理环境中不同细胞有局部接触但又不混杂的情况。该体系可用于研究不同种子细胞在有限接触的共培养体系中的相互影响以及对组织工程支架材料的作用，特别适用于研究干细胞诱导分化的条件与机制探讨。

作为可选方式，所述的胶原可以是动物皮、肌腱、尾腱为原料制备的胶原中的一种；所述的细胞可以是骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞等祖细胞，或软骨细胞、成纤维细胞、内皮细胞等成体细胞中的一种。

本发明还提供了一种所述细胞-凝胶材料复合微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备凝胶材料-细胞混合液；2)将所述凝胶材料-细胞混合液(水相)分散于油性溶液，经乳化和凝胶化处理，得到细胞-凝胶材料复合微球。

作为可选方式，在上述制备方法中，所述步骤1)具体为：将凝胶材料溶液pH调节至6.5-7.5，静置或离心去泡，得到中性凝胶材料溶液；将经计数的细胞由少量培养基或缓冲液配成细胞悬液，再加入到上述中性凝胶材料溶液中。所述的培养基可以是RPMI1640、MEM、αMEM中的一种，所述的缓冲液可以是生理盐水、PBS缓冲液、HEPES缓冲液中的一种。

作为可选方式，在上述制备方法中，所述步骤2)具体为：向油性溶液中加入体积百分浓度为0％～10％的表面活性剂，然后在机械搅拌作用下，加入凝胶材料-细胞混合液，使凝胶材料均匀分散于所述油性溶液中形成油包水的微球，搅拌两相混合液的同时选择相应的凝胶条件实现微球的凝胶化。所述凝胶材料溶液中凝胶材料的浓度优选为3-50mg/mL。

作为可选方式，在上述制备方法中，所述的油性溶液可以是甲基硅油、石蜡油等矿物油或橄榄油、蓖麻油、玉米油、菜籽油等植物油中的一种或其混合，优先选择粘度为20-200mPa·s的油性溶液。向油性溶液中加入0％-10％(v/v)的表面活性剂，所述的表面活性剂可以是Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、Span-20、Span-40、Span-60、Span-80、Triton X-100中的一种。

作为可选方式，在上述制备方法中，所述步骤2)中水相溶液(凝胶材料-细胞混合液)与油相溶液的比例为0.5％-40％，优选1％-5％，以100-1500rpm的速度持续搅拌1-30min，使水相分散成微球。

作为可选方式，在上述制备方法中，所述凝胶化处理可以是升温、光引发交联、酶催化交联等成胶方法中的至少一种。例如：温敏材料从低温升温至凝胶温度以上并保持10-45min；光敏材料用特定波长的紫外光照射10-360秒；离子敏感材料用滴加二价阳离子溶液，如氯化钙、氯化锌、氯化镁等实现成胶。

作为可选方式，在上述制备方法中，还包括洗涤分离步骤，通过洗涤分离步骤充分去除油相，保留。所述分离可以选用离心或过滤等常用的分离方式；所述洗涤步骤具体为将步骤2)中制得的细胞-凝胶材料复合微球在培养基或者含0％-0.1％Tween 80的缓冲液中分散、冲洗2-4次。所述的培养基可以是RPMI1640、MEM、αMEM中的一种，所述的缓冲液可以是生理盐水、PBS缓冲液、HEPES缓冲液中的一种。

本发明还提供了一种制备上述的非匀质水凝胶的方法，包括以下步骤：

(1)按照本发明所述方法制备细胞-凝胶材料复合微球；(2)将所述细胞-凝胶材料复合微球与凝胶材料构建成非匀质水凝胶。

作为可选方式，在上述制备方法中，所述步骤(2)具体为将所述凝胶微球分散于连续相溶液介质中或分散于经改性或经部分凝胶化处理的连续相介质中，再对上述混合体系进行凝胶化处理形成非匀质水凝胶。

作为可选方式，在上述制备方法中，在所述步骤(2)中在进行凝胶化处理前向混合溶液中加入细胞，混匀后再进行凝胶化处理，可以制得包载了细胞的非匀质水凝胶。作为可选，在加入细胞前可将混合溶液的pH值调节至6.5-7.5。加入细胞后的混合溶液中的细胞的密度优选为10³-10⁹个/mL。

作为可选方式，在上述制备方法中，向凝胶材料溶液中加入细胞的具体方式可以为：将凝胶材料溶液pH调节至6.5-7.5，静置或离心去泡，得到中性凝胶材料溶液；将经计数的细胞由少量培养基或缓冲液配成细胞悬液，再加入到上述中性凝胶材料溶液中。所述的培养基可以是RPMI1640、MEM、αMEM中的一种，所述的缓冲液可以是生理盐水、PBS缓冲液、HEPES缓冲液中的一种。

作为可选方式，在上述制备方法中，将制得的非匀质水凝胶分散于连续相溶液介质中或分散于经改性或经部分凝胶化处理的连续相介质中，再对上述混合体系进行凝胶化处理形成多层非匀质水凝胶。

本发明还提供了一种所述细胞-凝胶材料复合微球的应用，其特征在于，将其用于制作仿生组织修复材料或用于多种细胞共培养。

本发明还提供了一种所述的非匀质水凝胶的应用，其特征在于，将其用于制作仿生组织修复材料或用于组织工程或用作种子细胞的载体或用作多种细胞的有限接触共培养载体。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明的有益效果：

1、本发明所述的细胞-凝胶材料复合微球，制备方法简单，微球尺寸可控且分布较为集中，细胞装载率、存活率高；凝胶微球在保持胶原生物学性能的同时，具有良好的传质通透性，细胞在凝胶微球中不仅能很好的黏附、增殖，还可以保持旺盛的生物学能力，其分泌的细胞外基质可以缓解甚至完全抑制凝胶微球的收缩。

2、本发明所述的细胞-凝胶材料复合微球及非匀质水凝胶制备方法可以获得综合性能优良的水凝胶材料，可用于组织工程中种子细胞的载体，实现组织工程支架中种子细胞的局部高密度、梯度密度，或者多种种子细胞的共培养等目的，实现组织的修复与重建。

附图说明：

图1为本发明所述实施例3中装载软骨细胞的胶原微球的光镜照片；

图2为本发明所述实施例3中装载软骨细胞的胶原微球的尺寸及分布统计；

图3为本发明所述实施例3中装载软骨细胞的胶原微球体外培养1d的激光共聚焦图片；

图4为本发明所述实施例5中装载骨髓间充质干细胞的胶原微球的尺寸及分布统计；

图5为本发明所述实施例5中装载骨髓间充质干细胞的胶原微球体外培养3d、7d、14d和21d的激光共聚焦图片；

图6为本发明所述实施例5中装载骨髓间充质干细胞的透明质酸微球的尺寸及分布统计；

图7为本发明所述实施例9中的微球胶原水凝胶和块状胶原水凝胶中牛血清蛋白的释放曲线；

图8为本发明所述实施例10中装载软骨细胞的微球胶原水凝胶和块状胶原水凝胶体外培养3d、7d和14d的激光共聚焦图片；

图9为本发明所述非匀质水凝胶的制备方法的工艺流程图。

具体实施方式：

本发明的制备工艺流程为(如图9所示)：凝胶材料溶液调pH后与细胞悬液制成凝胶材料-细胞混合液，在油性溶液中分散后进行凝胶化处理，再将所得到的产物清洗处理，获得装载细胞的微球；微球再分散于温敏材料或光敏材料的连续相溶液中，凝胶化处理形成非匀质水凝胶。

其中，使用温敏材料时，细胞材料混合液需要在低温条件下进行混合；使用光敏材料时，细胞材料混合液中需要加入光引发剂；分散处理是在一定搅拌条件下，使细胞材料混合液分散于油性溶液中；持续搅拌分散一段时间后，进行凝胶化处理微球粗品；经反复清洗分离或者过滤分离后获得微球；将装载细胞的微球分散于温敏材料或光敏材料的连续相溶液中，进一步凝胶化构建成非匀质水凝胶。

以下通过实施例再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。以下实施例中所用原料均可以从市场上购得。

实施例1

(1)取200mL菜籽油，加入少量Tween-60，在冰浴条件下，利用磁力搅拌器以1500rpm的转速搅拌菜籽油，将1mL浓度为15mg/mL的胶原溶液缓缓滴加到菜籽油中连续搅拌20min，将上述水相-油相混合液升温至37℃，并始终保持搅拌10min，搅拌完成后，对混合液进行清洗和分离，去除油相，得到平均粒径约为30微米的胶原微球。

(2)将步骤(1)中制得的胶原微球分散于浓度为15mg/mL的胶原溶液中，将上述含微球的胶原溶液转移至模具，升温至37℃保持30min，即可获得胶原连续相包裹胶原微球的非匀质胶原水凝胶。将所得水凝胶剖开，在扫描电镜下可观察到材料内部微球与连续相之间具有大量界面。

实施例2

(1)取4mL橄榄油与6mL玉米油在800rpm的转速下搅拌混匀获得混合油相溶液，在搅拌条件下，将4mL含光引发剂I184的透明质酸(经马来酸酐改性的透明质酸)溶液(透明质酸浓度为3mg/mL)缓慢滴加到上述混合油相溶液中，连续搅拌30min。采用波长为365nm、光强为30mW/cm²的紫外光辐射360s引发聚合反应，使透明质酸微球凝胶化，并始终保持搅拌10min；对混合液进行清洗和分离，去除油相，得到平均粒径约为1000微米的透明质酸微球。

(2)将步骤(1)中制得的透明质酸微球分散于浓度为8mg/mL的经马来酸酐改性的透明质酸溶液中，将上述含微球的透明质酸溶液转移至模具，采用波长为365nm、光强为30mW/cm²的紫外光辐射360s引发聚合反应，即可获得透明质酸连续相包裹透明质酸微球的非匀质透明质酸水凝胶。

细胞黏附实验显示，实施例1与实施例2中所得的非匀质水凝胶具有良好的生物相容性和良好营养物质传输能力，细胞可在其表面很好的黏附、铺展、爬行和生长。

实施例3

按以下步骤制备装载软骨细胞的胶原微球：

(1)取浓度为10mg/mL的胶原溶液，在冰浴中用少量2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0左右后，稀释至胶原终浓度为4.5mg/mL；

(2)将上述胶原溶液于4℃静置2h，待气泡脱去后获得中性胶原溶液；

(3)将事先准备好的处于指数生长期的软骨细胞，计数并用MEM培养基配成细胞悬液，再将其加入到1mL上述中性胶原溶液中并分散均匀，使细胞密度为1×10⁶个/mL；

(4)选择粘度为50mPa·s的甲基硅油72mL，不加入表面活性剂；

(5)在冰浴条件下，利用磁力搅拌器以500rpm的转速搅拌甲基硅油，缓缓将上述软骨细胞胶原混合液滴加到甲基硅油中，连续搅拌20min；

(6)将上述水相-油相混合液升温至37℃，并始终保持搅拌30min；

(7)搅拌完成后，对混合液进行离心，再将上层液体倾倒掉；

(8)用pH 7.4的PBS缓冲液冲洗离心后的沉淀，再离心倾去上层液体，重复该清洗离心过程2次；

(9)最后离心得到的沉淀即为装载软骨细胞的胶原微球，将其分散于MEM培养基用于后续的培养。

分散于培养基的胶原微球用光学显微镜拍照后，用图像处理软件对其尺寸进行统计，光学照片如图1所示，统计结果如图2所示，可见胶原微球尺寸为202.1±55.7μm，且分布较为集中。装载软骨细胞的胶原微球培养1d后，取样进行激光共聚焦显微镜观察，结果如图3所示，可见细胞黏附、增殖良好。

实施例4

按以下步骤制备装载软骨细胞的胶原微球：

(1)取浓度为15mg/mL的胶原溶液，在冰浴中用少量1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0左右后，稀释至胶原终浓度为8.5mg/mL；

(2)将上述胶原溶液于4℃离心10min，取无气泡液体为中性胶原溶液；

(3)将事先准备好的处于指数生长期的骨髓间充质干细胞细胞，计数并用αMEM培养基配成细胞悬液，再将其加入到1mL上述中性胶原溶液中并分散均匀，使细胞密度为5×10⁷个/mL；

(4)选择粘度为100mPa·s的液体石蜡36mL，加入0.5％(v/v)Span-80，用磁力搅拌器以800rpm的转速搅拌获得油相溶液；

(5)在冰浴条件下，缓缓将上述骨髓间充质干细胞胶原混合液滴加到油相溶液中，连续搅拌30min；

(6)将上述水相-油相混合液升温至37℃，并始终保持搅拌15min；

(7)搅拌完成后，对混合液进行离心，将上层液体倾倒掉后将沉淀分散于αMEM培养基中；

(8)将上述含有胶原微球的αMEM培养基经100μm筛网过滤，并用50mL以上的培养基冲洗；

(9)最后得到的沉淀即为装载骨髓间充质干细胞的胶原微球，将其分散于αMEM培养基用于后续的培养。

分散于培养基的胶原微球用光学显微镜拍照后，用图像处理软件对其尺寸进行统计，结果如图4所示，可见胶原微球尺寸为194.0±85.2μm，且分布较为集中。装载骨髓间充质干细胞的胶原微球连续培养14d，并分别在培养3d、7d和14d时取样进行激光共聚焦显微镜观察，结果如图5所示，可见细胞黏附、增殖良好，且有明显的细胞外基质分泌。

实施例5

按以下步骤制备装载骨髓间充质干细胞的透明质酸微球：

(1)取适量用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸，用PBS缓冲液配制成浓度为20mg/mL的溶液；

(2)向上述溶液中加入光引发剂I2959，使其终浓度为0.1％；

(3)将事先准备好的处于指数生长期的骨髓间充质干细胞细胞，计数并用αMEM培养基配成细胞悬液，再将其加入到1mL上述透明质酸溶液中并分散均匀，使细胞密度为1×10⁷个/mL；

(4)选择粘度为80mPa·s的液体石蜡54mL，加入0.2％(v/v)Span-80，用磁力搅拌器以650rpm的转速搅拌获得油相溶液；

(5)在持续搅拌下，缓缓将上述骨髓间充质干细胞透明质酸混合液滴加到油相溶液中，连续搅拌35min；

(6)采用波长为365nm、光强为30mW/cm²的紫外光辐射60s引发聚合反应，使透明质酸微球凝胶化，并始终保持搅拌10min；

(7)搅拌完成后，对混合液进行离心，将上层液体倾倒掉后将沉淀分散于αMEM培养基中；

(8)将上述含有微球的αMEM培养基经100μm筛网过滤，并用50mL以上的培养基冲洗；

(9)最后得到的沉淀即为装载骨髓间充质干细胞的透明质酸微球。

分散于培养基的透明质酸微球用光学显微镜拍照后，用图像处理软件对其尺寸进行统计，结果如图6所示，可见透明质酸微球尺寸为144.2±53.4μm，且分布较为集中。

实施例6

按以下步骤制备非匀质胶原水凝胶：

(1)取浓度为10mg/mL的胶原溶液，在冰浴中用少量2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0后，稀释至胶原终浓度为6.0mg/mL；

(2)将上述胶原溶液于4℃离心10min，取无气泡液体为中性胶原溶液；

(3)将预先制备好的装载不同细胞或同种细胞不同密度的胶原微球(例如实施例1和实施例2)分散于上述中性胶原溶液中；

(4)将上述含微球的胶原溶液转移至模具，升温至37℃保持30min即可获得装载局部高密度细胞的非匀质胶原水凝胶。

实施例7

按以下步骤制备非匀质胶原-透明质酸水凝胶软骨细胞-骨髓间充质干细胞共有限接触培养体系：

(1)用pH为7.4的PBS缓冲液配制马来酸酐改性的透明质酸溶液，浓度为25mg/mL，加入光引发剂I2959至浓度为0.1％；

(2)将事先准备好的处于指数生长期的软骨细胞，计数并用MEM培养基配成细胞悬液，再将其加入到1mL上述透明质酸溶液中并分散均匀，使细胞密度为1×10⁶个/mL；

(3)将预先制备好的装载不同骨髓间充质干细胞密度的微球(例如实施例2的胶原微球和实施例3的透明质酸微球)分散于上述透明质酸溶液中；

(4)将上述含微球的透明质酸溶液转移至模具，采用波长365nm、光强为30mW/cm²的紫外光辐射90s，即可获得装载软骨细胞和骨髓间充质干细胞的有限接触共培养水凝胶体系。

实施例8

在实施例1-5中制备的凝胶微球中取至少两种，共同分散于连续相溶液介质中或共同分散于经改性或经部分凝胶化处理的连续相介质中，再对上述混合体系进行凝胶化处理，可获得连续相中同时包载多种凝胶微球的非匀质水凝胶。所述凝胶微球可以是有不同材料制成的，也可以包载不同的细胞，也可以具有不同的细胞包载密度。还可以在所述凝胶化处理之前向所述连续相溶液介质或共同分散于经改性或经部分凝胶化处理的连续相介质中加入细胞，获得连续相中包载了细胞的非匀质水凝胶。

在该非匀质水凝胶结构中部分水凝胶的改性处理步骤可以与细胞分开，从而避免改性处理过程对细胞的影响，从而可以获得性能更优异的细胞-水凝胶复合物。

细胞培养实验表明，在装载了多种细胞的非匀质水凝胶中，各种细胞在各自所处区域均能正常生长，状态良好。

实施例8

将上述实施例1、2、6、7、8中获得的非匀质水凝胶再分散于连续相溶液介质中或共同分散于经改性或经部分凝胶化处理的连续相介质中，再对上述混合体系进行凝胶化处理，可获得多层非匀质水凝胶。

实施例9

传质性能对比试验

以牛血清蛋白(BSA)为模拟物质，安装本发明实施例1所述的制备方法，在步骤(1)中的胶原溶液中加入BSA，制备出装载BSA的胶原微球水凝胶(非匀质水凝胶)，同时采用传统胶原水凝胶制备方法制备装载BSA的胶原块状水凝胶(BSA与胶原溶液充分混合后进行凝胶化处理得到)。两种方法均采用相同的胶原浓度、相同的凝胶化温度、装载相同浓度的BSA，得到的微球水凝胶和块状水凝胶分别浸泡在PBS缓冲液中，间隔若干时间取少量缓冲液检测其中的蛋白含量，并以此计算水凝胶中BSA的释放比例。

传质实验对比结果如图7所示，从中可以发现胶原微球中的BSA比块状水凝胶中的BSA释放的更快，表明微球水凝胶具有更好的传质效果，能在较短的时间内实现水凝胶内外物质浓度的平衡。

实施例10

软骨细胞体外培养对比试验

采用相同浓度的胶原溶液为原料，分别制备装载有相同密度软骨细胞的微球水凝胶和块状水凝胶，采用相同的体外细胞培养条件，分别在培养3d、7d和14d时对样品进行激光共聚焦显微镜观察。

软骨细胞体外培养对比试验结果如图8所示(上排为块状水凝胶，下排为微球水凝胶)，从中可以发现随着培养时间的延长，胶原微球水凝胶中软骨细胞的增殖更加明显，细胞形态和聚集状态都要比块状胶原水凝胶更好，表明胶原微球水凝胶更有利于软骨细胞的增殖、表型。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种细胞-凝胶材料复合微球，其特征在于，包括凝胶微球和分布在所述凝胶微球内部的细胞。

2.根据权利要求1所述的细胞-凝胶材料复合微球，其特征在于，所述凝胶微球为球形或接近球形，尺寸分布为30-1000微米。

3.根据权利要求1所述的细胞-凝胶材料复合微球，其特征在于，构成所述凝胶微球的材料为具有良好生物相容性的环境敏感型的凝胶材料。

4.根据权利要求3所述的细胞-凝胶材料复合微球，其特征在于，所述环境敏感性凝胶材料为温敏材料、光敏材料或者离子敏感材料中的至少一种。

5.一种包载细胞的非匀质水凝胶，其特征在于，包括凝胶化的连续相和如权利要求1所述的细胞-凝胶材料复合微球，所述细胞-凝胶材料复合微球分布在所述凝胶化的连续相中。

6.根据权利要求5所述的非匀质水凝胶，其特征在于，在所述凝胶化的连续相***还包覆有至少一层凝胶化的连续相或者所述凝胶化的连续相作为凝胶单元又分布在另外一层凝胶化的连续相中。

7.一种如权利要求1所述的细胞-凝胶材料复合微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）制备凝胶材料-细胞混合液；2）将所述凝胶材料-细胞混合液分散于油性溶液，经乳化和凝胶化处理，得到细胞-凝胶材料复合微球。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1）具体为：将凝胶材料溶液pH调节至6.5-7.5，静置或离心去泡，得到中性凝胶材料溶液；将经计数的细胞由少量培养基或缓冲液配成细胞悬液，再加入到上述中性凝胶材料溶液中。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2）具体为：向油性溶液中加入体积百分浓度为0%~10%的表面活性剂，然后在机械搅拌作用下，加入凝胶材料-细胞混合液，使凝胶材料均匀分散于所述油性溶液中形成油包水的微球，搅拌两相混合液的同时选择相应的凝胶条件实现微球的凝胶化。

10.一种权利要求1所述的细胞-凝胶材料复合微球的应用，其特征在于，将其用于制作仿生组织修复材料或用于多种细胞共培养。